Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare il test DTH trans vivo per monitorare le risposte specifiche dell'antigene sia pro che anti-infiammatorio in soggetti umani. In primo luogo, isolare le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue periferico del soggetto umano. Quindi mescolare il preparato PBMC con PBS.

Antigene di richiamo antigene test antigene più antigene di richiamo. Procedere con le misurazioni prem del footpad e iniettare le miscele preparate nei topi skid. I piedini ripetono le misurazioni 24 ore dopo. Tre.

I modelli definitivi delle risposte DTH sono possibili regolatori, non regolatori e sensibilizzati. Il test di ipersensibilità di tipo ritardato trans vivo può essere applicato per determinare parametri clinici come le risposte di reazione in cui la fonte dell'antigene sono le cellule del donatore trapiantato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi in vitro esistenti è che si possono facilmente rilevare sia le risposte pro-infiammatorie che quelle regolatorie agli antigeni, agli antigeni automatici o agli antigeni tumorali utilizzando un unico sistema di analisi.

Egon, un ricercatore del mio laboratorio, dimostrerà ora la procedura utilizzando sangue periferico umano fresco raccolto in provette di destrosio di citrato acido per evitare l'attivazione piastrinica. Isolare la PBMC utilizzando il terreno di separazione dei linfociti secondo i metodi standard. Lavare il preparato PBMC con PBS per rimuovere le piastrine contaminanti.

Se c'è una notevole contaminazione dei globuli rossi, eseguire la lisi dei globuli rossi utilizzando un tampone di lisi CK. Quindi eseguire altri due lavaggi con PBS Resus. Sospendere la PBMC nella PBS a una concentrazione di 10 milioni di PBMC per millilitro per l'antigene allo.

Iniziare con le BMC P, isolate dal sangue periferico del donatore utilizzando la procedura mostrata in precedenza. Poi risu. Sospendi le cellule del donatore in PBS a una concentrazione di 120 milioni di cellule per millilitro e aggiungi un micromolare di PMSF per prevenire la degradazione delle proteine.

Ora sonica la sospensione cellulare usando sette impulsi di un secondo con una sonda sonica da due millimetri. Utilizzando un emocitometro. Verificare la rottura di oltre il 90% delle cellule.

Quindi, centrifugare la miscela a 14.000 giri/min a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire con cautela il surnatante in una provetta a due blocchi di sicurezza e determinare la concentrazione proteica con metodi standard per ogni iniezione. Aliquotare sette volte 10 al sesto P BMC in due millilitri.

Le provette di bloccaggio sicuro pellettano le celle mediante centrifugazione. Innanzitutto, preparare la sospensione di controllo negativo di PBMC in 35 microlitri di PBS. Quindi, per il controllo positivo, aggiungere 25 microlitri di un antigene di richiamo, tetano, tossoide, difterite, tossoide e regolare il volume di iniezione a 35 microlitri con PBS.

Secondo il disegno sperimentale per la valutazione della risposta specifica del donatore, risospendere il pellet cellulare in 10 microlitri di antigene del donatore più 25 microlitri di PBS per un volume totale di 35 microlitri. Per valutare la regolazione antigene specifica sperimentale del donatore, sospendere il pellet cellulare in 35 microlitri aggiungendo 10 microlitri di antigene del donatore e 25 microlitri di antigene TT DT di richiamo. Dopo l'anestetizzazione, il mouse skid con fluoro posiziona un calibro caricato a molla al centro di un piedino con un bordo che tocca l'ultimo tappetino scorrevole del piede per fornire un punto di riferimento per mantenere coerente il sito di misurazione quando la lettura del misuratore si è stabilizzata.

Registrare lo spessore basale del cuscinetto per l'iniezione del plantare. Posizionare la siringa con l'ago rivolto verso le dita dei piedi e lo smusso rivolto verso l'alto. Ora iniziare le iniezioni sottocutanee di ciascuna sospensione cellulare nei cuscinetti posteriori del piede per il topo.

Numero uno, iniettare lentamente il cuscinetto del piede destro con la preparazione del controllo negativo. Quindi, iniettare il cuscinetto del piede sinistro con il controllo positivo di PBMC plus TT dt. Ora riporta il mouse nella sua gabbia per il topo.

Numero due, iniettare il cuscinetto destro con PBMC più all'antigene e il piede sinistro con PBMC più allo antigene più TT dt. Assicurarsi che non vi siano perdite circa 18-24 ore dopo l'iniezione. Anestetizzare ogni topo con fluoro e ripetere la misurazione del gonfiore del cuscinetto plantare.

Sottrarre lo spessore di ciascun cuscinetto del piede prima dell'iniezione dal valore post-iniezione per ottenere il valore di gonfiore del cuscinetto del piede. Quindi calcolare il rigonfiamento netto antigene-specifico sottraendo il valore di rigonfiamento del cuscinetto plantare di controllo dai valori di gonfiore del cuscinetto del piede ottenuti dai trattamenti. Verificare la lettura del controllo positivo una risposta del controllo positivo al richiamo dell'antigene TT DT maggiore o uguale a 25 volte 10 al meno quarto pollice oltre.

Affinché il test sia considerato valido, è necessaria una risposta di base al PBS. Successivamente, determinare l'inibizione delle risposte di richiamo in presenza di antigeni del donatore. Questo esperimento valuta i riceventi di trapianto renale per la risposta antigene specifica del donatore e per la regolazione.

Esistono tre modelli principali di ipersensibilità di tipo ritardato nei riceventi di trapianto, normativo, non regolatorio e sensibilizzato. Tutti i pazienti hanno risposto fortemente al controllo positivo dell'antigene di richiamo tt. Il paziente numero 62 mostra il pattern regolatorio caratterizzato da una debole risposta all'antigene del donatore e da una marcata soppressione legata al richiamo della risposta dell'antigene in presenza di antigene del donatore.

Questo è il modello che è stato trovato associato alla tolleranza allotrapianto d'organo. Il paziente numero 48 presenta un pattern non regolatorio, che ha la caratteristica di una risposta debole al donatore, ma nessuna soppressione collegata. Questo modello è stato frequentemente osservato in pazienti che assumevano farmaci immunosoppressori.

Il paziente numero otto presenta un pattern sensibilizzato al donatore, caratterizzato da un'elevata risposta all'antigene del donatore e dall'assenza di soppressione collegata. Questa risposta è associata al rigetto del trapianto. Negli studi di casi clinici, i BMC P di soggetti arruolati in uno studio osservazionale sono stati analizzati per la via indiretta specifica del donatore, l'effettore T e le risposte regolatorie T per valutare il ruolo della regolazione specifica del donatore nella tolleranza clinica.

Le risposte indirette dei tectori agli antigeni dei donatori rivelano uno spettro distinto tra i gruppi di arruolamento. Il gonfiore del cuscinetto del piede aumenta man mano che lo stato clinico del paziente passa da quelli tolleranti a quelli cronicamente rigetto. Qui, il saggio di soppressione collegata misura la via indiretta anti donatore della risposta regolatoria al T.

Questi dati mostrano una diminuzione delle risposte regolatorie nell'intervallo dai pazienti più tolleranti ai pazienti con rifiuto cronico intermedio a meno tollerante. Presi insieme. La regolazione immunitaria, misurata dal test DTH trans vivo, sembra essere un meccanismo importante per l'accettazione renale dell'allotrapianto.

Un'area promettente è l'applicazione del test TDTH nel monitoraggio dell'autoimmunità. Il nostro studio sul ruolo del collagene di tipo cinque nel processo patologico della sindrome da bronchiolite OBL ha rivelato che il più alto rischio relativo di sviluppo di BOS è stato osservato nei pazienti con una risposta positiva al collagene. Cinque pbmc da riceventi di trapianto di polmone, ma non da controlli sani o collagene.

Quattro sindrome del buon pascolo reattiva I pazienti dopo il trapianto renale erano spesso reattivi al collagene cinque. Il test TDTH può essere utilizzato anche per testare la reattività del pbmc nei pazienti oncologici agli antigeni specifici del tumore. Ad esempio, la presenza di cellule T regolatorie specifiche per la PAP nei pazienti con carcinoma prostatico può limitare la risposta alla vaccinazione con l'antigene PAP.

Il test TRANSVAAL DTH è un nuovo test diagnostico con applicazione clinica nella valutazione delle risposte immunitarie cellulo-mediate nei pazienti con trapianto di cancro e autoimmuni. È prezioso perché non è solo utile nel monitoraggio delle risposte di richiamo degli effettori t, ma può anche essere utilizzato per rilevare le risposte regolatorie t perché non si basa su una particolare misurazione delle citochine per rilevare l'effetto o le cellule T regolatorie. È molto flessibile e ampiamente applicabile.