Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un test di soppressione umana in vitro per misurare la funzione delle treg e per anticipare potenzialmente la futura perdita della loro funzione. Ciò si ottiene preparando e testando prima le perle codificate, che verranno utilizzate come stimolatori cellulari. Il secondo passo consiste nell'isolare quattro cellule T C positive CD, 25 negative CD attivate in vivo, quattro cellule T basse CD 25 e CD regolatorie, quattro cellule T alte CD 25 positive per irradiare PP BMC da utilizzare come cellule presentanti l'antigene o APC.

Successivamente, singole colture sono impostate su cellule T naive o attivate come responder con BMC P come APC o cocolture nelle stesse condizioni, ma con treg aggiunte in un rapporto di uno a 10. Il passaggio finale consiste nel raccogliere le cellule e misurarne la proliferazione mediante trizio. I risultati ottenuti dall'incorporazione della timidina possono dimostrare differenze nella soppressione delle risposte delle cellule T naive rispetto a quelle attivate in vivo.

Mi chiamo Jeff Woodcliff. Le cellule T regolatorie non esprimono marcatori univoci sulla superficie cellulare. Pertanto, per misurare in modo affidabile la loro funzione, devono essere isolati utilizzando tecniche, fornendo la migliore separazione.

Il vantaggio principale dell'utilizzo della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza rispetto ad altri metodi come l'isolamento massimo, è che il fax offre le popolazioni cellulari pure che possono essere ottenute. La funzione cellulare può quindi essere testata in modo affidabile in saggi di soppressione in vitro, come dimostrato qui. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla funzione treg in soggetti sani e correlati al diabete di tipo uno. Può anche essere applicato ad altre malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide umana, il lupus sistemico, l'erimitosi, la sclerosi multipla e altre Per rivestire le perle attivate dal taal con CD tre anti-umano.

Aggiungere un millilitro di perline attivate da M four 50 toil dalla fiala originale in un tubo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo in un supporto magnetico fino a quando tutte le perle hanno aderito al lato del tubo. Quindi rimuovere il tampone per microsfere pipettandolo mentre la provetta è ancora nel supporto magnetico. Quindi estrarre il tubo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro di tampone.

Posizionare il tubo nel supporto magnetico più e più volte. Rimuovere il tampone mentre il tubo è nel supporto magnetico. Di conseguenza, sospendere nuovamente le perle in un millilitro di tampone.

Questa volta aggiungendo anche 40 microlitri di CD anti-umano tre. Agitare le perle e gli anticorpi a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi aggiungere lo 0,1% in peso per volume BS, A e continuare ad agitare per le successive 16 ore.

Successivamente, lavare le perle due volte con il tampone due incubando le perle in un millilitro di tampone. Due per cinque minuti a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius, quindi rimuovendo il tampone mentre il tubo è nel supporto magnetico. Quindi lavare le perle ancora una volta nelle stesse condizioni sterili.

Questa volta, utilizzando un millilitro di tampone tre, testare l'efficienza del rivestimento dell'anticorpo aggiungendo un numero variabile di perle rivestite di CD tre per cella al fine di determinare il rapporto ottimale e ALI citando 50, 020, 5, 000 P BMC per pozzetto in triplicato in una piastra a 96 sfere. Dopo 72 ore di coltura a 37 gradi Celsius, aggiungere un micro curry di timidina triziata e continuare l'incubazione per le successive 16 ore. Raccogli le cellule in una piastra di raccolta multischermo o simile.

Aggiungere il liquido di scintillazione e leggere i conteggi al minuto o CPM per pozzetto. Utilizzando un contatore a scintillazione N XT con conteggio superiore, o simile, determinare il rapporto tra perline e celle utilizzando quello che fornisce un CPM costantemente superiore a 5.000, ma inferiore a 15.000 nella nostra esperienza. Un rapporto di tre perle per cellula di solito fornisce la stimolazione ottimale sia per le cellule responder che per quelle treg in tutti i soggetti umani testati.

Riempire un tubo conico da 50 millilitri con 15 millilitri di fal plus. Quindi eseguire una diluizione da uno a sei di 50 millilitri di buffy coat aggiungendo 250 millilitri di PBS alla provetta di sangue. Sovrapporre lentamente 25 millilitri di buffy coat diluito sopra la confezione di fial senza disturbare gli strati.

Centrifugare a 800 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Con la pausa disattivata raccogliere con cura lo strato di PBMC, che è la fase intermedia bianca tra il fial e il buffer. Se necessario, raschiare le cellule dalla parete del tubo.

Attendi qualche minuto e raccoglili nuovamente dalla fase intermedia. Trasferire le celle in provette fresche da 50 millilitri e lavarle riempiendo le provette con pellet di PBS. Il pbm cs.

Ripetere la fase di lavaggio due volte ogni volta. Combinando due pellet di celle in un unico tubo, si combinano infine tutti i pellet di celle in un unico tubo da 50 millilitri. Quindi utilizzare 20 microlitri di cellule sospese per determinare la vitalità cellulare mediante esclusione trian blue.

Test di generazione di APC trasferendo un millilitro di pbmc vitale in un nuovo tubo. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno e irradiare le cellule con 5.000 rad per completare la provetta contenente il resto delle BMC P con tampone PBS. Quindi, dopo aver centrifugato le cellule a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, versare il surnatante e risospendere le cellule in quattro millilitri della stessa miscela.

Quindi aggiungere 200 microlitri di max anti CD quattro microsfere al pbmc e incubare la miscela di cellule e perle a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in 40 millilitri di tampone PBS, quindi pellettare le cellule. Quindi versare il surnatante e risospendere le cellule in otto millilitri di tampone Degas PBS a temperatura ambiente.

Quindi, utilizzare i filtri di separazione pres per filtrare la sospensione cellulare. Quindi dividere il PBM CS in due provette da 15 millilitri. Aggiunta di quattro millilitri di BMC P a ciascun tubo.

Uno spesso apporre due colonne a S su un separatore minimax e posizionare i tubi di raccolta sotto ogni colonna. Quindi, aggiungere tre millilitri di tampone PBS DGA a ciascuna colonna, quando non è rimasto alcun tampone, sovrapporre l'intera soluzione di cella da quattro millilitri di ciascuna provetta sopra le colonne prima che la sospensione cellulare si esaurisca completamente. Aggiungere tre millilitri di tampone PBS a temperatura ambiente DGA a ciascuna colonna e lasciare che il tampone scorra nelle provette di raccolta.

Aggiungi altro buffer fino a quando non esce chiaro. Pipettare altri cinque millilitri di tampone DGA sulle colonne LS, quindi rimuovere le colonne LS dal separatore minimax. Posizionare le colonne in nuove provette di raccolta sterili da 50 millilitri.

Lascia esaurire mezzo millilitro e poi immergi lentamente il resto del volume, che è di circa quattro millilitri. Ora combina i due CD quattro frazioni positive. Quindi aggiungere fino a 50 millilitri di PBS alla provetta e contare le cellule dopo aver fatto girare le cellule a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere le cellule in due millilitri di tampone PBS. Combinare gli anticorpi da utilizzare per la colorazione dei fatti in un tubo anti CD 14, CD 32, CD 16 e opzionalmente anti CD quattro. Prelevare un'aliquota di miscela per colorare il FLUOROCHROME meno un tubo.

Preparare la provetta FMO trasferendo cinque microlitri della sospensione cellulare millilitro della provetta in una provetta fax e colorare le cellule con due microlitri del cocktail di anticorpi precedentemente preparato. Successivamente, aggiungere le cellule non colorate e le perle rivestite con IgG di topo da colorare con un singolo fluorocromo ai nuovi tubi fax individuali da utilizzare come controlli di compensazione per lo smistamento delle cellule. Quindi aggiungere 50 microlitri di CD 25 PE anti-umano al cocktail e aggiungere il cocktail al resto della sospensione cellulare.

Incubare le provette a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver incubato le cellule con il cocktail di anticorpi, aggiungere il tampone PBS alle cellule e poi pellettare Resus. Sospendere il pellet nel tampone PBS ad una concentrazione di 10 per il leader di sette celle per millilitro.

Utilizzare la provetta FMO per impostare la soglia per lo smistamento delle cellule T positive CD 25. Usando questa strategia di gating, in primo luogo, impostare un'andatura attorno alle cellule fite negative per escludere le cellule fitz positive, che comprendono monociti, macrofagi e tutte le altre quattro cellule CD positive non T come dimostrato in questa figura. In un grafico separato, disegna le andature per le cellule T negative CD 25 e CD 25 basse e le cellule treg alte CD 25 come in questa figura.

Dopo il flusso, smistamento dei sottoinsiemi di cellule, pellettizzazione delle provette di raccolta e quindi mantenimento della cellula T su ghiaccio fino alla placcatura. Etichettare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U come mostrato nella tabella. Sospendere un'aliquota di 50 microlitri di CD, tre perle rivestite, calcolate a tre microsfere per cellula di risposta per concentrazione di pozzetti in un terreno completo con il 10% di siero AB umano raggruppato nella piastra a 96 pozzetti, quindi diluire le APC precedentemente irradiate in terreno a una concentrazione di cinque volte 10 per quinta cellula per millilitro.

Aggiungere 50 microlitri di cellule alla piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 2,5 volte 10 ai quattro CD, quattro positivi, CD 25 negativi o CD quattro positivi, CD 25 a bassa T-cell per pozzetto in triplicato aggiungere treg alla riga B e ai pozzetti etichettati come treg solo della co-coltura in un rapporto da uno a 10 come mostrato qui. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di CO2 in umidità satura per 72 ore. Successivamente, pulsare le cellule con una micro curie di timidina triziata e quindi continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per le successive 16 ore dopo che la timidina è stata incorporata nelle ultime ore della co-coltura.

Utilizzare una mietitrice di mate filtrante per raccogliere le cellule su una piastra di raccolta multischermo. Quindi coprire la piastra di raccolta con un coperchio di plastica trasparente precedentemente riempito con un fluido di scintillazione. Infine leggete il CPM per pozzo.

Utilizzando un contatore a scintillazione, sottoinsiemi di cellule T possono essere isolati ad alta purezza da questo sistema, come si vede nella seguente serie di grafici a punti: CD, quattro CD, 25 cellule T negative sono mostrate qui nel cancello inferiore. In questa figura successiva, si possono vedere quattro cellule T basse CD 25 altamente purificate. Una popolazione pura di flusso ordinato CD quattro positivi.

Le celle di treg alte CD 25 sono visualizzate nel controllo del cancello superiore. Le colture di tipo a singola cellula di APC e treg da soggetti sani hanno mostrato poca o nessuna proliferazione sul fondo, misurata dall'incorporazione della timidina, mentre le cellule CD 25 negative naive e le cellule CD 25 a bassa T attivate in vivo hanno mostrato una marcata proliferazione che viene soppressa quando questi tipi di cellule responder sono co-coltivate con cellule treg. Sebbene siano state osservate lievi differenze nella capacità delle treg di sopprimere le cellule T basse CD 25 naive naive al responder e CD 25 attive in vivo.

Non si trattava di un controllo significativo. Le colture di tipo a singola cellula di APC e Treg da soggetti a rischio hanno mostrato poca o nessuna proliferazione sullo sfondo, misurata dall'incorporazione della timidina. Mentre le cellule CD 25 negative naive e le cellule CD 25 a bassa T attivate in vivo hanno mostrato livelli di proliferazione inferiori rispetto ai controlli sani.

Le cellule T responder sono state ulteriormente soppresse da treg e cocolture poiché il test genera risultati affidabili. Possiamo inoltre concludere che bassi valori di CPM suggeriscono potenziali difetti nella trasduzione del segnale, che dovrebbero essere ulteriormente studiati in un diverso tipo di studio. Tuttavia, la differenza nella capacità delle treg di sopprimere le cellule T CD 25 negative rispetto alle cellule T CD 25 a bassa risposta nei soggetti a rischio era significativa.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come collegare senza problemi tutti i passaggi necessari per un test funzionale di successo e affidabile per la presenza di Treg in soggetti sani e soggetti con sistema immunitario compromesso. Ad esempio, in soggetti con diabete di tipo uno.