Analisi della funzione del gene e visualizzazione di Cilia-Generated flusso di fluido in vescicole di Kupffer

Lo scopo di questa procedura è quello di modulare i geni funzionali nella vescicola di Kavas o il KV nell'embrione di zebrafish che è responsabile del patterning sinistro destro e analizzare il flusso di fluido asimmetrico generato da motil clia erogando perle fluorescenti nel kv. Ciò si ottiene iniettando prima oligonucleotidi morph fluorescenti che reprimono l'espressione di uno specifico gene di interesse nella cellula vitellino di un embrione allo stadio medio di Dilla, in modo che si carichino nelle cellule precursori dorsali che danno origine alla kv. Successivamente, gli embrioni iniettati che hanno morfo fluorescente solo nel tuorlo e nel kv vengono selezionati per ulteriori analisi.

Quindi gli embrioni vengono montati in vetrini di depressione e le perle fluorescenti vengono iniettate nel lume della vescicola piena di liquido della kv. Infine, la microscopia video viene utilizzata per registrare le perle che scorrono all'interno del kv. In definitiva, è possibile ottenere risultati che determinano se la deplezione tessuto-specifica di un gene candidato nel KV altera il flusso asimmetrico del fluido attraverso l'analisi quantitativa dei movimenti delle microsfere.

La dimostrazione virale di questo semestre è fondamentale poiché le iniezioni di molino specifiche per fase e le iniezioni di perline di fluorescenza sono difficili da imparare perché entrambe dipendono dalla proposizione dell'embrione e dai tempi di sviluppo dell'esperimento. Per eseguire iniezioni di global morph o MO, raccogliere gli embrioni immediatamente dopo la fecondazione e caricarli in una piastra di iniezione. Usa un lucido a fuoco oltre la nostra pipetta per posizionare gli embrioni nella piastra di iniezione per immobilizzare gli embrioni.

Rompi la punta di un ago per iniezione e regola le impostazioni di iniezione per creare una goccia per iniezione con un volume di un nanolitro. Utilizzando un microscopio da dissezione, iniettare un nanolitro di MO nel giogo di almeno 50 embrioni tra uno e quattro stadi cellulari. Per l'iniezione mirata di M mo DFC, raccogliere gli embrioni immediatamente dopo la fecondazione e incubarli a 28,5 gradi Celsius.

Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di 256 cellule, caricali rapidamente in una piastra di iniezione e inietta un nanolitro di MO fluorescente nel tuorlo. Iniettare almeno 100 embrioni tra gli stadi di 256 e 1000 cellule per eseguire l'iniezione mirata al tuorlo. Dopo aver incubato le uova fecondate allo stadio a cupola, iniettare un nanolitro di MO fluorescente nel giogo di almeno 100 embrioni tra la cupola e il 30% degli stadi a strati.

Quando M mo iniettato gli embrioni raggiungono il 75% di uno stadio di strato. Rimuovere gli embrioni non fecondati e morti al microscopio da dissezione per iniezioni globali di MO. Scegli embrioni viventi per la fluorescenza distribuiti uniformemente in tutte le cellule.

Per le iniezioni di M mo mirate al DFC, selezionare embrioni con fluorescenza diffusa in tutto il tuorlo e concentrata al margine dermico sabbiato dorsale. Per iniezioni mirate di MO al tuorlo. Scegli embrioni in cui la fluorescenza è distribuita uniformemente in tutto il tuorlo e non osservata in nessuna cellula embrionale tra i due e i quattro.

Quindi gli stadi degli acari. Seleziona embrioni mirati al DFC che mostrano fluorescenza solo nelle cellule KV e nel tuorlo e scarta il resto per iniezioni mirate al tuorlo. Selezionare gli embrioni con fluorescenza esclusivamente nel tuorlo per analizzare il flusso asimmetrico nel KV degli embrioni iniettati con MO Inizia utilizzando una pinza affilata per rivestire accuratamente circa 20 embrioni tra i quattro e i sei.

Così come le fasi potrebbero trasferire un embrione su un scivolo di depressione di vetro e rimuovere quanta più acqua possibile. Immobilizza l'embrione aggiungendo abbastanza caldo all'1% di aerodinamica a basso punto di fusione per coprirlo appena mentre l'aerodinamica si solidifica. Usa una pinza per posizionarlo in modo che il KV sia rivolto verso l'alto, monta 10 embrioni, lavorando rapidamente per garantire che tutte le iniezioni siano completate entro i 10.

Quindi fase dell'acaro. Dopo aver diluito microsfere fluorescenti di 0,5 micron di diametro da uno a 50 in acqua sterile. Mescolare accuratamente le perle e caricare tre microlitri in un ago capillare utilizzando lo stesso micro iniettore utilizzato per le iniezioni di MO.

Usa una pinza per rompere la punta dell'ago e regola le impostazioni di iniezione per generare l'iniezione più piccola possibile. Goccia. Quindi, sotto un microscopio da dissezione, allineare l'ago con il lume KV del primo embrione montato. Quindi inserire l'ago nel lume e iniettare meno di 0,5 nanolitri di perline.

Aggiungere una goccia di acqua sterile sull'aros per evitare che l'embrione si secchi sotto un microscopio a fluorescenza verticale. Utilizzando uno screening obiettivo 20 x gli embrioni iniettati per la consegna riuscita di perline per ogni embrione selezionato con perline all'interno del KV a una goccia di acqua sterile per coprire gli aros. Quindi osservare utilizzando un microscopio composto fluorescente con un obiettivo a immersione in acqua 63x.

Utilizzando una telecamera ad alta velocità montata sul microscopio, registrare un filmato di dieci secondi. Utilizzare il canale fluorescente per registrare le perline a circa 70 fotogrammi al secondo e il campo chiaro o il contrasto di interferenza differenziale per registrare il lumen KV. Importa i filmati in Image J.Create le proiezioni massime e utilizzate il software per tracciare i movimenti delle singole perline.

Questa figura mostra la distribuzione di MO fluorescente in embrioni iniettati vivi in stadio specifico di successo. Qui viene mostrata un'iniezione di MO non riuscita in cui la soluzione rimane aggregata nel tuorlo. Il flusso di fluido negli embrioni iniettati con successo può essere misurato qualitativamente o quantitativamente in un embrione di controllo con perline a flusso normale.

Seguire percorsi in senso antiorario che possono essere visualizzati effettuando una proiezione massima delle posizioni delle perle fluorescenti nel tempo o tracciando le singole perle nel tempo. Per dimostrare la perdita del flusso coordinato, gli embrioni sono stati iniettati con MO per abbattere la chinasi di fila due B o la roccia due B, che interrompe il flusso e, di conseguenza, le perle si muovono casualmente in kv, la velocità media di cinque perle dal controllo e la roccia due embrioni B mo è mostrata qui dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare i geni e i meccanismi nello stabilire l'accesso al corpo sinistro destro nel pesce zebra.