Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare con precisione i micro domini in una mappa funzionale per studiare la struttura e la funzione dei neuroni ad alta risoluzione. Ciò si ottiene eseguendo prima l'imaging del segnale intrinseco su un'ampia area della corteccia per ottenere una mappa della caratteristica dello stimolo di interesse. Il secondo passo consiste nel determinare la posizione precisa nella mappa che deve essere indirizzata per l'imaging ad alta risoluzione dei fotoni.

Successivamente, dopo aver posizionato con cura la pipetta caricata con colorante fluorescente, i neuroni vengono etichettati con il marcatore fluorescente. Infine, vengono raccolte immagini ad alta risoluzione di fotoni di risposte o strutture neuronali. In definitiva, una mappa delle caratteristiche del segnale intrinseco può essere utilizzata per trovare una regione di interesse, come una singolarità della girandola di orientamento che può quindi essere mirata per lo studio alla risoluzione di un singolo neurone.

Il vantaggio principale di questo protocollo è che è possibile visualizzare la corteccia a diverse scale spaziali utilizzando la stessa configurazione del microscopio con solo poche regolazioni rapide del sistema. Ciò consente di combinare queste tecniche per utilizzare la mappa del segnale intrinseco della risoluzione del corso come guida per la scelta di una regione di neuroni da etichettare con sonde fluorescenti per l'imaging ad alta risoluzione. L'animale è stato anestetizzato secondo un protocollo istituzionale approvato dal comitato per la cura degli animali e il cranio è stato esposto e pulito.

La miscela di cemento dentale è stata utilizzata per fissare al cranio una piastra di testa in acciaio inossidabile con un'apertura rettangolare al centro. Una camera metallica sulla parte superiore della piastra di testa funge da serbatoio per l'imaging con la lente dell'obiettivo a immersione in acqua. La piastra di testa è stata fissata su uno stadio XY utilizzando perni metallici.

Usa un trapano dentale per assottigliare un'ampia area di osso all'interno dell'apertura rettangolare della piastra della testa. L'applicazione di cere ossee è necessaria per fermare il sanguinamento occasionale. L'area sottile deve estendersi oltre i confini della craniotomia prevista.

Quindi praticare un contorno quadrato di due millimetri per due nell'osso per la craniotomia. Sciacquare periodicamente la camera con liquido cerebrospinale artificiale fresco per rimuovere i frammenti ossei e ridurre al minimo la dissipazione del calore nella corteccia sottostante. Ora, solleva l'osso con una pinza numero tre.

Usa una pinza numero cinque e le forbici a molla Vana per rimuovere gli strati superiori della dura, lasciando intatto lo strato inferiore. Lo strato finale di dura madre è trasparente e i vasi di pelatura dovrebbero essere chiaramente visibili attraverso di esso. Applicare una goccia di aero caldo al 2% disciolto in A CSF e posizionare immediatamente un vetro di copertura sopra la craniotomia.

Innanzitutto, una schiuma gel imbevuta di A CSF attorno all'esterno del vetro di copertura per evitare che gli agro si secchino durante l'imaging del segnale intrinseco. Quindi collegare la fotocamera CCG per l'imaging a segnale intrinseco alla porta C mount standard sulla parte superiore dei due fotomicroscopi e posizionare una fonte di luce illuminante sul tavolo d'aria vicino alla posizione del tavolino XY e fissare la guida di luce sopra la craniotomia. Ritrarre il dicroico primario e lo specchio al di sotto della porta del monte sottomarino in modo che la luce rossa riflessa necessaria per i segnali intrinseci passi direttamente dalla craniotomia alla telecamera CCD.

Inserire un filtro a infrarossi nel percorso della luce per evitare che la corteccia si riscaldi. Quindi posizionare un filtro che passa la luce verde e registrare un'immagine di riferimento digitale dei vasi sanguigni della superficie corticale. Quindi, sposta il fuoco Z a 500 micron sotto la superficie corticale.

Sostituisci il filtro verde con un filtro rosso per illuminare la corteccia per misurare i segnali intrinseci. Assicurarsi che la corteccia sia illuminata in modo uniforme. Proteggere la craniotomia dalla luce prodotta dal display dello stimolo visivo e presentare una sequenza di stimoli visivi e registrare immagini di dati di riflettanza per generare una mappa di orientamento Entro 10 minuti, raccogliere i dati corrispondenti a quattro ripetizioni di una sequenza di otto stimoli con quattro orientamenti e due direzioni per ciascun orientamento.

Ora analizza i dati intrinseci del segnale per generare una mappa a colori di falso orientamento come mostrato qui. Quindi selezionare le potenziali regioni bersaglio per la marcatura di due fotoni dei neuroni. Ad esempio, le singolarità della girandola di orientamento indicano nella mappa i punti in cui convergono tutti gli orientamenti preferiti.

Successivamente, sovrapponi la mappa di orientamento e l'immagine della vascolarizzazione della superficie corticale e utilizza la disposizione dei domini funzionali e la posizione dei grandi vasi superficiali per selezionare un bersaglio, evitando posizioni con grandi vasi sanguigni e arteriosi. Preparare le soluzioni fluorescenti D e tirare una pipetta a cono lungo secondo le istruzioni del protocollo scritto. Caricare cinque microlitri della miscela di colorante nella pipetta.

Quindi rimuovere lo strato finale di dura madre per facilitare l'inserimento della pipetta e ottenere immagini a due fotoni della massima qualità, come illustrato in questo diagramma. La pipetta deve essere inserita nella corteccia con un angolo di 30 gradi per passare tra la camera e l'obiettivo. Pertanto, la posizione della superficie corticale della posizione di ingresso della pipetta non sarà direttamente sopra la regione di interesse mirata.

Ad esempio, per etichettare una regione target a 200 micron sotto la superficie corticale, la posizione di ingresso della pipetta sulla superficie corticale sarà di circa 350 micron lateralmente alla posizione target. Spostare lo stadio XY per centrare la posizione di ingresso della superficie corticale sotto l'obiettivo 20 x o 40 x. Una volta centrata la posizione di ingresso sotto l'obiettivo, aumentare la posizione Z dell'obiettivo di due millimetri.

Quindi accendere la luce verde di epifluorescenza e visualizzare il colorante Alexa rosso nella pipetta e spostare la pipetta fino a quando la punta non si trova al di sopra della posizione di ingresso della superficie corticale. Durante la visualizzazione del puntale della pipetta attraverso gli oculari del microscopio con illuminazione a campo chiaro, abbassare la pipetta fino a raggiungere la posizione di ingresso desiderata sulla superficie corticale. Quindi, rimuovere l'obiettivo e utilizzare lance di assorbimento prive di lanugine per assorbire il liquido cerebrospinale in eccesso dalla craniotomia e asciugare l'osso adiacente.

Quindi applicare una goccia di 3% caldo di riso, sciolto in A CSF per stabilizzare la corteccia. Una volta che l'aros si è solidificato, inserire un obiettivo 40 x e riempire nuovamente la camera con un liquido cerebrospinale. Successivamente, utilizzare l'asse diagonale del micromanipolatore per spostare la pipetta fino a quando la punta non raggiunge la profondità desiderata nella corteccia.

Occasionali sbuffi di espulsione a pressione della miscela DI ridurranno la probabilità che la punta della pipetta si ostruisca quando la pipetta raggiunge lo strato due, tre piccoli sbuffi della miscela DI illumineranno lo spazio cellulare extra e riveleranno un denso assemblaggio di corpi cellulari circolari come ombre scure per caricare i corpi neuronali in una sfera di corteccia da 300 a 600 micron di diametro. Iniettare la miscela Dix nello spazio extracellulare utilizzando da 30 a 90 impulsi. Ogni impulso un secondo, da due a 10 PSI.

Al termine dell'iniezione, attendere qualche minuto, quindi rimuovere la pipetta e l'obiettivo. L'indicatore fluorescente di calcio sarà completamente assorbito dai neuroni in un'ora. Infine, rimuovere gli aros utilizzati per il download e risciacquare la camera di registrazione.

Mettere una piccola goccia dal 2 al 3% di rosa sulla superficie e posizionare rapidamente un vetro di copertura sopra la craniotomia. Inserire un obiettivo ad alto NA 20 x nel supporto dell'obiettivo e ricentrare la regione corticale etichettata sotto l'obiettivo. Utilizzando lo stadio XY, proteggi la craniotomia da fonti di luce estranee e raccogli immagini ad alta risoluzione dei neuroni marcati in vivo.

In alternativa, l'elettroporazione a singola cellula può essere utilizzata per studiare la morfologia dendritica o l'imaging funzionale dei dendriti. In questa metodologia, le DI vengono preparate secondo il protocollo scritto. Quindi, nel punto appropriato della procedura, la punta della pipetta viene posizionata adiacente a una membrana del corpo cellulare neuronale e viene utilizzato un axo per applicare da uno a tre impulsi.

L'immediato riempimento del neurone con il colorante è facilmente visualizzabile con la microscopia a due fotoni. Questa immagine mostra un'area di imaging a due fotoni che mostra i corpi cellulari marcati con l'indicatore di calcio fluorescente OGB 1:00 AM nello strato di corteccia visiva due tre, la barra della scala rappresenta 100 micron. Questa immagine mostra la preferenza di orientamento dei singoli corpi cellulari neuronali dallo stesso sito mostrato nell'immagine precedente.

Una mappa organizzata dell'orientamento preferito dello stimolo è visibile attorno alla singolarità della girandola che era centrata nella regione dell'immagine. Qui vediamo la mappa di orientamento ottenuta con l'imaging del segnale intrinseco. Il quadrato nero corrisponde alla regione mostrata nell'immagine precedente a due fotoni.

Questa immagine mostra i dendriti e il corpo cellulare di un singolo neurone sovrapposti alla mappa di orientamento. Il neurone è stato elettroporato con Alexa floor 5 94 sotto la guida di due fotoni. Poiché lo stack Z è stato raccolto in vivo e i processi dendritici sono stati tracciati offline utilizzando neuro lucid come software.

La mappa di orientamento è stata ottenuta utilizzando l'imaging del segnale intrinseco prima dell'elettroporazione a singola cellula. La barra della scala rappresenta 100 micron. Questa proiezione Z di 10 micron dallo strato corticale uno mostra dendriti apicali.

Le frecce rosse mostrano spine lungo i dendriti, mentre queste proiezioni Z di 10 micron dallo strato corticale due mostrano dendriti basali con spine indicate da frecce rosse e assoni indicati da frecce bianche. Questo metodo è utile per studiare le mappe funzionali nella corteccia a diverse scale spaziali e per indirizzare con precisione i neuroni in uno specifico dominio di interesse. All'interno della mappa, abbiamo dimostrato l'applicazione del metodo per esaminare le mappe selettive di orientamento, ma può essere esteso ad altre mappe di caratteristiche visive come la retina, il toppy, la dominanza oculare e la direzione, o ad altre modalità sensoriali che hanno mappe organizzate funzionalmente come quelle che codificano la sensazione di somato o l'udito.