Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering
June 10th, 2014
In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare. I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre substrati di coltura cellulare biomimetica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici. Ciò si ottiene fabbricando prima un master in silicone con l'architettura topografica desiderata mediante incisione ionica reattiva profonda. Il secondo passaggio consiste nel trasferire il modello topografico desiderato dal master in silicio a uno stampo PUA utilizzando la litografia a forza capillare assistita da UV.
Successivamente, lo stampo PUA viene utilizzato come modello per fabbricare substrati di coltura cellulare con vari materiali polimerici a seconda dell'applicazione desiderata tramite litografia a forza capillare assistita da UV o mediata da solvente. Il passaggio finale consiste nel placcare i cardiomiociti primari o derivati da cellule staminali sui substrati di coltura cellulare a modello nanometrico per la successiva analisi. Infine, la microscopia a campo chiaro e la microscopia a immunofluorescenza vengono utilizzate per mostrare i cambiamenti nella morfologia cellulare e nella disposizione contrattuale delle proteine all'interno dei cardiomiociti.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la micro stampa a contatto, è che la litografia a forza capillare produce substrati di coltura cellulare a modello nanometrico in grado di indurre l'allineamento strutturale dei monostrati di tessuto cardiaco senza fare affidamento sulla proliferazione o sulla migrazione cellulare. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulla relazione struttura-funzione dei tessuti cardiaci, può essere applicato anche ad altri sistemi come la meccanobiologia del cancro. Per studiare l'impatto della topografia della matrice sulla migrazione cellulare, iniziare questa procedura pulendo la superficie master del silicio con etanolo o xilene al 100% ed essiccandola sotto ossigeno azoto gassoso.
Quindi, posizionare il modello master in silicone con il lato rivolto verso l'alto in una capsula di Petri per un master in silicone con una pipetta di due centimetri per due centimetri di PUA su di esso. Quindi, posizionare un foglio di quattro centimetri per quattro centimetri di pellicola di poliestere trasparente sopra la PUA erogata, premere sul foglio di PET e stendere la PUA sotto il foglio sulla faccia del modello utilizzando un rullo o una superficie con bordo piatto in modo che l'intero modello sia coperto dal prepolimero PUA. Quindi posizionare il prepolimero master in silicone e il PET a circa 10 centimetri sotto una luce UV da 20 watt per 50 secondi.
Dopo l'indurimento, rimuovere lentamente la pellicola in PET con una pinza. PUA dovrebbe attaccarsi alla pellicola in PET con un negativo del modello nano Silicon Master. Successivamente polimerizzare i modelli P-U-A-P-E-T nano sotto UV per almeno 12 ore prima dell'uso.
Per pulire i Silicon Masters, posizionare un'altra pellicola di PET sopra il master senza l'aggiunta di PUA. Esponilo alla luce UV per 50 secondi e rimuovi la pellicola in PET. Quindi sciacquare il master in silicone con etanolo al 100% o xilene e asciugare sotto ossigeno azoto gassoso.
In questa procedura, trattare vetrini circolari di 18 millimetri di diametro ponendoli in una camera di ozono per 10 minuti. Quindi, posizionare le guide sui blocchi di PDMS per fissarle temporaneamente per una facile manipolazione. Quindi, applicare uno strato di primer per vetro sulla superficie del vetrino.
Lasciare asciugare il primer all'aria per 30 minuti. Ora posiziona i vetrini su un pezzo di carta per stampante. Far cadere 10 microlitri di prepolimero poliuretanico al centro di ogni vetrino e assicurarsi che non si generino bolle.
Quindi posizionare il modello dello stampo PUA a faccia in giù sul vetrino, disperdere il prepolimero PU in modo uniforme sulla superficie del vetrino facendo rotolare un rullo cilindrico di gomma lungo lo stampo PUA. La carta della stampante assorbirà il polimero in eccesso, dopodiché li polimerizzerà UV per 60 secondi sotto una lampada UV da 20 watt. Successivamente, rimuovere il campione dalla sorgente di luce UV e staccare con cura lo stampo PUA dal vetrino in vetro rivestito in PU, la polimerizzazione del PU è considerata completa.
Quando lo stampo PUA si stacca in modo pulito dal campione e il vetrino in PU ha un aspetto iridescente, posizionare i campioni in un essiccante per la conservazione fino a un mese. Ora attacca un vetrino di copertura NFS a una pipetta per piastre in polistirene per colture tissutali da 35 millimetri 20 microlitri di NOA sul fondo della piastra. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto NPPU sopra il NOA e lasciare che la colla si diffonda e copra l'intero fondo del vetrino coprioggetti, dopodiché polimerizzare il NOA esponendo il piatto ai raggi UV per 10 minuti.
Successivamente, sterilizzare l'NP SUBSTRATA sciacquandolo due volte con due millilitri di soluzione acquosa di etanolo al 70% ciascuno per cinque minuti. Rimuovere l'etanolo per aspirazione. Lasciare asciugare completamente l'A NFS all'aria per circa un'ora sotto la lampada di sterilizzazione UV nella cabina di sicurezza biologica.
Per migliorare l'adesione cellulare, rivestire l'A NFS in fibronectina durante la notte diluendo prima la fibronectina in acqua a cinque microgrammi per millilitro. Quindi, pipettare due millilitri di soluzione di fibronectina in un piatto. Quindi posizionare l'A NFS nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 durante la notte.
Ottenere NR VM, HERC CMS o altre cellule cardiache di interesse, centrifugare il campione di cellule a 1000 RPM per tre minuti per pellettare le cellule. Rimuovere con cautela il surnatante per aspirazione e fare attenzione a non disturbare il pellet. Successivamente, risospendere le cellule nei terreni di coltura a una concentrazione di 4,6 volte 10 per sei cellule per millilitro.
Pipettare con cautela 200 microlitri di sospensione cellulare sull'A NFS sterilizzato e assicurarsi che la sospensione cellulare rimanga sul vetrino coprioggetto. Quindi, posizionare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per quattro ore per consentire alle cellule di attaccarsi all'A NFS. Quindi aggiungere due millilitri di ulteriore terreno di coltura caldo alla piastra e posizionare nuovamente le cellule nell'incubatore nelle stesse condizioni.
Dopo 24 ore, rimuovere il terreno e lavare due volte con due millilitri di DPBS per rimuovere le cellule in eccesso. Successivamente, aggiungi due millilitri di terreno di coltura caldo al piatto. Mettere le cellule in un incubatore nelle stesse condizioni e coltura.
Le celle per la confluenza sostituiscono i mezzi a giorni alterni. Questa figura mostra le immagini rappresentative in campo chiaro delle macchine virtuali NR dopo sette giorni di coltura e cm HESC. Dopo 48 ore di coltura, le VM NR e le CMS HESC sulle superfici delle NP mostrano un'evidente anisotropia strutturale e allineamento, mentre i cardiomiociti sulle superfici del pattern UN sono orientati in modo casuale.
L'analisi immunoistochimica evidenzia l'impatto della nano topografia sull'allineamento citoscheletrico cellulare, i micro filamenti di actina e l'actina alfa sarcomerica nelle cellule coltivate sull'A NFS si allineano lungo le nano creste, ma rimangono distribuiti in modo casuale nelle cellule su substrati non modellati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sterilizzare il substrato prima dell'inserimento delle cellule, poiché la contaminazione può essere un grosso problema dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biologia cardiovascolare per esplorare la maturazione cardiaca e i cardiomiociti derivati da cellule staminali.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un substrato di coltura cellulare biomimetica tramite litografia a forza capillare per applicazioni di ingegneria del tessuto cardiaco.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra la fabbricazione di substrati per colture cellulari cardiache biomimetiche utilizzando la litografia a forza capillare. I metodi delineati forniscono un approccio scalabile ed economico per ingegnerizzare tessuti cardiaci macroscopici per varie applicazioni.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Tecniche di coltura cellulare
- Materiali polimerici
Contesto
- I substrati biomimetici sono essenziali per studiare le cellule cardiache.
- La litografia a forza capillare permette un'incisione precisa.
- L'ingegnerizzazione dei tessuti cardiaci può migliorare gli studi in vitro e in vivo.
- L'utilizzo di diversi materiali polimerici può personalizzare le applicazioni.
Obiettivo dello studio
- Produrre substrati per colture cellulari biomimetici.
- Ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci.
- Facilitare l'analisi del comportamento dei cardiomiociti.
Metodi utilizzati
- Fabbricazione di un master in silicone utilizzando l'incisione ionica reattiva profonda.
- Trasferimento di modelli topografici a uno stampo PUA tramite litografia a forza capillare assistita da UV.
- Fabbricazione di substrati per colture cellulari da vari materiali polimerici.
- Piastrellatura di cardiomiociti per l'analisi utilizzando tecniche di microscopia.
Risultati principali
- Trasferimento riuscito di modelli topografici sui substrati per colture cellulari.
- Osservazione di cambiamenti nella morfologia cellulare.
- Analisi della disposizione delle proteine contrattuali nei cardiomiociti.
- Dimostrazione dell'efficacia dei substrati biomimetici.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per creare substrati biomimetici.
- La litografia a forza capillare è una tecnica versatile per l'ingegneria dei tessuti.
- Ulteriori studi possono migliorare la comprensione del comportamento delle cellule cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
