Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

Questo esperimento verifica la capacità dello stafilococco aureo di utilizzare l'emoglobina umana come unica fonte di ferro. Innanzitutto, isolare i globuli rossi dal sangue umano fresco. Purificare l'emoglobina mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni per garantire l'integrità dell'emoglobina.

Ora aggiungi l'emoglobina nel terreno impoverito di ferro per fornire il ferro sotto forma di emoglobina Prossima coltura. S reus. In presenza di emoglobina e misurare la sua capacità di utilizzare l'emoglobina come fonte di ferro.

I risultati mostrano che il reus prolifera in presenza di emoglobina come unica fonte di ferro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, ad esempio se un agente patogeno può utilizzare le proteine dell'ospite come fonti di ferro e quali meccanismi sono necessari per utilizzare il ferro utilizzando questo processo. Quindi questo metodo può fornire informazioni sull'acquisizione del ferro dello stafilococco dall'emoglobina.

Può anche essere applicato agli studi di altri batteri e al modo in cui utilizzano le proteine contenenti ferro dell'ospite. A dimostrare questa tecnica saranno GLA Ani e Catherine Haley del mio laboratorio. In primo luogo, ottenere sangue umano appena isolato, integrato con un anticoagulante e mantenere a quattro gradi Celsius durante la purificazione Pellet i globuli rossi mediante centrifugazione per 20 minuti a 15, 000 Gs.Aspirare con cura il snat e risospendere delicatamente il pellet in ghiaccio freddo, soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% Dopo tre lavaggi, resus, sospendere il pellet in un volume di ghiaccio freddo 10 millimolare triss, HCL per liare i globuli rossi mediante pressione osmotica.

Quindi aggiungere toluene al 20% del volume finale e incubare a quattro gradi Celsius su un rotatore per una notte. Prossima centrifuga. Il lisato a 20.000 Gs all'ora.

Raccogliere la frazione di emolisato medio, lasciando indisturbato lo strato superiore di toluene e il pellet. Passare l'emolisato attraverso un filtro per siringa da 0,44 micrometri. Se la soluzione contiene particolato e non può essere fatta passare attraverso il filtro, ripetere la centrifugazione ad alta velocità.

Purificare ora l'emoglobina con una colonna a scambio anionico per cromatografia liquida ad alte prestazioni. Utilizzare una fase mobile A di 10 millimolari tris, HCL, e una fase mobile B di 10 millimolari tris, HCL più 0,5 molari di cloruro di sodio. Eseguire un gradiente da 0% a 100% di solvente B in due minuti a una velocità di flusso di due millilitri al minuto.

Monitorare l'eluizione in base all'assorbimento a 410 nanometri e 280 nanometri. Raccogli la frazione caratterizzata da un colore rosso vivo e da un picco di assorbimento prominente. Dializzare l'eluizione contro la soluzione salina tamponata con fosfato per circa 16 ore.

Per sterilizzare il campione, passarlo attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri per determinare la concentrazione di emoglobina. Preparare le soluzioni standard HP in PBS. Mescolare ora le soluzioni standard o le soluzioni campione con due reagenti xra kins in un rapporto uno a uno in piastre a 96 pozzetti dopo un'incubazione di 15 minuti che misura l'assorbanza a 540 nanometri.

Tracciare una curva standard e determinare la concentrazione di HP dei campioni da cinque a 15 milligrammi per millilitro. Le rese sono aliquote tipiche di 15-20 microgrammi di campione di emoglobina purificata su due gel di pagina 15%STS. Colorare uno dei gel e trasferire le proteine da un altro gel su una membrana di nitrocellulosa per tamponare l'immuno per l'emoglobina, congelare e conservare un millilitro di aliquote dell'emoglobina isolata in azoto liquido da una striscia di S aureus congelata su trittico, agar di soia e incubare a 37 gradi Celsius per 20-24 ore.

Inoculare singole colonie in cinque millilitri di RPMI contenenti E-D-D-H-A e coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 RP M durante la notte. Pellettare i batteri mediante centrifugazione per cinque minuti a 7, 500 Gs.Quindi Resus, sospendere i batteri in RPMI contenente 0,5 millimolari E-D-D-H-A e normalizzare a un OD 600 di circa tre. Successivamente, preparare N-R-P-M-I contenente 2,5 microgrammi per millilitro, HB e 0,1 in un millimolare E-D-D-H-A per chelare il ferro libero.

Ora la sottocoltura 10 microlitri di sospensione batterica in un millilitro di N-R-P-M-I più E-D-D-H-A più HP incubano le colture a 37 gradi Celsius per un massimo di 48 ore con agitazione a 180 RRP M ogni sei-12 ore. Rimuovere 50 microlitri della miscela di coltura con 150 microlitri di PBS in piastre a 96 pozzetti e rilevare le letture OD 600. In questa purificazione HPLC dell'emoglobina umana dall'emolisato, l'assorbanza dell'eluato a lunghezze d'onda di 280 e 410 nanometri viene misurata con la frazione cinque contenente l'emoglobina.

In genere, si ottengono rese da cinque a 15 milligrammi di emoglobina per millilitro per preparazione. L'emoglobina purificata è stata analizzata dalla pagina SDS in duplice duplicato e i gel sono stati sostituiti da proteine o trasferiti su nitrocellulosa e immuno blotted. Successivamente, l'emoglobina umana purificata è stata testata per la capacità di supportare la crescita di asus e ASUS wild type che mancano del recettore dell'emoglobina necessario per l'acquisizione del ferro derivato dall'emoglobina.

L'aumento della densità ottica delle colture nel tempo indica che in N-R-P-M-I più E-D-D-H-A più hb, il tipo selvatico ASUS prolifera, ma il mutante no. Al contrario, la capacità di utilizzare il ferro libero integrato è identica sia nei ceppi wild type che in quelli mutanti, nessuno dei due prolifera in assenza di una fonte. In questo confronto di terreni integrati con emoglobina purificata da sangue fresco o emoglobina liofilizzata, l'emoglobina purificata dal sangue richiede ISDB per la crescita.

Mentre l'emoglobina liofilizzata consente la proliferazione del mutante ISDB Una volta padroneggiato, una corretta purificazione dell'emoglobina può essere completata in poche ore. Ricorda, i donatori sono potenziali portatori di agenti patogeni trasmissibili per via ematica, quindi tratta il sangue umano come un materiale a rischio biologico.