Name: Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Scopri un saggio di soppressione umano in vitro per misurare la funzione delle cellule Treg e identificare squilibri immunitari in soggetti a rischio di diabete di tipo 1.

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Questo studio è stato supportato da Max McGee Nazionale delle Ricerche Centro Giovanile Diabetesat Medical College del Wisconsin e bambini Research Institute of Wisconsin. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta el&#39;analisi dei dati, o la preparazione del manoscritto.

1. Prima di impostare un test di soppressione, si ha la necessità di perline cappotto tosylactivated con anti-CD3 umano (clone UCHT1, 1μg/ml concentrazione finale) per la stimolazione delle cellule e poi verificare se le perle sono rivestiti in modo efficiente attraverso la creazione di un test in vitro proliferazione utilizzando umano cellule T <ol><li> Prendere 1 ml di M-450 perle tosylactivated dal flacone originale, mettere in stand magnetici e tenere premuto fino a quando tutte le perle hanno aderito al lato del tubo. Rimuovere il tubo di buffer mentre è ancora in stand magnetico. Prendete del tubo di supporto magnetico e aggiungere 1 ml di buffer1, posizionare il tubo in stand magnetico di nuovo e togliere il tubo buffer1 mentre è in stand magnetici; perline risospendere in 1 ml di buffer1 e aggiungere 40μl di anti-CD3 umano, agitare a 37 ° C per 15 minuti, aggiungere 0,1% w / v BSA e continuare agitazione per le prossime 16 ore. </li><li> Lavare le perline in buffer2 due volte per 5 minuti a 2-8 ° C e una volta in buffer3 per 5 minuti a 2-8 ° C con supporto magnetico, come spiegato sopra; rimuovere il buffer e risospendere le sfere in 1ml di buffer2, le perle sono 4x10 concentrazione 8 / ml finale e pronto per l'uso. </li><li> Aliquota 50.000 e 25.000 PBMC / e in triplice copia in una piastra da 96 pozzetti e aggiungere numero variabile di perle rivestite CD3 (4x10 8 perline / ml, CD3 1μg/ml, ad esempio 1, 2, 3, 4, 5 perle / cella ) al fine di determinare il numero ottimale di perle per cella. Dopo 72 ore di cultura, aggiungere 1μCi [3 H] timidina e continuare incubazione a 37 ° C per le prossime 16 ore. Celle di raccolta in lamiera raccolta Multisala (Millipore), aggiungere liquido di scintillazione e leggere i conteggi per minuto (cpm) / bene usando Top Conte NXT (Packard, CT). Utilizzare le perline / rapporto cellulare quando CPM sono superiori a 5000 ma inferiore a 15000 per evitare iperstimolazione Tregs, che potrebbe perdere la funzione soppressiva. Di solito, rapporto di 3 perle / delle cellule stimola sia responder e le cellule Treg in tutti i gruppi di soggetti testati finora 1-4. </li></ol> 2. Isolamento PBMC da sangue intero da donatori sani o da leukopacks umano o buffy-coat (BC) di solito tratto da volontari sani e disponibili gratuitamente presso Centri locali Trasfusionale (Figura 1) <ol><li> Diluire il BC (~ 50 ml) 1:6 con PBS (aggiungere 250 ml). Ora c'è 300ml volume totale. Lentamente strato 25ml di BC diluito in cima 15ml Ficoll-Paque PLUS aggiunto a tubi Falcon da 50 ml, senza disturbare gli strati. Centrifugare a 800xg (1400rpm in una centrifuga Sorvall con rotore oscillante SH-3000) per 30 minuti a 4 ° C, con freni spento. </li><li> Raccogliere accuratamente lo strato PBMC (fase intermedia) e trasferirlo in una nuova tubi Falcon da 50 ml. Lavare PBMC compilando i tubi fino a 50 ml con DPBS. Raccogliere due pellet cellulari in un tubo. Centrifugare a 400xg per 10 minuti a 4 ° C. Ripetere il lavaggio passo due volte, ogni volta che combina due pellet cellulari in un unico tubo. Unire tutti gli pellet cellulari in un unico tubo 50ml. </li><li> Conte PBMC mediante test di esclusione tripan blu. Effettuare una diluizione 1:10 in Tricloroetano aggiungendo 20μl di PBMC di 180μl di Tricloroetano macchia. Mescolare bene e prendere 20μl a contare in emocitometro immediatamente. Contare i numeri di tutte le cellule senza macchia e solo blu macchiato situati in due blocchi quadrati ciascuno contenente 16 quadrati più piccoli. Prendere la media di entrambi i numeri e moltiplicare per 10. Dividere questo numero per 100 per ottenere il numero di PBMC / ml. Percentuale di cellule vitali calcolare come [1 - (numero di cellule blu / numero di cellule totali) x100]. Procedere, se la vitalità è ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS pre-tipo di cellule T CD4 <ol><li> Prima di procedere, il trasferimento di 1ml di PBMC in un tubo nuovo, aggiungere 4 ml di media per preparare le cellule per irraggiamento con 5000rad-questi saranno cellule presentanti l'antigene (APC). </li><li> Centrifugare il resto delle celle a 250xg nel buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA per 10 minuti a 4 ° C. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml di tampone PBS/2mM EDTA/0.5% BSA. </li><li> Aggiungere 200μl di MACS microsfere anti-CD4 e incubare a 4 ° C per 20 minuti. </li><li> Lavare con l'aggiunta di 40 ml di tampone PBS/2mM EDTA/0.5% BSA e centrifugare a 250xg per 10min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere in 8ml di degassata, temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% buffer di BSA. </li><li> Filtro separato la sospensione cellulare con pre-filtri di separazione prima di caricarli su una colonna LS. </li><li> Dividere la sospensione cellulare e 4ml strato di ogni colonna LS oltre calibrato (con 3 ml di tampone deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA). Colonna LS è stato risolto nel separatore MidiMACS. Prima di sospensione cellulare si esaurisce, o rieseguire eluato o aggiungere 3 ml di temperatura ambiente deggassed PBS/2mM tampone EDTA/0.5% BSA e lasciare scorrere il buffer. Aggiungere più di buffer fino a quando non viene fuori chiara. </li><li> Pipettare 5 ml di buffer deggassed sulla colonna LS, rimuovere colonna LS dal separatore MidiMACS e posto in una nuova provetta sterile raccolta 15ml lasciar correre ~ 1,0 ml attraverso. Mettere lo stantuffo nella colonna e spingere lentamente il resto delil volume in uscita. </li><li> Fate lo stesso con entrambe le colonne LS e combinare le due frazioni CD4 +. Aggiungi fino a 50ml di PBS e contare le cellule. Rendimento atteso è fino a 5x10 8 cellule. Centrifugare a 400xg per 10 minuti e risospendere le cellule bene in 2 ml di buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA. </li></ol> 4. Fluorescente attivato cella Ordinamento (FACS), isolamento (Figura 2) <ol><li> Fai un cocktail di anticorpi marcatori CD per i seguenti marcatori superficie cellulare (tenere al riparo dalla luce): 20 ml di anti-umano CD8-FITC (clone RPA-T8), 20 ml di anti-umano CD14-FITC (clone M5E2; LPS recettore), 20 ml di anti-umano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR di tipo II) e 6 ml di anti-umano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα catena) e, in alternativa, aggiungere l'anti 40μl umani CD4-APCCy7 (clone RPA-T4). </li><li> Prendete 5μl dalla sospensione cellulare 2ml e macchia con 2μl di cocktail macchia, questo è un tubo per la determinazione della soglia (Fluorocromo Minus One-FMO) 5. </li><li> Aggiungere 50 ml di anti-umano CD25-PE (clone M-A251, IL-2Rα) al cocktail macchia, e aggiungere il cocktail di sospensione cellulare e incubare a 4 ° C 30 minuti. Lavare le cellule in tampone PBS, centrifugare a 400xg per 10 minuti e risospendere le cellule ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml. </li><li> Preparare le cellule senza macchia e cellule o perline colorate con solo fluorocromo da usare come controllo della compensazione per l'ordinamento delle cellule di FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ). </li><li> Acquisire le cellule nel tubo FMO che permetterà all'utente di impostare la soglia per l'ordinamento delle cellule T CD25 + (Figura 2a). Impostare un cancello intorno FITC-negativi cellule per escludere FITC cellule positive composto da monociti, macrofagi e tutti gli altri CD4 +-non-cellule T (Figura 2b). </li><li> In un grafico distinto, disegnare cancelli per CD25-, CD25low e CD25high cellule T-Tregs (top 1% delle cellule che esprimono il maggior numero di CD25) (Figura 2c). Sottoinsiemi di cellule mostrano tipicamente elevata purezza (figura 2d, 2e e 2f). </li><li> Centrifuga provette con celle a 400xg per 10 minuti e tenerli in ghiaccio fino placcatura. </li></ol> 5. Istituito colture cellulari in piastra da 96 pozzetti (schema allegato come Tabella 1) in 200μl/well <ol><li> 50μl aliquota di CD3 rivestite perle (1 mg / ml) calcolato da 3 perline / cella responder in un pozzo, risospesi in mezzi di comunicazione completa con il 10% pool di siero umano AB in U-bottom piastre a 96 pozzetti. (Ad esempio, per rendere i media 2ml con CD3 rivestita, prendere 7.5μl dal magazzino del CD3 rivestite perle-finale 4x10 concentrazione 8 / ml e diluire in 2 ml di media, ogni 50μl conterrà 75.000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluire APC irradiati concentrazione cellulare di 5x10 5 / ml e aggiungere 50μl (conterrà 2,5 x 10 4 cellule) in ciascun pozzetto con la stimolazione aggiunto in precedenza, tra cui pozzi etichettato come "Tregs solo", "APC solo" e "media solo" nella tabella 1. </li><li> Aggiungere 2,5 x 10 4 / pozzetto CD4CD25 o CD4CD25low cellule T in triplicato a seguito di progettazione nella tabella 1. </li><li> Aggiungi Tregs di co-culture (riga B, Tabella 1) nel rapporto 1:10 (2.500 cellule Treg) e di pozzi etichettati come "Tregs solo" e incubare la piastra a 37 ° C in CO 2 incubatore al 5% di CO 2 , satura di umidità per 72 ore. </li><li> Pulse pozzetti con 1μCi [3 H] timidina e continuare l'incubazione a 37 ° C per la prossima 16 ore. </li></ol> 6. La raccolta e il conteggio <ol><li> Celle di raccolta sul piatto raccolta multischermo con Packard filtermate mietitrice o sistema alternativo. </li><li> Aggiungere liquido di scintillazione (Microscint 20), la raccolta di copertura piatto con coperchio in plastica trasparente, in preparazione per la fase finale. </li><li> Leggi conteggi per minuto (cpm) / bene usando Top Conte NXT (Packard, CT) o un sistema alternativo. </li></ol> 7. Percentuale di calcolo di soppressione <ol><li> Le cellule sono state coltivate in triplicato, medio è calcolato per ogni condizione. Se il coefficiente di variazione è&gt; 30%, il valore anomalo è eliminato e solo cpm da due pozzi sono nella media. Percentuale di repressione si ottiene calcolando [(sc) / s] x 100%, dove s = cpm in singola cultura e c = cpm in co-coltura. </li><li> Come ingenuo (CD25-) e in vivo attivato (CD25low) cellule T effettrici sono placcati come responder cellule T, la differenza nella capacità di Tregs di sopprimere ciascuno di questi sottoinsiemi è catturato e usato come indicatore prognostico potenziale funzionale sulla base del presupposto che le cellule attivate sono più difficili da sopprimere. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Grande variabilità nei metodi utilizzati e dei risultati derivanti da test in vitro soppressione umano ci hanno spinto a effettuare uno studio completo delle condizioni che influenzano l'analisi 1. Abbiamo sviluppato un test che mette alla prova non solo la funzione Treg, ma anche la loro purezza, considerando il basso rapporto tra Tregs: Teffs (1:10), che abbiamo stabilito in precedenza 6. Inoltre, Tregs differiscono in thEIR capacità di sopprimere con successo ingenuo e in vivo-cellule T attivate, anche in soggetti sani, come mostrato nella Figura 3 e nei nostri studi precedenti 2,4, che diventa più evidente se l'equilibrio immunitario è compromesso, come nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1 . Il test ha funzionato molto bene nello studio dove abbiamo confrontato funzione soppressiva del naturale (nTregs), inducibile (iTregs) e in vitro nTregs espanso, che ci permette di confrontare tra loro funzione di controllo sani, di recente insorgenza (RO) diabete di tipo 1 e di vecchia data (LS ) dei soggetti diabete di tipo 1. Abbiamo concluso che i soggetti RO diabete di tipo 1 ha una migliore capacità di generare funzionale sia iTregs e nTregs ampliato rispetto ai soggetti di controllo LS T1D e sano 7. Pertanto, questo test può essere utilizzato come un ottimo strumento per il riconoscimento di entrambi uno stato precoce e tardivo di squilibrio del sistema immunitario. Schema 1 Rappresentazione schematica delle fasi coinvolte nel test in vitro soppressione <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fasi del test in vitro soppressione presentata con foto <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Strategia di gating in cella di isolamento FACS. a) CD25 soglia + è stata regolata secondo Fluorocromo Minus One (FMO), b) le cellule sono state gated come FITC-negativi, c) FITC-negativi cellule sono state ulteriormente gated e raccolto come CD + CD25-, CD + CD25low e CD + CD25high ( Tregs) dimostrato con percentuali, d), FACS ordinati Tregs dopo l'ordinamento, e), FACS ordinati CD + CD25low dopo l'ordinamento, ed f) FACS ordinati CD4 + CD25-cellule T dopo l'ordinamento <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. I risultati rappresentativi di soggetti sani a) i risultati rappresentante di conteggi al minuto (cpm) dei soggetti sani presenta come singole culture per tutti i sottoinsiemi di cellule coinvolte (ingenuo-CD25-, in vivo attivato-CD25low, cellule presentanti l'antigene-APC e cellule T regolatorie-Treg), così come co-colture di cellule T responder (CD25-o CD25low) e Tregs. b) Percentuale di soppressione di ogni CD25-e CD25low responder cellule T autologhe da Tregs è presentato per i soggetti sani di controllo (n = 4). Soppressione è stato calcolato come [(sc) / s] x 100%, dove s = cpm in singola cultura e c = cpm in co-coltura. Anche se lieve differenza nella capacità di Tregs per sopprimere le cellule T responder è stato notato, non era significativa (paired t-test p = 0,08). C) Presentato sono cpm di soggetti a rischio per ogni singola cultura, tra CD25 e CD25low come responder cellule T e APC e Tregs, e co-culture in cui è seminato ogni cella risponditore T sottoinsieme con Tregs (CD25-/Tregs e CD25low/Tregs). d) Percentuale di soppressione di ogni CD25-e CD25low responder cellule T autologhe da Tregs è presentato per i soggetti a rischio (n = 4). La differenza nella capacità di Tregs per sopprimere CD25-versus CD25low responder cellule T è stata significativa (paired t-test p = 0,04). Tabella 1. Schematica messa a punto di test in vitro soppressione <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> mezzi di comunicazione solo </td><td> mezzi di comunicazione solo </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs solo </td><td> APC solo </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Essendo l&#39;unica caratteristica unica di Tregs, la funzione di soppressione dovrebbero essere testati in modo affidabile e uniformemente tra soggetti nelle diverse fasi di sviluppo della malattia all&#39;interno della stessa e tra studi differenti. Offriamo i dettagli del test di soppressione sviluppato nel nostro laboratorio come il nostro contributo alla standardizzazione di questo test. Nel nostro studio di ottimizzazione ampio, abbiamo determinato che la stimolazione delle cellule T con anti-CD3 umano rivestite p...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o strumento </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Tricloroetano </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microsfere </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pre-separazione filtri </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS colonna </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD25-PE (clone M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD8-FITC (clone RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD14-FITC (clone M5E2; recettore LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR di tipo II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα catena) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 umano </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Fatto in casa </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Fatto in casa </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0,1% di BSA pH7.4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Fatto in casa </td><td></td><td> 0,2 M Tris/0.1% BSA pH8.5 </td></tr><tr><td> Completo RPMI dei media </td><td> Fatto in casa </td><td></td><td> RPMI 1640 i media 2 mM L-glutammina 5 HEPES mM 100 U / mg / ml Peni / strept 0,5 mM di piruvato di sodio </td></tr><tr><td> [3 H] timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> pool di siero umano AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Raccolta piastra multischermo </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

umano in vitro</emsoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno stato precoce di squilibrio immunitario

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Cellule T regolatorie (Tregs) sono mediatori critici della tolleranza immunitaria di auto-antigeni. Inoltre, essi sono regolatori cruciali della risposta immunitaria in seguito ad un infezione. Nonostante gli sforzi per identificare marcatori unica superficie sulla Tregs, l&#39;unica caratteristica unica è la loro capacità di sopprimere la proliferazione e la funzione delle cellule T effettrici. Mentre è chiaro che solo saggi in vitro possono essere utilizzati nella valutazione funzione umana Treg, questo diventa problematica in sede di valutazione dei risultati di studi trasversali in cui le cellule sane e cellule isolate da pazienti con malattie autoimmuni (come il diabete di tipo 1, diabete di tipo 1) è necessario da confrontare. C&#39;è una grande variabilità tra i laboratori del numero e del tipo di risponditore cellule T, la natura e la forza della stimolazione, Treg: rapporti responder e il numero e il tipo di cellule presentanti l&#39;antigene (APC) utilizzati in test di soppressione umani in vitro. Questa variabilità rende il confronto tra studi di misurazione funzione Treg difficile. Il campo Treg ha bisogno di un test standardizzato di soppressione che funzionano bene con entrambi i soggetti sani e quelli con malattie autoimmuni. Abbiamo sviluppato un test in vitro di soppressione che mostra poca variabilità intra-saggio nella stimolazione delle cellule T isolate da volontari sani rispetto ai soggetti con sottostante distruzione autoimmune delle cellule β pancreatiche. L&#39;obiettivo principale di questo pezzo è quello di descrivere un test di soppressione umani in vitro che permette il confronto tra gruppi di soggetti diversi. Inoltre, questo saggio ha il potenziale per delineare una piccola perdita in nTreg funzione e anticipare ulteriormente la perdita per il futuro, individuando così i soggetti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia immunomodulante preventiva 1. Di seguito, forniamo la descrizione accurata delle fasi di questa procedura. Speriamo di contribuire alla standardizzazione dei test in vitro soppressione utilizzato per misurare la funzione Treg. Inoltre, offriamo questa analisi come strumento per riconoscere uno stato iniziale di squilibrio immunitario e un potenziale biomarcatore funzionale per diabete di tipo 1.

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un ottimizzato<em&gt; In vitro</em&gt; Test in grado di identificare squilibrio immunitario nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Le cellule T regolatorie (Treg) sono mediatori critici della tolleranza immunitaria verso gli autoantigeni. Inoltre, rappresentano regolatori cruciali della risposta immunitaria...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un saggio di soppressione umano in vitro per misurare la funzione delle cellule Treg e potenzialmente prevedere future perdite della loro funzionalità. Questo viene ottenuto preparando e testando prima delle microsfere codificate, che verranno utilizzate come stimolatori cellulari. Il secondo passaggio consiste nell'isolare cellule T naive CD4 positive CD25 negative, cellule T CD4 positive CD25 basse attivate in vivo e cellule T regolatorie CD4 positive CD25 alte, da irradiare PP BMC da utilizzare come cellule presentanti l'antigene o APC.Successivamente, vengono allestite colture singole di linfociti T naïve o attivati come cellule risponditrici con le BMC provenienti da P come APC, oppure colture co, nelle stesse condizioni, ma aggiungendo le Treg in un rapporto di uno a dieci. L'ultimo passaggio consiste nel raccogliere le cellule e misurare la loro proliferazione mediante incorporazione di timidina triziata. I risultati finali ottenuti possono dimostrare differenze nella soppressione delle risposte dei linfociti T naïve rispetto a quelle dei linfociti T attivati in vivo.Il mio nome è Jeff Woodcliff. Le cellule T regolatorie non esprimono marcatori unici sulla superficie cellulare. Pertanto, per misurare in modo affidabile la loro funzione, devono essere isolate utilizzando tecniche che offrono la migliore separazione.Il principale vantaggio dell'utilizzo del sorting cellulare attivato da fluorescenza rispetto ad altri metodi come l'isolamento max, è che fax offre popolazioni cellulari pure che possono essere ottenute. La funzione cellulare può quindi essere testata in modo affidabile in saggi di soppressione in vitro come dimostrato qui. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione delle treg in soggetti sani e in relazione al diabete di tipo uno, può essere applicato anche ad altre malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide umana, il lupus eritematoso sistemico, l'eritema multiforme, la sclerosi multipla e altre. Per rivestire le microsferette attivate da taal con anti-CD3 umano.Aggiungere un millilitro delle perle attivate M four 50 prelevato dal flacone originale in un tubo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo su un supporto magnetico finché tutte le perle non si saranno attaccate alla parete del tubo. Rimuovere quindi il buffer delle perle asportandolo con una pipetta mentre il tubo è ancora sul supporto magnetico. Successivamente, togliere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro del buffer uno.Posizionare nuovamente il tubo sul supporto magnetico più volte. Rimuovere il tampone mentre il tubo si trova sul supporto magnetico. Risospendere, sospendere nuovamente le perle in un millilitro di tampone ancora una volta.Questa volta aggiungere anche 40 microlitri di anti-CD umano tre. Agitare le perle e l'anticorpo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi aggiungere BSA allo 0,1% peso/volume e continuare ad agitare per le successive 16 ore.Successivamente, lavare le perle due volte con il buffer due, incubando le perle in un millilitro di buffer due per cinque minuti a due-otto gradi Celsius, quindi rimuovendo il buffer mentre il tubo è nel supporto magnetico. Quindi lavare nuovamente le perle una volta in più nelle stesse condizioni sterili.Questa volta, utilizzando un millilitro di buffer tre, testare l'efficienza del rivestimento con anticorpo aggiungendo un numero variabile di microsferette rivestite con CD tre per cellula, al fine di determinare il rapporto ottimale, seminando 50.020-5.000 PBMC per pozzetto in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Dopo 72 ore di coltura a 37 gradi Celsius, aggiungere un microcurie di timidina tritiata e proseguire l'incubazione per le successive 16 ore. Raccogliere le cellule in una piastra per il raccolto multiplo o equivalente.Aggiungere il liquido scintillante e leggere i conteggi al minuto o CPM per pozzetto. Utilizzando un contatore scintillante top count N XT o equivalente, determinare il rapporto tra microsferette e cellule usando quello che fornisce un CPM costantemente superiore a 5.000, ma inferiore a 15.000, come osservato nella nostra esperienza. Un rapporto di tre microsferette per cellula di solito garantisce la stimolazione ottimale sia per le cellule risponditrici che per le cellule Treg in tutti i soggetti umani testati.Riempire un tubo conico da 50 millilitri con 15 millilitri di fal plus. Eseguire quindi una diluizione uno a sei di 50 millilitri di buffy coat aggiungendo 250 millilitri di PBS al tubo del sangue. Stratificare lentamente 25 millilitri del buffy coat diluito sulla sommità del fial pack senza disturbare gli strati.Centrifugare a 800 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Con la frenata disattivata, raccogliere con attenzione lo strato di PBMC, che costituisce la fase intermedia bianca tra il fial e il buffer. Se necessario, raschiare le cellule dalla parete del tubo.Attendere alcuni minuti e raccoglierli nuovamente dalla fase intermedia. Trasferire le cellule in nuove provette da 50 millilitri e lavarle riempiendo le provette con il pellet di PBS. I PBMCs.Ripetere il passaggio di lavaggio due volte ogni volta. Combinare due pellet cellulari in un'unica provetta e, in definitiva, unire tutti i pellet cellulari in un'unica provetta da 50 millilitri. Quindi utilizzare 20 microlitri delle cellule sospese per determinare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu di trian.Testare la generazione di APC trasferendo un millilitro di PBMC vitali in un nuovo tubo. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo e irradiare le cellule con 5.000 rad, quindi aggiungere tampone PBS al tubo contenente il resto dei PBMC. Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule a 250 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in quattro millilitri della stessa miscela.Quindi aggiungere 200 microlitri di microsfere Max anti-CD4 ai PBMC e incubare la miscela di cellule e microsfere a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 40 millilitri di tampone PBS, quindi centrifugare per formare il pellet cellulare. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in otto millilitri di tampone PBS desgasato a temperatura ambiente.Successivamente, utilizzare filtri di separazione pres per filtrare e separare la sospensione cellulare. Quindi dividere il PBM CS in due provette da 15 millilitri. Aggiungere quattro millilitri dei P BMCs in ciascuna provetta.Aggiungere saldamente due colonne a un separatore minimax e posizionare dei tubi di raccolta al di sotto di ciascuna colonna. Quindi aggiungere tre millilitri di tampone PBS DGAs in ciascuna colonna; quando non rimane più tampone, stratificare l'intera soluzione cellulare di quattro millilitri proveniente da ciascun tubo sopra le colonne prima che la sospensione cellulare finisca completamente. Aggiungere tre millilitri di tampone PBS DGAs a temperatura ambiente in ciascuna colonna e lasciare che il tampone scorra nei tubi di raccolta.Aggiungere altro buffer fino a quando non risulta limpido. Pipettare altri cinque millilitri di buffer DGA sulla colonna LS, quindi rimuovere le colonne LS dal separatore Minimax. Posizionare le colonne in nuove provette sterili da 50 millilitri.Lasciare fuoriuscire mezzo millilitro, quindi spingere lentamente il resto del volume, pari a circa quattro millilitri. Unire ora le due frazioni CD4 positive. Aggiungere quindi fino a 50 millilitri di PBS nel tubo e contare le cellule dopo aver centrifugato a 400 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Risospendere le cellule in due millilitri di tampone PBS. Combinare gli anticorpi da utilizzare per la colorazione dei marcatori in un unico tubo: anti-CD14, anti-CD32, anti-CD116 e, opzionalmente, anti-CD4. Prelevare un’aliquota della miscela per la colorazione del tubo privo di fluorocromo.Preparare il tubo FMO trasferendo cinque microlitri di sospensione cellulare per millilitro del tubo in un tubo FACS e colorare le cellule con due microlitri della miscela di anticorpi precedentemente preparata. Successivamente, aggiungere cellule non colorate e microsferette rivestite con IgG murina da colorare con un singolo fluorocromo in nuovi tubi FACS individuali da utilizzare come controlli di compensazione per l'ordinamento cellulare. Quindi aggiungere 50 microlitri di anti-CD25 umano PE alla miscela e aggiungere la miscela al resto della sospensione cellulare.Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione delle cellule con il cocktail di anticorpi, aggiungere il buffer PBS alle cellule e quindi centrifugare per ottenere il pellet. Sospendere il pellet in buffer PBS a una concentrazione di 10⁷ cellule per millilitro.Utilizzare il tubo FMO per impostare la soglia di selezione delle cellule T positive per CD25. Utilizzando questa strategia di gating, impostare innanzitutto un gate intorno alle cellule negative per Fite al fine di escludere le cellule positive per Fitz, che comprendono monociti, macrofagi e tutte le altre cellule non T positive per CD4, come mostrato in questa figura. In un grafico separato, tracciare i gate per le cellule T negative per CD25 e con bassa espressione di CD25 e per le cellule Treg con alta espressione di CD25, come illustrato in questa figura.Dopo il flusso, dopo aver ordinato i sottoinsiemi cellulari, centrifugare i tubi di raccolta e quindi mantenere le cellule T sul ghiaccio fino al loro posizionamento in piastra. Etichettare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U come indicato nella tabella. Sospendere un’aliquota di 50 microlitri di microsferette rivestite con CD3, calcolata in modo da ottenere una concentrazione di tre microsferette per cellula risponditrice per pozzetto, in mezzo completo con il 10% di siero umano AB poolato nella piastra a 96 pozzetti, quindi diluire le APC precedentemente irradiate nel mezzo fino a una concentrazione di cinque per 10 alla quinta cellule per millilitro.Aggiungere 50 microlitri di cellule nella piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 2,5 × 10⁴ cellule T CD4 positive CD25 negative o CD4 positive CD25 basse per pozzetto in triplicato. Aggiungere le cellule Treg nella riga B e nei pozzetti etichettati come "solo Treg" della coltura co-coltivata, in un rapporto di 1 a 10 come mostrato qui. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C in un incubatore con 5% CO₂ e umidità satura per 72 ore. Successivamente, stimolare le cellule con un microcurie di timidina triziata e quindi proseguire l'incubazione a 37 °C per le successive 16 ore dopo che la timidina è stata incorporata nelle ultime ore della co-coltura.Utilizzare un raccoglitore a filtro per raccogliere le cellule su una piastra di raccolta multi-screen. Quindi coprire la piastra di raccolta con un coperchio di plastica trasparente precedentemente riempito con un liquido scintillatore. Infine, leggere i CPM per pozzetto.Utilizzando un contatore a scintillazione, i sottoinsiemi di linfociti T possono essere isolati con elevata purezza mediante questo sistema, come mostrato nella seguente serie di diagrammi a dispersione: i linfociti T CD4 positivi CD25 negativi sono mostrati qui nel quadrante inferiore. Nella figura successiva, si possono osservare linfociti T CD4 positivi CD25 bassi altamente purificati. Una popolazione pura di linfociti T CD4 positivi separati tramite citometria a flusso.Le cellule Treg CD25 high sono mostrate nel controllo del gate superiore. Coltivi cellulari singoli di APC e Treg provenienti da soggetti sani hanno mostrato una proliferazione minima o nulla rispetto al fondo, misurata mediante incorporazione di timidina, mentre le cellule T naive CD25 negative e le cellule T CD25 low attivate in vivo hanno mostrato una marcata proliferazione, che viene soppressa quando questi tipi di cellule risponditrici sono coltivati in co-coltura con cellule Treg. Sebbene siano state osservate lievi differenze nella capacità delle Treg di sopprimere le cellule risponditrici naive CD25 negative e le cellule T CD25 low attivate in vivo.Non era un controllo significativo. Coltivure di singolo tipo cellulare di APC e Treg da soggetti a rischio hanno mostrato una proliferazione minima o nulla rispetto al valore di fondo, misurata mediante incorporazione di timidina. Al contrario, cellule T naive CD25 negative e cellule T CD25 low attivate in vivo hanno mostrato livelli di proliferazione inferiori rispetto ai controlli sani.I linfociti T risponditori sono stati ulteriormente soppressi dai treg e dalle colture co, poiché il saggio genera risultati affidabili. Possiamo inoltre concludere che valori bassi di CPM indicano potenziali difetti nella trasduzione del segnale, che dovrebbero essere ulteriormente indagati in un tipo diverso di studio. La differenza nella capacità dei treg di sopprimere i linfociti T risponditori CD25 negativi rispetto ai linfociti T risponditori CD25 bassi nei soggetti a rischio, tuttavia, era significativa.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come collegare in modo fluido tutti i passaggi necessari per un test funzionale affidabile e riproducibile per la presenza di Treg in soggetti sani e in soggetti con sistemi immunitari compromessi. Ad esempio, in soggetti con diabete di tipo uno.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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