Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Questa dimostrazione mira a visualizzare proteine marcate in fluorescenza in cellule vive in una matrice 3D A. In primo luogo, generare linee cellulari stabili che esprimono proteine marcate in modo fluorescente. Semina queste cellule in una matrice di collagene 3D, quindi acquisisci immagini time-lapse delle cellule in migrazione utilizzando un microscopio confocale.

In definitiva, i risultati illuminano la localizzazione e la dinamica delle proteine all'interno delle cellule in migrazione attraverso l'imaging time-lapse e l'analisi FP, osservando la dinamica e la localizzazione delle proteine in 3D e in tempo reale. Offre una strada per affrontare le questioni fondamentali nella migrazione cellulare. Ad esempio, in che modo i contatti adesivi sono regolati dalle proteine citoplasmatiche?

E anche in che modo questi contatti sono perturbati da inibitori specifici. In una piastra P 35, le cellule di coltura all'80-90% di fluenza di co, trasfettano le cellule con il plasmide di interesse utilizzando lipo 2000 secondo le istruzioni del produttore. Quindi posizionare le cellule in un incubatore.

Il giorno successivo, dividere le cellule in due piastre di Petri da 50 e incubare per una notte. Reintegrare il terreno per aggiungere 50 microgrammi per millilitro di G quattro 18. Continuare la coltura sotto selezione antibiotica per due settimane.

Esamina la coltura per le colonie resistenti G quattro 18. Quindi utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Identificare e contrassegnare le colonie GFP positive.

Lavare le celle due volte con PBS. Dopo il secondo lavaggio, lasciare un sottile strato di liquido per evitare che le cellule si secchino per ogni colonia contrassegnata. Strofinare il più vicino possibile al bordo con un batuffolo di cotone sterilizzato e pipettare 10 microlitri di tripsina sulla colonia.

Ripeti rapidamente per ogni colonia. Quindi incubare la piastra a 37 gradi centigradi per il distacco delle cellule. Verificare l'aspetto rotondo al microscopio.

Aggiungere 10 microlitri di tripsina su ogni colonia, pipettare per staccare completamente le cellule dalla piastra. Quindi trasferire ogni colonia di cellule in un singolo pozzetto di una coltura di 24 pozzetti per amplificare le colonie stabili. Successivamente, valutare l'espressione proteica delle colonie utilizzando il western blot standard e l'immunofluorescenza.

Espandi le linee cellulari selezionate, modifica della superficie del vetro. Il piatto inferiore offre un legame ottimale del collagene. Pipettare 300 microlitri di soluzione di siloizzazione sulla porzione di vetro di ogni piatto P 35 con un'apertura di 10 millimetri.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione e lavare con acqua filtrata tre volte per 10 minuti ciascuna. Togliete l'acqua e mettete i piatti su una piastra calda a 50 gradi centigradi per 1,5 ore.

Posizionare la parte superiore dei piatti leggermente fuori dal piatto per consentirne l'asciugatura. Dopo che i piatti asciutti si sono raffreddati, pipettare 300 microlitri di soluzione di glutaraldeide al 2% sulla parte di vetro di ogni piatto. Incubare per un'ora, quindi lavare con PB S3 volte per 10 minuti ciascuna.

Procedere alla sterilizzazione delle stoviglie mediante esposizione alla luce UV per un'ora. Primo pellet 100 microlitri di particelle traccianti fluorescenti per centrifugazione. Scartare il liquido e risospendere le particelle in 500 microlitri di terreno.

Eseguire cinque lavaggi, quindi risospendere le particelle in 30 microlitri di terreno. Successivamente, raccogliere le cellule che esprimono GFP utilizzando la tripsina e preparare una sospensione di 2 milioni di cellule per millilitro in una provetta einor Pipette 240 microlitri di terreno di coltura. Aggiungere 12,6 microlitri di cumuli molari, 20 microlitri di acqua filtrata, 50 microlitri di soluzione cellulare e 10 microlitri di particelle fluorescenti.

Infine, aggiungere 167 microlitri di collagene del derma bovino, una soluzione mescolare accuratamente la soluzione. Trasferire ora 80 microlitri sulla porzione di vetro del piatto siloizzato preparato. Incubare a 37 gradi centigradi per 50 minuti affinché il gel polimerizzi.

Quindi aggiungere con cura due millilitri di terreno di coltura. Equilibrare la camera del microscopio a una temperatura stazionaria di 37 gradi centigradi per rifornire il terreno cellulare. Per mantenere un pH neutro per l'imaging DIC, sostituire la parte superiore della piastra con una parte superiore di vetro con una sottile striscia di paraforma.

Coprire il lato del piatto per evitare l'evaporazione per un obiettivo ad immersione in olio. Posizionare una goccia di liquido di immersione sulla posizione dell'obiettivo. Il gel di collagene contiene la piastra sul tavolino del microscopio in modo che la capsula entri in contatto con il liquido di immersione.

Focalizzare il campione e cercare le celle di interesse per l'immagine per ridurre al minimo la deriva dello stadio. Lasciare riposare il piatto per circa 45 minuti. Prima di iniziare un'acquisizione lunga, specificare i parametri di acquisizione dell'immagine per gli esperimenti di aggiunta di inibitori.

Preparare i terreni integrati con il farmaco alla concentrazione di lavoro desiderata. Reintegrare il terreno cellulare per mantenere un pH neutro, ma non sigillare con perfil. Trasferire il campione al microscopio e procedere con l'imaging al momento del trattamento farmacologico.

Metti in pausa l'immagine, cattura e rimuovi con cura la parte superiore del piatto senza disturbare il piatto. Aspirare il terreno e pipettare il farmaco contenente il terreno nel piatto. Quindi riposizionare con cura il piatto.

La configurazione del frap superiore varia da un sistema all'altro. Quindi consultare le istruzioni del produttore. Prima impostare i parametri per l'imaging di cellule vive.

Per il fotosbiancamento. Testare questi parametri su celle di pratica per ottenere una potenza laser sufficiente per fotosbiancare il segnale fluorescente senza danneggiare la cella. Quindi, avviare l'acquisizione dell'immagine sul campione acquisendo almeno cinque fotogrammi.

Quindi sbiancare la regione di interesse. Continuare a catturare durante il tempo di recupero. Misura l'intensità fluorescente media dell'area sbiancata prima e dopo il fotosbiancamento nel tempo, utilizzando un software di analisi statistica.

Adattare la curva di recupero all'equazione esponenziale. Ottenere i parametri per l'intervallo e l'intensità finale dalla curva di adattamento esponenziale. Quindi calcola la frazione mobile prendendo il rapporto tra l'intensità di fluorescenza finale e quella iniziale.

Queste immagini 3D di cellule vive mostrano cellule epiteliali sane che esprimono actina GFP. Dopo quattro giorni di coltura, queste cellule hanno formato una cisti in una matrice di collagene 3D. Alcune cellule sono migrate lungo la superficie della cisti mentre altre sono migrate all'interno della cisti.

La deformazione della matrice a seguito delle forze di trazione esercitate dalle celle migranti, viene analizzata attraverso lo spostamento di particelle traccianti incorporate nella matrice circostante. L'effetto dell'inibizione della chinasi RO sulla forza di trazione è mostrato qui. I movimenti delle particelle traccianti vengono visualizzati come un'immagine di proiezione massima di diversi punti temporali e ogni punto temporale è pseudo colorato.

In alternativa, le immagini di una singola particella tracciante vengono visualizzate come un montaggio per mostrare il movimento della particella tracciante. Nel corso del tempo, questa particella tracciante si è spostata verso e lontano dal bordo d'uscita della cella migrante prima e dopo l'aggiunta di Y 2 7 6 3 2 rispettivamente. L'analisi frap segue le cellule che esprimono actina GFP mentre migrano in una matrice tridimensionale che indica il tipico recupero della fluorescenza Dopo un esperimento di fotosbiancamento in impostazioni laser ottimizzate, l'intensità della fluorescenza della regione di interesse è visibilmente diminuita rispetto al livello di fondo, mantenendo le cellule sane e non danneggiate.

Questo grafico mostra l'adattamento della curva di recupero con una funzione esponenziale. Una volta padroneggiato, il seeding delle cellule nella matrice può richiedere un'ora. Non dimenticare che lavorare con tre amminopropil trimetile può essere estremamente pericoloso.

Quindi prendi precauzioni come lavorare nella cappa chimica. Ricordate inoltre di mantenere le condizioni di sterilità quando lavorate con le cellule in una matrice 3D.