Name: Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Scopri l'etichettatura mirata di neuroni nel neocorteccia combinando imaging del segnale intrinseco e microscopia a due fotoni. Questo metodo consente di studiare la struttura e la funzione neuronale ad alta risoluzione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e finanziamento da parte delle Fondazioni Dana &amp; Whitehall a PK Ringraziamo Matteo Petrella per l&#39;assistenza alle procedure chirurgiche, Grazia Dion a rintracciare i dendriti illustrato nella figura 5a e Pratik Chhatbar per commenti sul manoscritto.

1. Preparazione chirurgica <ol><li> Indurre l&#39;anestesia e monitorare la frequenza cardiaca, terminare CO marea 2, EEG, e la temperatura. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Medical University of South Carolina e si basano su quelle che abbiamo precedentemente pubblicato con il 9,15. </li><li> Esporre la superficie dorsale del cranio tagliando la pelle con una lama da bisturi. Staccare il tessuto connettivo sovrastanti l&#39;osso con una curette Brudon. Pulire l&#39;osso con applicatori di cotone con punta e garza di cotone. Applicare la cera ossea (se necessario) al cranio, per arrestare l&#39;emorragia occasionale attraverso piccole vene emissario. </li><li> Collegare un titanio o acciaio piastra di testa in acciaio al cranio (sopra la regione di interesse in cui la craniotomia verrà eseguita) utilizzando cemento dentale mescolato con vernice nera (vedi Materiali). Una apertura rettangolare al centro della piastra di testa fornisce l&#39;accesso per la craniotomia e imaging ottico. Allegare una camera metallica sulla parte superiore della piastra di testa. Questa camera servirà come un serbatoio di fluido per l&#39;imaging con la lente obiettivo immersione in acqua. </li><li> Fissare la piastra di testa per una fase xy con perni in metallo. </li><li> Assottigliare una vasta area dell&#39;osso entro l&#39;apertura rettangolare della piastra di testa utilizzando un trapano dentistico. L&#39;area deve essere diluito deve estendersi ben oltre i confini della craniotomia previsto. Il cranio di spessore non roditori mammiferi deve essere diluito se immagini ad alta risoluzione sono da acquisire dalla neocorteccia perché al sito craniotomia, lo spessore dell&#39;osso detterà lo spessore del agarosio tra la superficie e coverglass neocorticale (vedi sotto) . </li><li> Praticare un 2 x 2 mm quadrati contorno nell&#39;osso per la craniotomia. Sciacquare la camera periodicamente con fresco liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per rimuovere frammenti ossei e ridurre al minimo la dissipazione del calore verso la corteccia sottostante. Applicare la cera ossea, se necessario, per fermare le emorragie occasionali. </li><li> Lift il lembo osseo con una pinza # 3. </li><li> Rimuovere tutti, ma il livello più basso di durata con una multa pinza (# 5CO) e forbici a molla Vännäs. La dura madre non roditori mammiferi è spessa e opaca, ma può essere rimossa in strati distinti. Il sanguinamento è raro, ma può essere fermato con Gelfoam e gli eventuali residui di sangue dovrebbe essere delicatamente rimosso dallo strato residuo di durata uso di pinze e risciacquo con ACSF. Lo strato finale di dura è trasparente e vasi piali deve essere chiaramente visibile attraverso di essa. Lasciare questo strato finale di dura intatto durante l&#39;esposizione del segnale intrinseco aumenterà il tasso di successo di caricamento di massa di indicatori di calcio fluorescenti per la successiva a due fotoni di imaging fase dell&#39;esperimento (vedi Discussione). </li><li> Applicare una goccia di caldo agarosio al 2% (sciolto in ACSF) e collocare immediatamente il coprioggetti sopra la craniotomia. Controllare la craniotomia per garantire che le pulsazioni respiratorie e cardiovascolari sono minime utilizzando un microscopio da dissezione chirurgica o gli oculari di duefotone microscopio in campo chiaro modalità. </li></ol> 2. Intrinseca del segnale ottico Imaging <ol><li> Aggiungere gel-schiuma imbevuta con ACSF intorno all&#39;esterno del coprioggetto per evitare l&#39;agarosio si secchi durante l&#39;imaging segnale intrinseco. </li><li> Fissare la fotocamera intrinseca un elaboratore di immagini CCD allo standard C-mount porta sulla parte superiore del microscopio a due fotoni (Figura 1). Posizionare la sorgente di luce illuminante sul tavolo aria vicino alla fase xy (Figura 1A). Posizionare e fissare le guide di luce oltre la craniotomia e piastra di testa / camera (Figura 1B). Ritrarre il dicroico primario e lo specchio di sotto del C-mount porta in modo che la luce riflessa rossa necessaria per segnali intrinseci passerà direttamente dalla craniotomia alla telecamera CCD (Figura 1C-D). Utilizzando l&#39;obiettivo 4x aria (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm Campo di vista è disponibile per l&#39;imaging del segnale intrinseco. </li><li> Inserire un filtro di calore nel light percorso per impedire la corteccia di riscaldamento. Utilizzare un filtro che lascia passare la luce verde (546 nm centro λ) e registrare l&#39;immagine digitale di riferimento dei vasi sanguigni superficiali corticali. </li><li> Spostare lo stato attivo z a 500 micron sotto la superficie corticale. Utilizzare un filtro rosso (630 nm centro λ) per illuminare la corteccia per la misurazione dei segnali intrinseci. Posizionare le guide di luce in modo tale che la superficie corticale è uniformemente illuminata. Proteggere la craniotomia della luce prodotta dal display stimolo visivo. Presentare una sequenza di stimoli visivi e registrare immagini dati di riflettanza. Per generare una mappa di orientamento entro 10 min, raccogliere dati corrispondenti a quattro ripetizioni di una sequenza di 8 stimoli (4 orientamenti e due direzioni per ciascun orientamento). </li><li> Analizzare i dati del segnale intrinseco di generare una falsa mappa di orientamento a colori. Selezionare le regioni potenziale bersaglio per due fotoni etichettatura dei neuroni, ad esempio, l&#39;orientamento singolarità pinwheel - punti della mappa in cuitutte le orientazioni preferenziali convergono (Figura 2A). Sovrapporre la mappa orientamento e l&#39;immagine della vascolarizzazione superficie corticale (Figura 2B-C). Utilizzare il layout di domini funzionali e la posizione di navi di superficie di grandi dimensioni per selezionare una destinazione, evitando luoghi in cui i grandi vasi sanguigni e arteriole 15. </li></ol> 3. Caricamento di massa degli indicatori di calcio fluorescenti <ol><li> Preparare una soluzione di 20% Pluronic / DMSO aggiungendo 1 g di Pluronic in DMSO 5 microlitri. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 minuti per sciogliere completamente il Pluronic. Permettere alla miscela di raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 4 microlitri della Pluronic / DMSO miscela una fiala 50 mg dell&#39;indicatore calcio fluorescente verde Oregon 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Poi aggiungere 1 ml di un colorante rosso (Alexa 594, 2 mM soluzione stock) e 35 pl di soluzione di pipetta (vedi Materiali) per una concentrazione finale di 1 mM OGB-1 AM. Sonicare la soluzione per ½ ora inun bagno di acqua fredda, quindi si centrifuga con 0,45 micron filtro per rimuovere le impurità. </li><li> Tirare una pipetta lunga cono con un diametro esterno di punta 2,0-2,5 micron. Caricare 5 microlitri della miscela colorante nella pipetta. </li><li> Rimuovere lo strato finale di dura per facilitare l&#39;inserimento pipetta e ottenere la più alta qualità a due fotoni immagini. </li><li> Determinare l&#39;esatta posizione sulla superficie corticale che la pipetta deve essere posizionato in modo da raggiungere l&#39;obiettivo in strato corticale 2/3. Il nostro obiettivo predeterminato corticale è una singolarità girandola nella mappa di orientamento (Figura 2). La pipetta deve essere guidato nella corteccia di un angolo di 30 ° per passare tra le pareti della camera e l&#39;obiettivo. Così, per etichettare la regione bersaglio 200 micron sotto la superficie corticale, la posizione di ingresso pipetta sulla superficie corticale sarà di circa 350 micron laterali alla posizione di destinazione (Figura 3 AB). </li><li> Spostare la fase di xy (su cui l&#39;animale e il pmicromanipolatore ipette sono posti) al centro della superficie corticale posizione di ingresso nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo (Figura 3C). Utilizzare un obiettivo 20x o 40x con una distanza di lavoro (WD) di almeno 3 mm (vedi Materiali) per assicurare che la pipetta facilmente inserire la corteccia senza toccare l&#39;obiettivo o l&#39;osso lungo la parete della craniotomia. Una volta che la posizione di ingresso è centrata sotto l&#39;obiettivo, sollevare la posizione Z dell&#39;obiettivo da 2 mm (Figura 3D). Con l&#39;epi-fluorescenza verde chiaro acceso per visualizzare il rosso Alexa colorante nella pipetta, utilizzare l&#39;asse diagonale del micromanipolatore per spostare la pipetta fino a quando la punta è centrato (e concentrata) a titolo dell&#39;obiettivo direttamente sopra l&#39;ingresso della superficie corticale ( Figura 3E). </li><li> Abbassare la pipetta verticalmente (lungo l&#39;asse Z) fino alla pipetta raggiunge la superficie corticale (Figura 3F), mentre continua la visualizzazione della punta della pipetta attraverso l&#39;OCUlars del microscopio. Utilizzo in campo chiaro di illuminazione, le corticali vasi sanguigni superficiali e rimanenti membrane meningee (pia e aracnoide) sono facilmente visibili come la pipetta si avvicina alla superficie corticale. Se la pipetta non raggiunge la posizione desiderata, sollevare la pipetta e ricalibrare il targeting in base ai punti di riferimento vascolari sulla superficie corticale. </li><li> Rimuovere l&#39;obiettivo, stoppino eccesso di liquido cerebrospinale dalla craniotomia e asciugare l&#39;osso adiacente, con panno-free lance di assorbimento. Applicare una goccia di calda 3% agarosio (disciolto in ACSF) per stabilizzare la corteccia che è visibile attraverso la craniotomia (figura 3G). Nei non roditori, 3% agarosio è necessario smorzare pulsazioni per l&#39;assorbimento efficace di coloranti fluorescenti da neuroni. Per l&#39;imaging ottico di segnale intrinseco solo il 2% di agarosio è necessaria in quanto la combinazione di agarosio al 2% e il coprioggetto offre la stabilità necessaria. Qui, non coverglass viene utilizzato per il colorante di caricamento passo così agarosio al 3% ènecessario. Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, inserire un obiettivo 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e ri-riempire la camera con ACSF. </li><li> Passare dal campo chiaro a due fotoni visualizzazione e individuare la punta della pipetta. Utilizzando l&#39;asse diagonale del micromanipolatore, spostare la pipetta finché la punta raggiunge la profondità desiderata nella corteccia (figura 3H). Occasionali sbuffi di pressione di espulsione della miscela colorante (una psi pochi, ogni impulso 0,1 sec), aiuta a prevenire la punta della pipetta da intasamento. Poiché OGB-1:00 diventa visibile solo entrando cellule, il colorante rosso Alexa è critico per la visualizzazione della punta della pipetta all&#39;interno della corteccia. </li><li> Prima di caricare i neuroni in strato corticale 2/3 con l&#39;intera dose di colorante, rifocalizzare l&#39;obiettivo sulla superficie corticale per confermare la profondità della punta della pipetta e garantire che la punta si trova nella posizione di destinazione sulla base del layout di vasi sanguigni superficiali. Se la pipetta è nel livello 2/3, piccoli sbuffi di miscela colorante dovrebbe illuminare l&#39;spazio extracellulare e rivelano un gruppo denso di corpi cellulari circolari come ombre scure. </li><li> Per caricare corpi cellulari neuronali in una sfera di corteccia 300-600 micron di diametro, iniettare la miscela colorante nello spazio extracellulare usando 30-90 impulsi, ogni impulso 1,0 sec, 2-10 psi. Gli impulsi di pressione non dovrebbe essere così forte che il tessuto si muove. Dopo l&#39;iniezione è stata completata, attendere pochi min, quindi rimuovere la pipetta e obiettivo. Attendere 1 ora per consentire il OGB-1 AM per essere prese pienamente-up dai neuroni. </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio utilizzata per il carico colorante e lavare la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di 2-3% agarosio in superficie e rapidamente mettere un coprioggetti sopra la craniotomia. Poiché i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce, evitare di sovraesporre la corteccia di campo chiaro o epi-fluorescente. Inserire un elevato NA (1.0) 20x obiettivo nel supporto obiettivo e ricentrare la regione corticale etichettata nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo utilizzando la fase di xy. Proteggere la craniotomia da exfonti di luce traneous, ad esempio, la visualizzazione stimolo visivo, utilizzando strati multipli di materiale blackout. </li></ol> 4. Single-cell Elettroporazione di coloranti fluorescenti <ol><li> Per studiare la morfologia dendritica, preparare una soluzione di 100 mM Alexa Fluor 594 (diluizione 1:20 in ACSF di 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Per l&#39;imaging funzionale di dendriti un sale OGB può essere utilizzato 16,17. </li><li> Tirare una pipetta lunga cono con dimensioni ugello di 1 um e caricare 5 microlitri di colorante nella pipetta. Tutte le altre fasi di mira un dominio funzionale è identico al metodo di caricamento bulk (Figure 1-3). Per posizionare la punta della pipetta adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, monitorare l&#39;aumento dell&#39;impedenza dell&#39;elettrodo ed applicare pressione sbuffi di colorante ad illuminare lo spazio extracellulare e vedere corpi cellulari come ombre durante due fotoni imaging. </li><li> Quando la punta della pipetta è adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, utilizzare l&#39;800A Axoporator applicareImpulsi 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms di impulso). Il riempimento immediato del neurone con colorante è facilmente visualizzato con microscopia a due fotoni. Rimuovere la pipetta e raccogliere immagini ad alta risoluzione dei dendriti e degli assoni in vivo. </li></ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per indirizzare l&#39;etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l&#39;esper...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Supporto Life / esperimento prep </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporizzatore isoflurano </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Commenti termocoperta regolamentato </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Monitor ECG </td><td> Digicare biomedica </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore EEG </td><td> AM Sistemi </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> End tidal CO 2 monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Ottimizzare la ventilazione </td></tr><tr><td> Bave trapano in metallo duro per ossa foratura </td><td> Henry Schein </td><td> bene (0,5 punta mm) e grosso (1,25 punta mm) </td><td></td></tr><tr><td> Cemento per piastra di testa / camera </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Nero Polvere Tempera Vernice </td><td> Sargent Art Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> Aggiungi al cemento per migliorare la luce schermatura e ridurre i riflessi </td></tr><tr><td> Agarosio - Tipo III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Per ridurre al minimo le pulsazioni durante il segnale intrinseco e due fotoni di imaging </td></tr><tr><td> Vetrino: 5 o 8 mm di diametro, 0,17 mm di spessore </td><td> Mondo Precisionstruments </td><td> 502040, 502041 </td><td> Per ridurre al minimo le pulsazioni durante l&#39;esposizione, il coprioggetto può essere tagliato in base alle esigenze </td></tr><tr><td> Brudon curette </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Pulizia della superficie del cranio </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidamente fermare l&#39;emorragia </td></tr><tr><td> Punta in cotone Applicatore </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 72308-05 </td><td> Osso superficie pulita ed asciutta </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Prendete singoli strati di durata o di pia </td></tr><tr><td> Vannas Primavera Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Per arrestare l&#39;emorragia sulla durata </td></tr><tr><td> Assorbimento lance</td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18105-01 </td><td> Assorbimento ultra-veloce e privo di lanugine di CSF </td></tr><tr><td> Blackout materiale </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Scudo craniotomia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Tingere preparazione / iniezione </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde 488-Bapta 01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicatore di calcio </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro centrifugo (dimensione dei pori 0,45 um) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Per rimuovere le impurità prima dell&#39;iniezione </td></tr><tr><td> Pipetta di vetro estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato filamented capillare (1,5 mm di diametro esterno) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B150F-4 </td><td> Espulsione pipetta Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Per il caricamento colorante in pipetta </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Per posizionare pipetta </td></tr><tr><td> Pressione a impulsi </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Per pressione di iniezione del colorante </td></tr><tr><td> Single-cell elettroporatore </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Per elettroporazione del colorante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinseca imaging </td></tr><tr><td> Obiettivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrinseca hardware / software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ software viene utilizzato per l&#39;imaging episodica </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Luce sorgente di alimentazione </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Sorgente di luce </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> L&#39;intensità della luce sulla superficie corticale di 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtro verde (per l&#39;immagine vascolare) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (banda passante 30 nm) </td><td> Per un&#39;immagine di riferimento di vascolarizzazione superficiale </td></tr><tr><td> Filtro rosso (per segnale intrinseco) </td><td> Ottica Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (banda passante 30 nm) </td><td> Per raccogliere segnali intrinseci </td></tr><tr><td> Calore filtro </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Due-fotone rig / immagini </td></tr><tr><td> Microscopio a due fotoni e software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Vedi Shen et al. 2012 per percorso della luce, filtri e potenza del laser </td></tr><tr><td> Ti: zaffiro laser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 obiettivo NA viene utilizzata solo per l&#39;allineamento pipetta sul craniotomia (non per l&#39;imaging due fotoni) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Air tavolo </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isola preparazione da vibrazioni esterne </td></tr><tr><td> xy fase </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Soggetto sperimentale e micromanipolatore Sutter posto sul palco xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Ricette </td></tr><tr><td> Artificiale liquido cerebro-spinale </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Pipettare Soluzione 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni imaging

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l&#39;orientamento 1-4, direzione 5-7, dominanza oculare 8,9 e disparità binoculare 9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l&#39;orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria 10,11. L&#39;integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l&#39;ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l&#39;imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato 12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli 13 o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali 6,14. Di conseguenza, combinando l&#39;imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l&#39;etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l&#39;imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l&#39;imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l&#39;etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l&#39;etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.

Per illustrare la precisione dei nostri metodi di etichettatura tinture, abbiamo mirato più piccolo micro-dominio di qualsiasi mappa noto funzionale nella neocorteccia non roditore. Scarsamente punteggiato tutta la mappa di orientamento nella corteccia visiva primaria sono singolarità. Questi si verificano nei punti in cui convergono tutte le orientazioni preferenziali in modo tale che nelle mappe in falsi colori di orientamento preferenziale, le regioni intorno l&#39;aspetto singolarità come &quot;girandole&quot; <stro...

Un metodo è descritto per l&#39;etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l&#39;etichetta e neuroni di immagine all&#39;interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare con precisione i micro domini in una mappa funzionale per studiare la struttura e la funzione dei neuroni ad alta risoluzione. Ciò si ottiene eseguendo prima l'imaging del segnale intrinseco su un'ampia area della corteccia per ottenere una mappa della caratteristica dello stimolo di interesse. Il secondo passo consiste nel determinare la posizione precisa nella mappa che deve essere indirizzata per l'imaging ad alta risoluzione dei fotoni.Successivamente, dopo aver posizionato con cura la pipetta caricata con colorante fluorescente, i neuroni vengono etichettati con il marcatore fluorescente. Infine, vengono raccolte immagini ad alta risoluzione di fotoni di risposte o strutture neuronali. In definitiva, una mappa delle caratteristiche del segnale intrinseco può essere utilizzata per trovare una regione di interesse, come una singolarità della girandola di orientamento che può quindi essere mirata per lo studio alla risoluzione di un singolo neurone.Il vantaggio principale di questo protocollo è che è possibile visualizzare la corteccia a diverse scale spaziali utilizzando la stessa configurazione del microscopio con

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

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Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati...

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo per la registrazione simultanea dei segnali di calcio provenienti da neuroni e astrociti attraverso molteplici regioni cerebrali legate alla memoria e ne dimostra l'applicazione durante un paradigma di apprendimento e comportamento della memoria.

Un metodo di fotometria a fibre a doppio colore per registrare l'attività degli astrociti-neuroni in più regioni cerebrali durante l'apprendimento e i comportamenti di memoria

Scopri l'etichettatura mirata di neuroni nel neocorteccia combinando imaging del segnale intrinseco e microscopia a due fotoni. Questo metodo consente di studiare la struttura e la funzione neuronale ad alta risoluzione.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging (Video) | JoVE Journal

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

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