Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni In vivo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di attivare o silenziare rapidamente popolazioni neuronali geneticamente definite su una scala temporale fisiologicamente rilevante. Ciò si ottiene fornendo un vettore virale che trasporta transgeni che codificano l'opsina del canale di attivazione del neurone della luce blu o l'opsina di Hall del silenziamento del neurone della luce verde a neuroni geneticamente definiti. Come seconda fase, viene costruita una strada operativa a emissione di luce che consiste in una fibra ottica fissata a un elettrodo di registrazione, che consente l'erogazione simultanea della luce e la registrazione elettrica.

Successivamente, il TRO viene posizionato sopra e abbassato nella regione cerebrale trasdotta dall'Opsina. Al fine di evocare le risposte mediate dall'opsina canale e dall'opsina ha, si ottengono risultati che mostrano l'attivazione e l'inibizione indotta dalla luce dei neuroni trasdotti dal canale redsina e ha hallin sulla base della tecnica di registrazione a unità singola che consente la registrazione dei singoli neuroni. Questo metodo risponde a un'esigenza fondamentale delle neuroscienze permettendoci di determinare esattamente quanto la luce possa essere efficace nel guidare l'attività neuronale con risoluzione temporale di millisecondi e in specifici sottotipi neurali e dimostrarlo sarà Chin Nakamura.

Un postdoc nel mio laboratorio Assicurarsi che vengano seguite le procedure di biosicurezza di primo livello durante la preparazione e la manipolazione del virus e che vengano osservate tutte le linee guida locali e governative relative agli animali. Prima dell'iniezione stereotassica, lasciare che un'aliquota di virus si scongeli sul ghiaccio e poi girare brevemente verso il basso. In una centrifuga da banco, riempire lentamente una siringa di vetro Hamilton e un ago con una piccola quantità di silicone o olio minerale.

Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria visibili nel cilindro della siringa. Inserire la siringa in una micropompa iniettore e collegare la pompa direttamente al braccio stereotassico verticale. Dopo aver posizionato la provetta dell'aliquota del virus in una posizione stabile, abbassare il braccio stereotassico fino a quando la punta dell'ago tocca il fondo della provetta dell'aliquota del virus.

Utilizzare il controller per la pompa del micro iniettore per prelevare il volume desiderato di virus. Dopo aver anestetizzato un ratto con ketamina e xilazina, verificare la risposta riflessa a un pizzico di dita dei piedi per garantire un'adeguata profondità di anestesia utilizzando metodi asettici standard. Posizionare l'animale in un apparato stereotassico dopo aver praticato un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle sopra il cranio dell'animale con piccole forbici chirurgiche o bisturi.

Separare delicatamente il tessuto connettivo e pulire la parte superiore del cranio con un piccolo raschietto osseo. Abbassa l'ago e verifica che le coordinate Z per bgma e lambda siano uguali per stabilire che la testina sia a livello. Quindi sposta il braccio stereotassico sulle coordinate corrispondenti alla struttura cerebrale di interesse.

Contrassegnare il sito di iniezione previsto con una penna chirurgica. Usa un trapano a mano per assottigliare con cura il cranio sull'area bersaglio. Fermati quando la punta del trapano raggiunge la parte inferiore del cranio e usa un paio di pinze extra sottili per rimuovere l'osso assottigliato.

Dopo che la dura madre è stata esposta, posizionare l'ago della siringa sull'area target e abbassare l'ago fino a toccare la dura. E usa questo punto per calcolare lo z. Coordinare ora abbassare molto lentamente l'ago per iniezione nel cervello fino a raggiungere la corretta posizione Z.

In questo protocollo, viene presa di mira la regione pre limbica della corteccia prefrontale mediale. Iniettare il virus a una velocità di 0,1 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, attendere 10 minuti prima di ritirare l'ago per evitare il riflusso del virus sulla superficie del cervello.

Dopo aver usato una sutura da cucito con ago attaccato per sigillare la pelle, applicare antibiotici sulla ferita. Innanzitutto, collegare un elettrodo di tungsteno da 1,5 megaohm a un tubo capillare di vetro utilizzando la supercolla. Quindi utilizzare uno strumento di spelatura delle fibre per esporre l'estremità nuda di una fibra ottica multimodale e pulire leggermente la punta della fibra con etanolo.

Incidi la punta della fibra con un coltello diamantato a forma di cuneo e usa una pinza fine per rimuovere con cura la fibra in eccesso. La fibra dovrebbe attaccarsi facilmente al punteggio. Utilizzare un misuratore di potenza ottica per misurare l'intensità del laser sulla punta della fibra ottica.

Per le registrazioni in vivo, un'intensità luminosa compresa tra 20 e 100 milliwatt per millimetro quadrato può evocare in modo affidabile l'attivazione o il silenziamento mediati rispettivamente dal canale redsin o hallin dell'attività neuronale. Quindi, inserire la fibra ottica nel tubo capillare. Posizionare la punta della fibra a circa 500 micron sopra la punta dell'elettrodo di tungsteno e legare un filo di sutura sottile due volte in alcuni punti vicino alla punta in modo che l'elettrodo e la fibra siano dritti.

Assicurarsi che la distanza tra la punta dell'elettrodo e il nodo più vicino sia sufficientemente lunga per l'inserimento nella regione target come mostrato qui. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico come prima. Quindi usa la craniotomia iniziale come guida per creare una nuova, pulita, piccola finestra nel cranio.

Per il posizionamento del tro. Usa un ago sottile per fare una piccola incisione sulla dura dura. Abbassare con cautela il TRO attraverso la finestra del cranio e nel cervello fino alla regione trasdotta utilizzando un manipolatore microm.

Quindi avanza lentamente il fuoristrada con passi da 10 a 50 micron fino all'emergere di una cellula reattiva alla luce. Qui, un'interfaccia utente software personalizzata scritta in vista del laboratorio viene utilizzata per controllare il laser a diodo singolo e per visualizzare e registrare l'attività neurale in corso. I segnali registrati vengono acquisiti con un amplificatore passa-banda ex AMP 20 K filtrato da 0,3 a otto kilohertz e una scheda analogico-digitale di uno strumento nazionale.

L'interfaccia utente di neuro lux Pro consente la scelta di ingressi analogici e uscite digitali. Scegli due canali analogici per la logica a transistor neuronale e a transistor o il segnale TTL. Impostare la frequenza di campionamento a 20 kilohertz, il periodo di pre-illuminazione di base a due secondi e il periodo di post-illuminazione a due secondi.

Quindi impostare l'ampiezza, la frequenza e il periodo di stimolazione dell'impulso di stimolazione laser TTL. Qui la frequenza è di 20 hertz e il periodo di stimolazione è di 500 millisecondi, il che significa che vengono erogati 10 impulsi laser con larghezza di impulso definita. L'utente può scegliere tra l'emissione continua della luce o per registrazioni ripetute.

Possono scegliere l'intervallo tra gli impulsi e il numero di ceppi di impulsi. I dati possono essere acquisiti con o senza registrazione su disco Dopo la registrazione. L'animale viene sacrificato secondo le procedure approvate e il tessuto cerebrale viene processato per verificare il posizionamento dell'erosione e l'espressione dell'opsina, come mostrato qui.

Questa schermata dell'interfaccia software Neuro LX Pro configurata per l'erogazione simultanea di luce e la registrazione elettrofisiologica mostra il silenziamento indotto da Hall Rod Dobson dell'attività spontanea della cellula parametallica pre limbica rap in risposta a 10 secondi di erogazione continua di luce a 532 nanometri. Questa fotografia mostra l'espressione rappresentativa dell'hallo redsin nell'ulu dorsale. Lo schema a destra rappresenta il luogo in cui è stata scattata la fotografia.

La punta della freccia indica la posizione dell'elettrodo di tungsteno e la freccia indica la posizione della fibra ottica. Questa fotografia mostra l'espressione rappresentativa dell'opsina del canale nella corteccia prelimbica. Anche in questo caso, lo schema a destra rappresenta il luogo in cui è stata scattata la fotografia.

La punta della freccia indica la posizione dell'elettrodo di tungsteno e la freccia indica la posizione della fibra ottica. Questo esempio di traccia registrata dalla corteccia pre limbica di ratto mostra il canale rosso in due potenziali d'azione attivati in risposta all'erogazione di 20 hertz di blu a 473 nanometri, impulsi luminosi per 10 millisecondi ciascuno, come indicato dalla barra blu. Sotto. Il grafico raster mostra lo spiking indotto dalla rosina del canale in sei neuroni rappresentativi.

Ogni attività unitaria viene tracciata come un punto. Questa traccia di esempio mostra la soppressione dell'attività spontanea indotta dall'opsina di Hall durante l'illuminazione continua della luce verde a 532 nanometri per 10 secondi, come indicato dalla barra verde nella stessa regione del cervello. Il grafico raster mostra il silenziamento indotto dalla dosina di Haller in sei neuroni rappresentativi.

Ogni attività unitaria viene tracciata come un punto. Questa immagine mostra il picco ripetitivo guidato dall'opsina del canale a 20 hertz di un neurone parametallico pre limpico di ratto in vivo tracce di tensione della luce evocata, picco, acquisite nei punti temporali 0, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'inizio delle registrazioni sono visualizzate sul lato sinistro. Sul lato destro, il grafico raster mostra tutte le 61 ripetizioni dell'attivazione indotta dalla luce.

Ogni attività unitaria viene tracciata come un punto. Qui in vivo, le registrazioni elettrofisiologiche del sicm dorsale di ratto trasdotto da Haller Dossin sono mostrate in alto. La traccia di esempio dimostra che l'illuminazione continua di 10 secondi a 532 nanometri indicata dalla barra verde del subm dorsale che esprime Hall Dobson elimina l'attività spontanea.

Di seguito sono riportate le forme d'onda medie delle due unità registrate dalla traccia sopra. La soglia di ampiezza è stata utilizzata per identificare due neuroni distinti. Infine, il grafico raster mostra cinque ripetizioni del silenziamento indotto dalla dossina di Haller di queste unità.

Ogni attività unitaria viene tracciata come un punto. Infine, questa immagine mostra il picco ripetitivo guidato dall'opsina del canale a 20 hertz di un neurone subulare dorsale di ratto in tracce di tensione della luce evocata, il picco, acquisito nei punti temporali 0, 30, 60, 90 e 120 minuti. Dopo che l'inizio delle registrazioni è stato mostrato a sinistra, il riquadro sottostante mostra l'attività di scoppio tipica di questa cella.

Il grafico raster a destra mostra tutte le 61 ripetizioni dell'attivazione indotta dalla luce. Ogni attività unitaria viene tracciata come un punto. Questa tecnica è importante perché dimostra che specifici sottotipi neurali possono essere attivati o silenziati per lunghi periodi di tempo.

In effetti, abbiamo dimostrato che possiamo attivare i neuroni per oltre due ore e applicato. In definitiva, l'obiettivo sarebbe quello di applicare questo all'animale che si comporta negli animali che svolgono compiti di attenzione o di memoria, in modo da poter attivare circuiti specifici e vedere come questo controlla le diverse funzioni della memoria.