Name: Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri la litografia a forza capillare per ingegnerizzare substrati biomimetici per colture cellulari cardiache. Questo metodo scalabile permette di studiare la morfologia e l'allineamento dei cardiomiociti in vitro.

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D. H. Kim ringrazia il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università di Washington per il nuovo fondo per l'avvio della facoltà. D. H. Kim è anche supportato dal Perkins Coie Award for Discovery, dal Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, dal Washington State Life Science Discovery Fund e dall'American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang e A. Jiao ringraziano il supporto del NIH Bioengineering Borsa di studio per la formazione cardiovascolare. Un ulteriore sostegno per questo lavoro proviene dalla sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01HL111197 a M. Regnier.

Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (~ 23 ° C), salvo diversamente indicato. 1. Fabbricazione di Silicon Maestro <ol><li> Pulire wafer di silicio con 100% di etanolo o xilene e secco sotto O 2 / N 2 gas. </li><li> Posizionare wafer di silicio in spin-coater a velocità di rotazione di 2.000-4.000 rpm per produrre un film di spessore 0,3-0,5 micron. </li><li> Reticolo la pellicola di fotoresist con le dimensioni corrette utilizzando un sistema di fotolitografia </li><li> Immergere completamente le fette di silicio photoresist rivestite con fantasia in un volume appropriato di soluzione photoresist in via di sviluppo. </li><li> Sciacquare i wafer di silicio photoresist rivestite sviluppati con acqua deionizzata. </li><li> Per formare array di sub-micron creste scala con pareti laterali verticali vicino, profondo reattiva etch ioni di silicio esposto utilizzando un sistema di incisione. </li><li> Rimuovere il fotoresist rimanente posizionando il wafer di silicio in un sistema asher plasma. </li><li> Tagliare il silicio wAfers con una fresa diamantata nei padroni di silicio opportunamente dimensionati per il successivo stampaggio replica. </li></ol> 2. Fabbricazione di PUA Stampo da Silicon Maestro NOTA: Volume da aggiungere al padrone silicio per nanofabbricazione varierà a seconda della zona del master nanostrutturati da replicare e la viscosità della soluzione di poliuretano acrilato (PUA). <ol><li> Pulire la superficie di silicio maestro con il 100% di etanolo o xilene e asciutto in O 2 / N 2 gas. </li><li> Posizionare lato silicio maestro modello in una capsula di Petri. </li><li> Per un maestro di silicio con 2 cm x 2 cm modello di superficie, pipetta 40 ml di PUA al modello di superficie. </li><li> Mettere un foglio di 4 cm x 4 cm trasparente in poliestere (PET) il PUA erogato. </li><li> Premere sul foglio PET e diffondere la PUA sotto il lenzuolo sulla faccia pattern usando un rullo o una superficie piana taglio (ad esempio una carta) in modo che l&#39;interamodello è coperto dal prepolimero PUA. </li><li> Mettere maestro di silicio, prepolimero, e PET circa 10 cm sotto una luce 20 Watt (115 V) UV (λ = 365 nm) per 50 sec. Per essere efficace, la lunghezza d&#39;onda della luce UV può essere ovunque tra 310-400 nm. L&#39;intensità della luce è 10-15 mW / cm 2 alla superficie del substrato. </li><li> Dopo l&#39;indurimento, rimuovere i fogli di PET lentamente con una pinza. PUA deve allegare al film PET con un negativo del silicio maestro nanopattern. </li><li> Cure nanopatterns PUA / PET in UV per almeno 12 ore prima dell&#39;uso. La sovraesposizione non è un problema. </li><li> Per pulire maestri silicio, posizionare un altro film di PET in cima al padrone senza l&#39;aggiunta di PUA e esporre a luce UV (λ = 365 nm) per 50 sec e rimuovere i fogli di PET. Questo eliminerà eventuali monomeri che non hanno reagito. </li><li> Sciacquare maestro di silicio con il 100% di etanolo o xilene e secco sotto O 2 / N 2 gas. </li></ol> 3a. Polymer nanopatterning poliuretano </p&gt; <ol><li> Preparare 25 mm di diametro vetrini circolari ponendo in un camera di trattamento ozono per 10 min. </li><li> Posizionare vetrini ozono trattati sul piccolo blocco PDMS per una facile movimentazione. </li><li> Applicare uno strato sottile di superficie promotore di adesione con pennello per vetrini. Vie vetrini asciugare per 30 min. </li><li> Posizionare il vetrino su un pezzo di carta per stampanti. </li><li> Goccia dispensare 10 ml di poliuretano (PU) pre-polimero (NOA 76) al centro di vetrino. Assicurarsi che non siano presenti bolle dopo l&#39;aggiunta. </li><li> Muffa posto PUA, modello a faccia in giù, sul vetrino. Disperdere il PU uniforme su tutta la superficie del vetrino tirando un rullo di gomma cilindro lungo lo stampo PUA. Carta per stampanti in grado di assorbire troppo pieno polimero. </li><li> Lampada UV Watt. Tempo di polimerizzazione del PU dipende dalla potenza della sorgente UV. </li><li> Togliere il campione dal sorgente di luce UV e staccare con cura lo stampo PUA dal vetrino spalmato PU. Polimerizzazione del PU è considerato complete quando i PUA stampo bucce pulito di distanza dal campione e il vetrino PU ha un aspetto cangiante. </li><li> Posizionare campioni finiti in essiccatore per la conservazione a lungo di un mese. </li></ol> 3b. Nanopatterning Poli (Lactide-Co-Glycolide) Hydrogel <ol><li> Creare uno stampo PDMS piatto vigorosamente mescolando silicone base di elastomero di silicone elastomero agente indurente in un rapporto di 10:1. </li><li> Pour PDMS misti precursore soluzione in una capsula di Petri in modo che il precursore PDMS raggiunge i 5 mm fino al bordo del piatto (cioè tale PDMS uno spessore di 5 mm). </li><li> Porre piastra di Petri e PDMS precursore in un essiccatore per 1 ora a Degas. </li><li> Spostare piastra di Petri e PDMS precursore in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore per curare. </li><li> Dopo PDMS è guarito, utilizzare un rasoio per tagliare i PDMS piatto in 3 cm x 3 cm sezioni quadrate. Questi saranno i PDMS piatto stampi utilizzati in seguito nel processo di patterning. </li><li> Clean 25 mm di diametro vetrini circolare di placing in alcol isopropilico per 30 minuti in un sonicatore acqua. </li><li> Dry vetrini puliti in O 2 / N 2 gas. </li><li> Goccia dispensare 100 ul di soluzione di PLGA (15% w / v PLGA in cloroformio) sul vetrino. </li><li> Posizionare uno stampo PDMS piatta sulla parte superiore del PLGA erogato per assorbire il solvente e ottenere una superficie piana PLGA. Applicare una leggera pressione (~ 10 kPa) posizionando un peso di 200 g in cima alle PDMS per 5 min. </li><li> Sbucciare lentamente stampo PDMS piana e posizionare il vetro di copertura su un piatto preriscaldato (120 ° C) per 5 minuti per rimuovere il solvente residuo e aumentare l&#39;adesione tra il PLGA e il vetro di copertura. </li><li> Collocare lo stampo NP PUA sopra il piatto PLGA e applicare una pressione costante (~ 100 kPa) e calore (120 ° C) posizionando un peso 1 kg sulla parte superiore dello stampo PUA mentre sulla piastra di riscaldamento per 15 min. </li><li> Rimuovere il peso dal PLGA coperchio scorrevole e lasciare il substrato raffreddare a temperatura ambiente. Non rimuovere PUA stampo fino a quando i substrati sono statiraffreddato. </li><li> Una volta che i substrati sono sufficientemente raffreddato, togliere via lo stampo NP PUA, rivelando il substrato NP PLGA. Il substrato NP PLGA dovrebbe avere un aspetto iridescente. </li><li> Posizionare campioni finiti in essiccatore per la conservazione a lungo di un mese. </li></ol> 4. Semina cellulare e cultura NOTA: Questo protocollo descrive la cultura della neonatali miociti ventricolari di ratto (NRVMs) e cardiomiociti H7 umane staminali embrionali derivate da cellule (hESC-CMS), ma altre fonti di cellule possono essere utilizzati. <ol><li> Applicare i coprioggetti ANF (PU o PLGA) di un tessuto di cultura piatto di polistirolo da 35 mm. Pipettare 20 ml di Norland Optical Adhesive (NOA83H) sul fondo del piatto e posizionare con cura il vetrino ANF sulla parte superiore del NOA. Lasciare che la colla per stendere e coprire tutto il fondo vetrino. Cure NOA esponendo piatto ai raggi UV per 10 min. </li><li> Sterilizzare ANF risciacquando con 2 ml di soluzione acquosa di etanolo al 70% per 5 minuti, due volte. Rimuovere ethanol per aspirazione. Lasciare ANF completamente asciugare all&#39;aria per circa 1 ora sotto la lampada di sterilizzazione UV (λ = 200-290 nm) nella cappa di sicurezza biologica. </li><li> Adesione cellulare è arricchito da rivestimento della ANF in fibronectina durante la notte. Diluire fibronectina in acqua deionizzata a 5 mg / ml. Pipettare 2 ml di soluzione di fibronectina nel piatto. Porre in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (almeno 6 ore). </li><li> Ottenere NRVMs, hESC-CMS o altre cellule cardiache di interesse in base alle precedenti protocolli 22. </li><li> Campione di cellule centrifugare a 1000 rpm per 3 minuti per agglomerare le cellule. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in opportuno terreno di coltura ad una concentrazione di 4,6 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Pipetta con cautela 200 ml di sospensione cellulare su ANF sterilizzati. Assicurarsi sospensione cellulare rimane sul vetrino. </li><li> Posizionare cellule in incubatore a 37 ° C e 5%CO 2 per 4 ore per permettere alle cellule di allegare al ANF. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni. </li><li> Dopo 24 ore, rimuovere il supporto e lavare con 2 ml di DPBS due volte per rimuovere le cellule in eccesso. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni. Cultura le cellule a confluenza. Sostituire i media ogni altro giorno. </li></ol>

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<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tessuti cardiaci funzionalmente maturi sono carenti sia in vivo che in vitro applicazioni di ingegneria tissutale cardiaco. I metodi di nanofabbricazione CFL qui descritte sono tecniche robuste per realizzare l&#39;allineamento cellulare e influenzare la funzione del tessuto macroscopico dovuto alla scalabilità del sistema. Grandi aree possono essere facilmente modellati e utilizzati per la coltura cellulare. Macroscopico allineamento cellulare è essenziale in ingegneria tessuto cardiaco per creare biomimetico,...

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo e presentare un pesante fardello socio-economico su un già tesa globale 1,17 sistema sanitario. Ingegneria tissutale cardiaca ha due obiettivi distinti: (1) per rigenerare il miocardio danneggiato dopo la malattia ischemica o cardiomiopatia o (2) per creare un modello ad alta fedeltà del cuore per lo screening in vitro di droga o di modellazione malattia. Il cuore è un organo complesso che deve lavorare costantemente per la fornitura di sangue al corpo. Strutture laminari densamente di cardiomiociti e tessuti di sostegno sono disposti in schemi elicoidali tutta la parete cardiaca 18,19. Il cuore è anche accoppiato elettromeccanico 20 in un modo altamente coordinato per espellere efficacemente sangue al corpo 21. Diversi ostacoli principali restano da affrontare, tuttavia, prima intricato disegno della natura può attendibilmente essere ricapitolato in vitro.In primo luogo, anche se robusti metodi di differenziazione dei cardiomiociti continuano ad essere sviluppato 22, HPSC-CM esporre ancora fenotipi piuttosto immaturi. Le loro proprietà elettromeccaniche e la morfologia più strettamente corrispondono livelli fetali 23. In secondo luogo, se tenuto in condizioni di coltura tradizionali, sia derivato dalle cellule staminali e cardiomiociti primari non riescono ad assemblare in strutture native, tessuto-like. Piuttosto, le cellule diventano orientati in modo casuale e non presentano l&#39;aspetto a forma di bastoncino fasciato di miocardio adulto 24. La matrice (ECM) ambiente extracellulare con cui le cellule interagiscono gioca un ruolo importante in numerosi processi cellulari 11,13,25. L&#39;ECM consiste di complessi segnali molecolari e topografici, ben definiti che influenzano significativamente la struttura e la funzione delle cellule 6,26. All&#39;interno del cuore, l&#39;allineamento cellulare segue da vicino le fibre ECM sottostante scala nanometrica 2. L&#39;impatto di questi nanotopographspunti iCal sul cellulare e la funzione del tessuto, tuttavia, è ben lungi dall&#39;essere completamente capito. Studi preliminari di interazione cellula-biomateriale scala nanometrica indicano la potenziale importanza e l&#39;impatto di sub-micron spunti topografici per la segnalazione cellulare 27, 28-30 adesione, la crescita del 31, e la differenziazione 32,33. Tuttavia, a causa della difficoltà di sviluppare substrati nanofabricated riproducibili e scalabile, tali studi potrebbero non riprodurre gli effetti cellulari multi-scala del complesso in ambiente ECM vivo. In questo protocollo, una tecnica di nanofabbricazione semplice e conveniente per produrre scaffold di coltura cellulare che mimano allineamento delle fibre ECM cardiaca nativa è descritto, consentendo una vasta gamma di nuove ricerche di interazioni cardiomiociti-biomateriale. Capire come cardiomiociti interagiscono con l&#39;ambiente ECM nanoscala potrebbe consentire per la capacità di controllare il comportamento cellulare per imitare più da vicino funzioni tessuto nativozione. Inoltre, monostrati cellulari sono un sistema sperimentale semplificato rispetto a strutture 3D, ma ancora presentano un comportamento multicellulare complesso per le indagini penetranti e screening funzionale 2,34-36. Infine, tali impalcature potrebbero essere utilizzati per migliorare la funzione del trapianto cellulare quando impiantato nel cuore per fini rigenerativi 37.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>Promotore di adesione superficiale (primer per vetro)</td><td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>Rullo in gomma morbida</td><td>Speedball</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>NOVA Materiali elettronici</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist Developer</td><td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di litografia a fascio di elettroni</td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di incisione</td> Sistemi <td>di tecnologia di superficie</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di asher al plasma</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cura dell'ozono</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O-08</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di polimerizzazione per fusione</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater Laurel</td><td>Technology</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET Film</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini da 25 mm</td><td>Corning</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poli (D,L-lattide-co-glicolide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 g Pesi</td><td>Global Insustrial</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sonicatore Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

capillare forza litografia per cardiac tissue engineering

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

La malattia cardiovascolare resta la principale causa di morte nel mondo 1. Ingegneria tissutale cardiaca molto promettente per fornire scoperte mediche rivoluzionarie con gli obiettivi di sviluppo di tessuti funzionali per la rigenerazione cardiaca, così come test di screening in vitro. Tuttavia, la capacità di creare modelli ad alta fedeltà di tessuto cardiaco è rivelato difficile. Matrice extracellulare del cuore (ECM) è una struttura complessa costituita da entrambi i segnali biochimici e biomeccanici che vanno dalla micro-alla scala nanometrica 2. Locali condizioni di carico meccanico e le interazioni cellula-ECM sono stati recentemente riconosciuti come componenti vitali in ingegneria del tessuto cardiaco 3-5. Una gran parte della ECM cardiaco è composto da fibre di collagene allineate con diametri scala nanometrica che influenza significativamente l&#39;architettura dei tessuti e accoppiamento elettromeccanico 2. Purtroppo, alcuni metodi have stato in grado di mimare l&#39;organizzazione delle fibre ECM fino alla scala nanometrica. Recenti progressi nelle tecniche di nanofabbricazione, tuttavia, hanno permesso la progettazione e la realizzazione di ponteggi scalabili che imitano i segnali vivo rigidità strutturali e substrato della ECM nel cuore 6-9. Presentiamo qui lo sviluppo di due riproducibile, processi nanopatterning scalabili per l&#39;allineamento funzionale delle cellule cardiache utilizzando la poli polimero biocompatibile (lattide-co-glicolico) (PLGA) 8 e un poliuretano (PU) polimero a base conveniente, e. Questi substrati anisotropicamente nanofabricated (ANF) imitare la ECM sottostante ben organizzate, tessuti allineati e può essere utilizzato per studiare il ruolo di nanotopography sulla morfologia e la funzione delle cellule 10-14. Utilizzando un nanostrutturati (NP) maestro di silicio come un modello, un acrilato di poliuretano (PUA) muffa è fabbricato. Questo stampo PUA viene quindi utilizzato per pattern l&#39;idrogel PU o PLGA tramite solventi mediata litografia forza capillare (CFL)-UV assistita o, rispettivamente, 15,16. In breve, PU o PLGA pre-polimero è caduta erogato su un vetrino di vetro e lo stampo PUA è posto sulla parte superiore. Per CFL-UV assistita, il PU viene poi esposto a radiazioni UV (λ = 250-400 nm) per la polimerizzazione. Per mediata solvente CFL, il PLGA viene stampato mediante calore (120 ° C) e pressione (100 kPa). Dopo la polimerizzazione, lo stampo PUA è staccata, lasciando dietro un ANF per coltura cellulare. Pile, come neonatali miociti ventricolari di ratto, così come cardiomiociti derivati ​​dalle cellule staminali umane pluripotenti, possono essere mantenuti in ANF 2.

La figura 1 è uno schema del processo di produzione per i due metodi di fabbricazione. A causa della diffrazione della luce causata dalla topografia nanoscala, nanopatterning dovrebbe risultare in una superficie iridescente alla ANF. Figura 2 mostra questa superficie iridescente su un ben modellata-25 millimetri coprioggetto NP-PU (Figura 2A) con cresta 800 nm e scanalatura larghezza (Figura 2B). L&#39;aspetto iridescente della ANF varierà leggermente a...

In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare. I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre substrati per colture cellulari biomimetici per ingegnerizzare la struttura e la funzione di tessuti cardiaci macroscopici. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando un master in silicone con l'architettura topografica desiderata mediante incisione ionica reattiva profonda. Il secondo passaggio consiste nel trasferire il modello topografico desiderato dal master in silicio a uno stampo in PUA utilizzando la litografia assistita da forze capillari con luce UV.Successivamente, il modello di PUA viene utilizzato come stampo per fabbricare substrati per colture cellulari a partire da diversi materiali polimerici, a seconda dell'applicazione desiderata, mediante litografia assistita da UV o mediata da solvente basata sulle forze capillari. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire cardiomiociti derivati da cellule primarie o da cellule staminali sui substrati per colture cellulari con nanostruttura, per successive analisi. In definitiva, vengono utilizzate microscopia in campo chiaro e microscopia a immunofluorescenza per mostrare i cambiamenti nella morfologia cellulare e nell'organizzazione delle proteine contrattili all'interno dei cardiomiociti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la stampa per contatto microscopica, è che la litografia basata sulle forze capillari produce substrati per colture cellulari con nanostrutture in grado di indurre l'allineamento strutturale di monocapotti di tessuto cardiaco senza dover fare affidamento sulla proliferazione o sulla migrazione cellulare. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per approfondire la relazione tra struttura e funzione nei tessuti cardiaci, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la meccanobiologia del cancro. Per studiare l'impatto della topografia della matrice sulla migrazione cellulare, iniziare questa procedura pulendo la superficie del master in silicio con etanolo al 100% o xilene e asciugandola sotto flusso di gas ossigeno o azoto.Successivamente, posizionare il lato del modello in silicio rivolto verso l'alto in una piastra di Petri; per un modello in silicio con una superficie modellata di due centimetri per due centimetri, pipettare 40 microlitri di PUA. Quindi posizionare un foglio di pellicola di poliestere trasparente di quattro centimetri per quattro centimetri sopra il PUA dispensato, premere sul foglio di PET e distribuire il PUA al di sotto del foglio su tutta la superficie modellata utilizzando un rullo o un bordo piatto, in modo che l'intero modello sia ricoperto dal pre-polimero PUA. Successivamente, posizionare il modello in silicone, il pre-polimero e il PET approssimativamente a 10 centimetri sotto una lampada UV da 20 watt per 50 secondi.Dopo la polimerizzazione, rimuovere lentamente il film in PET con pinzette. L'PUA dovrebbe aderire al film in PET con una replica negativa del nano-pattern del Silicon Master. Successivamente, polimerizzare i nano-pattern di P-U-A-P-E-T sotto luce UV per almeno 12 ore prima dell'uso.Per pulire i modelli di silicio, posizionare un altro film di PET sopra il modello senza aggiunta di PUA. Esporre alla luce UV per 50 secondi e rimuovere il film di PET. Quindi risciacquare il modello di silicio con etanolo al 100% o xilene ed essiccare sotto flusso di gas ossigeno-azoto.In questa procedura, trattare vetrini circolari di vetro con un diametro di 18 millimetri posizionandoli in una camera a ozono per 10 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini su blocchi di PDMS per fissarli temporaneamente e facilitarne la manipolazione. Quindi, applicare uno strato di primer per vetro sulla superficie del vetrino di vetro.Lasciare asciugare il primer all'aria per 30 minuti. Posizionare ora le lamelle di vetro su un foglio di carta da stampante. Aggiungere 10 microlitri di prepolymer di poliuretano al centro di ogni lamella di vetro e assicurarsi che non si formino bolle d'aria.Quindi posizionare il modello del conio PUA con la faccia del motivo rivolta verso il basso sulla lametta di vetro, distribuendo uniformemente il prepolimero PU sulla superficie della lametta mediante un rullo cilindrico di gomma passato lungo il conio PUA. La carta da stampante assorbirà l’eccesso di polimero; successivamente esporre a luce UV per 60 secondi sotto una lampada UV da 20 watt. In seguito, rimuovere il campione dalla sorgente di luce UV e staccare con cura il conio PUA dalla lametta di vetro rivestita di PU; la polimerizzazione del PU è considerata completa.Quando il calco in PUA si stacca pulitamente dal campione e la lametta in vetro PU presenta un aspetto iridescente, posizionare i campioni in un essiccatore per la conservazione fino a un mese. A questo punto, fissare delle lamelle NFS a una piastra in polistirene per colture cellulari da 35 millimetri e pipettare 20 microlitri di NOA sul fondo della piastra. Posizionare delicatamente la lamella in NPPU sopra il NOA e lasciare che la colla si espanda coprendo interamente la superficie inferiore della lamella; successivamente, polimerizzare il NOA esponendo la piastra a raggi UV per 10 minuti.Successivamente, sterilizzare i SUBSTRATI NP risciacquandoli due volte con due millilitri di soluzione acquosa di etanolo al 70% ciascuno per cinque minuti. Rimuovere l'etanolo mediante aspirazione. Lasciare asciugare completamente l'A NFS all'aria per circa un'ora sotto la lampada di sterilizzazione UV all'interno della cappa a sicurezza biologica.Per migliorare l'adesione cellulare, ricoprire l'A NFS con fibronectina durante la notte diluendo prima la fibronectina in acqua deionizzata fino a una concentrazione di cinque microgrammi per millilitro. Successivamente, pipettare due millilitri di soluzione di fibronectina in una piastra. Quindi, posizionare l'A NFS nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per tutta la notte.Ottenere VM NR, CM ESC-iPSC o altre cellule cardiache di interesse, centrifugare il campione cellulare a 1000 giri/min per tre minuti al fine di formare il pellet cellulare. Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione, avendo cura di non disturbare il pellet. Successivamente, risospendere le cellule in mezzo di coltura fino a una concentrazione di 4,6 volte 10 alla sesta cellule per millilitro.Pipettare con attenzione 200 microlitri di sospensione cellulare sul NFS A sterilizzato e assicurarsi che la sospensione cellulare rimanga sul vetrino. Successivamente, posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per quattro ore, in modo che le cellule possano aderire al NFS A. Quindi aggiungere due millilitri di ulteriore mezzo di coltura tiepido alla piastra e riposizionare le cellule nell'incubatrice nelle stesse condizioni.Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo e lavare due volte con due millilitri di DPBS per eliminare le cellule in eccesso. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di coltura tiepido alla piastra. Collocare le cellule in un incubatore nelle stesse condizioni e coltivarle.Le cellule a confluenza richiedono il cambio del mezzo ogni due giorni. Questa figura mostra immagini rappresentative in campo chiaro di VM da NR dopo sette giorni di coltura e cms da hESC. Dopo 48 ore di coltura, le VM da NR e i cms da hESC sulle superfici NP mostrano un'ovvia anisotropia strutturale e allineamento, mentre i cardiomiociti sulle superfici con pattern UN sono orientati in modo casuale.L'analisi immunohistochimica evidenzia l'impatto della nano-topografia sull'allineamento del citoscheletro cellulare, sui microfilamenti di actina e sull'actina alfa sarcomerica: nelle cellule coltivate su A NFS, questi elementi si allineano lungo le creste nanometriche, mentre rimangono distribuiti in modo casuale nelle cellule su substrati non strutturati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di sterilizzare i substrati prima del seeding cellulare, poiché la contaminazione può rappresentare un problema significativo una volta avviata la coltura. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cardiovascolare per lo studio della maturazione cardiaca e dei cardiomiociti derivati da cellule staminali.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre substrati biomimetici per colture cellulari mediante litografia basata sulle forze capillari, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci.

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Bioingegneria

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Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

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Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

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