Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare la dinamica del calcio direttamente nel lume del reticolo endoplasmatico delle cellule viventi. Ciò si ottiene trasducendo le cellule con il colorante indotto dall'esterasi mirata o il costrutto del vettore TED per sovraesprimere l'esterasi CS 2 nel reticolo endoplasmatico. Successivamente, le cellule vengono incubate con l'aceto metil estere di calcio indicatore flu oh five NA, che si diffonde attraverso il plasma e le membrane del reticolo endoplasmatico.

Quindi la carbossilesterasi si sfalda. Il gruppo estere rilascia l'indicatore sensibile al calcio nell'er. Si formano il lume e i complessi di calcio fluorescenti.

Si ottengono risultati che mostrano cambiamenti nella concentrazione di calcio libero nell'ER sulla base dell'imaging di cellule vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la regolazione dell'omeostasi cellulare del calcio. I segnali del calcio sono monitorati più frequentemente nel citosol, quindi non è possibile distinguere facilmente dove il calcio fluisce nel citosol dallo spazio extracellulare o dal deposito di calcio del reticolo endoplasmatico intracellulare.

Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il download mirato indotto dall'esterasi. Con questo metodo, il calcio rilasciato dal reticolo endoplasmatico viene monitorato direttamente. L'approccio non è dirompente.

La membrana plasmatica rimane intatta e le cascate di segnalazione intracellulare sono preservate. In generale, gli individui con il metodo più difficile avranno difficoltà perché hanno bisogno di esperienza. Nell'espressione di TED Vector, abbiamo sviluppato costrutti vettoriali che esprimono una proteina cent fusa alla carbossilasi CES due.

Questo ci consente di identificare facilmente le cellule adatte per l'imaging del calcio AR durante gli esperimenti, che saranno cellule caratterizzate da una forte fluorescenza rossa e solo da moderata a forte fluorescenza dell'indicatore di calcio. Queste etichette fluorescenti dovrebbero essere distribuite uniformemente in tutto il reticolo endoplasmatico e sono assenti nella regione nucleare. Prima di iniziare.

Preparare il liquido cerebrospinale artificiale o A CSF e influenza oh cinque NAM secondo il protocollo di testo. Preriscaldare l'A CSF a temperatura ambiente e aggiungere glucosio profondo, aerare l'A CSF con carbogeno per cinque minuti. Quindi aggiungere una soluzione madre molare di cloruro di calcio e cloruro di magnesio a concentrazioni finali di due millimolari ciascuna.

Dopo aver avviato il microscopio per immagini dal vivo e il programma per computer, iniziare la profusione su una camera di imaging fittizia ed equilibrare il sistema di tubi, preriscaldare il riscaldatore della soluzione in linea e la camera di imaging sul tavolino del microscopio ed equilibrare il sistema a 32-37 gradi Celsius. Prima di iniziare la procedura di download per caricare il colorante nelle cellule, aggiungere 100 microlitri di A CSF preriscaldato a un'aliquota da 0,5 microlitri di cinque millimolari di influenza o cinque NAM e solubilizzare la soluzione in un bagno d'acqua, sonicare per 90 secondi, trasferire 400 microlitri di soluzione di imaging preriscaldata a un pozzetto di una piastra a quattro o 24 pozzetti. Aggiungere la soluzione D allo stesso pozzetto per produrre 500 microlitri di una soluzione a cinque micromolari.

Successivamente, posizionare con cura un vetrino coprioggetti con le cellule nel pozzetto, incubare per un periodo di tempo appropriato in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, il tempo di caricamento DI e la concentrazione di D dipendono dal tipo di cellula, dalla densità cellulare e dalle esigenze specifiche degli esperimenti. Lunghi tempi di incubazione possono danneggiare le cellule, in particolare le cellule di sfumatura primaria e gliali, e questo è fondamentale per la risposta agli stimoli fisiologici. L'incubazione di più di 30 minuti sarà utile solo per gli esperimenti di localizzazione del calcio nell'ER per studiare la distribuzione del calcio nell'ER in piccoli micro domini, ad esempio i MUE delle spine. Immediatamente dopo l'incubazione, trasferire il vetrino coprioggetto in un altro pozzetto di coltura cellulare contenente la soluzione di imaging.

Per prepararsi al montaggio delle celle nella camera di imaging, utilizzare un pennello per applicare il grasso ad alto vuoto sulla camera di imaging. Utilizziamo camere di imaging autocostruite per vetrini di copertura da 10 a 12 millimetri con un volume ridotto, consentendo così elevate velocità di perfusione fino a 15 volte la sostituzione del tampone al minuto. Raccogli il vetrino coprioggetti con l'influenza oh cinque e le cellule caricate e aggiungi una piccola goccia di soluzione di imaging per mantenerlo umido.

Quindi capovolgere il vetrino coprioggetto e montare le cellule nella camera di imaging. Utilizzare un batuffolo di cotone per premere il vetrino coprioggetto nella colla siliconica e per rimuovere il tampone residuo dal fondo del vetrino. Quindi, sostituire la camera di imaging fittizia con la camera di imaging sperimentale.

Lavare le cellule per 5-10 minuti mediante perfusione continua per la selezione delle cellule. Utilizzare una quantità minima di illuminazione laser per prevenire il rapido sbiancamento fotografico dell'influenza oh cinque e del calcio due al pronto soccorso, un'elevata velocità di scansione da due a quattro hertz, un'immagine di piccole dimensioni e un alto guadagno impostato al microscopio. Secondo l'esperimento della pianta.

All'inizio dell'esperimento, documentare la distribuzione cellulare dell'influenza oh cinque e l'etichetta del calcio e l'etichetta fluorescente rossa del costrutto rosso carbox cel esterasi. Nella tua cellula di interesse qui, i neuroni rappresentativi ad alta risoluzione X, gli stack di immagini YZ eseguono l'imaging XYT per monitorare la dinamica del calcio ER nelle specifiche condizioni sperimentali. Le impostazioni tipiche per il nostro sistema sono elencate nella tabella due del protocollo di testo: monitorare le variazioni del calcio ER in perfusione continua con la soluzione di imaging, i tassi di scambio del tampone sono di 1,5 millilitri al minuto per il lavaggio cellulare e la deplezione della riserva bloccando il calcio del reticolo endoplasmatico sarco, due a TPA e tre millilitri al minuto per la stimolazione da parte di un TP e DHPG e un agonista per il recettore metabotropico del glutammato.

Qui le cellule gliali vengono stimolate con 200 micromolari A TP per 10 secondi. Per elaborare le immagini, aprire la pila di immagini nel programma Image J per l'imaging multicolore. Dividi i canali RBG quando richiesto dal software.

Identificare le regioni di interesse. A seconda dello scopo, disegnare le regioni di interesse attorno all'ER completo o a piccole regioni dell'ER. Utilizza il plug-in dell'analizzatore di serie temporali per leggere l'intensità media dei pixel in una regione di interesse.

Calcola le variazioni relative corrette di fondo nella fluorescenza da delta F su F zero utilizzando questa formula. Presentare le variazioni relative della fluorescenza come una traccia con delta F su F zero per l'asse Y e tempo per l'asse x. In questa figura, le cellule A degli astrociti corticali e i neuroni dell'ippocampo esprimono un vettore TED fluorescente rosso e sono marcati con l'indicatore di calcio a bassa affinità.

Influenza oh cinque N.Il complesso indicatore di calcio fluorescente è localizzato nel reticolo endoplasmatico di tutti i tipi di cellule. Questa figura mostra l'influenza oh cinque cellule gliali marcate con N. Durante il trattamento con CIN, si osserva una marcatura citosolica brillante se la membrana plasmatica di una cellula è danneggiata sia prima che dopo il trattamento con CIN.

Questo rivela che l'influenza oh cinque N viene rilasciata anche nel citosol dalle esterasi endogene. In questo esperimento, dopo l'etichettatura TED con l'influenza o cinque N, la deplezione di calcio dei neuroni ippocampali in coltura è causata dall'acido ciclonico circa bloccante. Si noti che l'enorme variazione della densità media di fluorescenza per regione di interesse che viene osservata qui è una serie di time lapse con cellule GL cortico di topo che vengono stimolate con un TP. La fluorescenza diminuisce bruscamente e si riprende rappresentando il rilascio e il riempimento di calcio nell'ER Contemporaneamente, la fluorescenza della proteina fluorescente rossa diminuisce marginalmente come conseguenza dei diagrammi di sbiancamento dell'ardesia che mostrano il cambiamento dell'intensità della fluorescenza nel tempo in alcuni, ma non in tutti gli esperimenti.

I valori di fluorescenza non tornano ai livelli iniziali di intensità della fluorescenza perché alcuni complessi influenzali o cinque N vengono persi durante la stimolazione. Questo filmato mostra una carbossilasi due cellule BHK 21 infettate ad alta risoluzione marcate dall'influenza con cinque complessi di calcio N e stimolate con un TP. Si noti che un rilascio di calcio indotto da TP e un riempimento di deposito di calcio ER vengono visualizzati nelle strutture fini dei tubuli ER. Durante questa procedura, è importante ricordare che solo le cellule perfettamente sane mostrano risposte fisiologiche al calcio.

Si consiglia pertanto di eseguire una serie di esperimenti di omeostasi del calcio correlati in un giorno con lo stesso lotto di cellule. In base alla nostra esperienza, l'influenza del colorante di cinque N funziona meglio, ma questo indicatore di calcio non è molto resistente alle violazioni. Pertanto, questo metodo trarrà vantaggio dallo sviluppo di indicatori di calcio a bassa affinità più resistenti alla candeggina.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare il transitorio del calcio E con indicatori sintetici di calcio a bassa affinità. Questi indicatori consentono di monitorare la dinamica del calcio con un'elevata risoluzione temporale. Per questo motivo, il nostro metodo può essere utile per lo studio delle cascate di segnalazione del calcio coinvolte nella plasticità sinaptica e per monitorare i cambiamenti nell'omeostasi del calcio in modelli cellulari per malattie neurodegenerative.