Name: Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri il metodo TED per analizzare la dinamica del calcio nel reticolo endoplasmatico di cellule viventi mediante imaging fluorescente. Questa tecnica migliora la visualizzazione degli indicatori calcio-sensibili per studiare la segnalazione intracellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 e la Friedrich-Baur-Stiftung. Vorremmo ringraziare Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute laboratori presso l&#39;Università della California, San Diego per averci fornito Tag-RFP-T2. Noi per fortuna riconosciamo David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, e Didier Trono, Università di Ginevra, Ginevra, per averci fornito il lentiviral plasmidi FUGW e psPAX2/pMD2.G.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
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<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
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<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
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<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
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<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni 34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L&#39;espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l&#39;aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sinte...

Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare. Funzione e segnalazione di calcio ER Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell&#39;apprendimento e nella memoria di 1,2. Cambiamenti nella concentrazione di calcio libero sono di grande interesse scientifico perché il calcio è coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, la proliferazione cellulare, eccitabilità neuronale, la morte cellulare e altri eventi di segnalazione cellulare 1-7. Tutti questi segnali di calcio cellulari sono funzionalmente collegati e contribuiscono a intracellulare di calcionegozio dinamiche 8-10. Una caratteristica comune a tutti i segnali di calcio è il flusso di calcio tra lo spazio extracellulare, citoplasma e organelli, soprattutto il ER e mitocondri. Questo provoca cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio all&#39;interno di questi organelli, che vengono rilevate dai diversi componenti di segnalamento. In generale, la concentrazione di calcio nelle gamme ER tra 100 a 800 pM, nel citosol della concentrazione di calcio è quasi 100 nM, e nello spazio extracellulare la concentrazione è di circa 1-2 mm. Pertanto, vi è una forza motrice elevato chimica per flusso di calcio verso il citosol 2,9,10. I segnali di calcio ER-derivati ​​più comunemente studiate dipendono dalla stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR), che poi attivano la fosfolipasi C (PLC). PLC a sua volta produce inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3) 1. In seguito al legame di IP 3 alla sua receptor (IP 3-Rec, Figura 1) in ER-membrana, gli ioni calcio vengono rilasciati dal lume ER. Storicamente, IP rilascio di calcio 3-mediata dal pronto soccorso è stato il primo - anche se indirettamente - misurata in cellule pancreatiche acinose di Streb et al nel 1983 11.. Questa pubblicazione suggerito per la prima volta una cascata di segnalazione che coinvolge acetilcolina, fosfolipasi C, e IP 3. Questo modo di rilascio del calcio è generalmente definito IP rilascio del calcio 3-indotta (IiCR) (Figura 1). L&#39;attivazione della chinasi-dipendente della fosfolipasi Cγ da recettore tirosin chinasi link l&#39;azione di fattori di crescita e fattori neurotrofici di ER di calcio di segnalazione IP dopo 3 elevazione 12. Oltre a IiCR, elevazione di calcio può essere mediata da recettori ionotropici ingresso di calcio, per esempio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA V), e il successivo rilascio di calcio di calcio indotta (CICR) di ryanodine rirecettori (RyR). IiCR e CICR sono fisiologicamente legati al negozio-Entry operato di calcio (SOCE). SOCE comprende l&#39;azione di STIM (stroma interagenti molecola), che è un sensore per il rilascio di calcio ER. STIM ha mostrato di stimolare l&#39;ingresso di calcio extracellulare attraverso canali potenziali transitori recettore (Trp) 13, Orai canali del calcio 14 e anche canali del calcio voltaggio-dipendenti 15 (Figura 1). Perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente dall&#39;azione del Sarco-reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), che attivamente pompe indietro calcio nel ER. Bloccare il SERCA con farmaci come thapsigargin svela una continua perdita di calcio ER al compartimento citosolico. Questo calcio ER &quot;fuga&quot; è causato da ER intramembrane complessi del poro come il complesso proteico Sec61 16,17 (figura 1). Nel 1998, Berridge pubblicato un modello, il &quot;neurone all&#39;interno di un modello di neurone&quot;, which suggerisce un ruolo fisiologico principio della ER nell&#39;integrazione di calcio neuronale 5. Questo modello considera l&#39;esistenza di un sistema a membrana ER continuo formando una &quot;immagine&quot; intracellulare della membrana plasmatica neuronale 5. Questo sistema a membrana eucariotica binario è stato affermato di essere un prerequisito fondamentale per l&#39;integrazione temporale e spaziale dei segnali veloci e lenti di calcio nei neuroni. Segnali di calcio che si verificano sia in concomitanza o successivamente in diverse spine o dendriti del neurone stesso sono conferiti a soma o nucleo attraverso il pronto soccorso, dove vengono riassunte 5,18 della cellula. Quindi, la loro somma può avere effetto sul l&#39;eccitabilità del neurone, regolazione della trascrizione genica o l&#39;integrazione di cascate di segnalazione. Così, l&#39;ER sostiene l&#39;integrazione dei segnali di calcio. Una condizione per questo concetto è la continuità della ER in una singola cella, che è stato rivendicato da diversi studi e che è stato dimostrato almeno per somato-daree endritic e breve distanza proiezioni assonali 19-21. Che ci sia continuità ER entro lunghe proiezioni assonale è una questione di dibattito. Strategie per misurare il flusso di calcio gratis su membrana ER Segnali di calcio sono più frequentemente monitorati nel citosol 22,23. Pertanto, non può essere distinto facilmente se Ca 2 + fluisce nel citosol da extracellulare o da riserve intracellulari 6,24. Per superare questa limitazione, sono state sviluppate strategie metodologiche per l&#39;imaging diretto di calcio ER. In sintesi, le seguenti strategie da utilizzare sono: (1) ER-mirati geneticamente proteine ​​indicatori 25-27 a base di proteine ​​a bassa affinità Ca 2 + indicatori utilizzano la proteina bioluminescente aequorina o GFP in combinazione con una proteina di rilevamento. Calcio. Queste Ca 2 + indicatori geneticamente (GeCIS) puòessere mirati al pronto soccorso con l&#39;aiuto di un peptide segnale e sono tenute attivamente al pronto soccorso con una ritenzione e motivo recupero. Comune ER Ca 2 + indicatori di base sul principio Cameleon e sono il Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon spaccatura YC7.3ER 29, e Cameleon D1 30. (2) colorante diretto carico esterasi a base di AM-estere a bassa affinità Ca 2 + indicatori 31,32. Dell&#39;indicatore di coloranti (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivati ​​AM passare il membrane biologiche in una lipofila, Stato di calcio-insensitive. Poi, nel citosol, nonché in ER, esterasi endogene fendere del gruppo AM-estere e rilasciano l&#39;indicatore di Ca 2 +, lasciando una certa quantità di colorante attivo nel citosol e nel ER. Pertanto, questo approccio è utile in condizioni di una concentrazione elevata di calcio in ER finché la concentrazione di calcio citosolico rimane ben al di sotto delimite di protezione degli indicatori a bassa affinità, in particolare durante segnali di calcio caratteristici (per esempio nM a basse pM). (3) loading AM-estere in associazione con permeabilizzazione della membrana plasmatica 32. Qualsiasi residuo + citosolico indicatore Ca 2 viene rimosso mediante permeabilizzazione della membrana plasmatica con piccole quantità di un detergente &quot;neutro&quot; (ad es saponina) in un tampone intracellulare artificiale. Così, le membrane intracellulari possono essere stimolate, ad esempio con IP 3 nel buffer intracellulare, direttamente attraverso &quot;pori&quot; nella membrana plasmatica. (4) Dialisi del citosol in configurazione whole-cell e misure simultanee di Ca 2 + nel lume ER e il citosol 32,33. Una cella viene prima caricato con una bassa affinità Ca 2 + indicatore (ad esempio Mag-Fura2- AM, raziometrico, luce UV). In seguito, con l&#39;aiuto di una pipetta di patch, qualsiasi residuo cytosolic Ca + indicatore a bassa affinità 2 viene dializzato dal citosol con un tampone contenente un Ca 2 + indicatore ad alta affinità (es. Fluo-3, luce visibile). Questa strategia consente la registrazione simultanea di segnali derivati ​​citosolici e ER. (5) Targeted-esterasi indotta colorante carico 8,34. Un carbossilesterasi (CES) è mirato a lume del ER e fornisce una elevata attività di esterasi intrappolamento efficiente del modulo AM-estere di bassa affinità Ca 2 + indicatori. Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) Per migliorare il targeting di bassa affinità Ca 2 + indicatori per l&#39;ER lumen, TED è stato sviluppato. TED richiede la sovraespressione di un ER carbossilesterasi topo mirata (CES2) (Figura 2), che si ottiene tramite costrutti di espressione. Cellule esprimenti un CES-costrutto ricombinante vengono incubate con il modulo AM-estere di un calcio nelgnalazione colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). Poi, in ER, il colorante viene convertito al Ca 2 + sensibile, membrana impermeabile Ca 2 + indicatore complesso (Fluo5N/Ca 2 +) dall&#39;attività elevata esterasi, quindi intrappolando il colorante in una concentrazione elevata nel lume ER 8 , 34. Il metodo è particolarmente utile per indagare ER calcio-release tramite i IiCR-percorsi per esempio tramite metabotropici purinergici-o glutammato recettori, 8,34 e visualizzare ER deplezione di calcio attraverso &quot;canali di perdite&quot; direttamente, per esempio, dopo il blocco del SERCA 17 , 34. Per la nostra esperienza la bassa affinità Ca 2 + indicatore Fluo5N-AM è attualmente il miglior indicatore disponibile per l&#39;utilizzo con la strategia di caricamento TED colorante. Fluo5N-AM ha una bassa affinità per il Ca 2 + (costante di dissociazione K D ~ 90 pM, Figura 2), è quasi non fluorescente nella sua AM-forma, ma fornisce alta emissione di fluorescenza upon calcium 8,34 vincolante. Il Fluo5N/Ca 2 + complesso può essere eccitato con una sorgente luminosa standard di ~ 490 nm, che corrisponde a coloranti standard come FITC, Alexa 488, o eGFP. Segnali di calcio citosolico raggiungono appena un concentrazione nell&#39;intervallo pM bassa e sono quindi appena rilevati dal Fluo5N nel citosol 35. Per migliorare la prestazione TED, sono stati sviluppati diversi costrutti vettore ricombinante (Figura 3). In origine, vettori TED base alla sequenza codificante di CES2 (Refseq numero adesione NM_145603, CES2c) e migliori prestazioni TED si osserva con espressione stabile del CES costrutti. Nuovi TED vettori esprimono un elemento centrale della CES2 fusa alla proteina fluorescente rossa TagRFP-T2 36. Questi vettori hanno il vantaggio che possono essere utilizzati per identificare cellule trasdotte e di utilizzare la fluorescenza rossa come controllo interno per la normalizzazione dei cambiamenti in Fluo5N/Ca 2 + fluorescenza. La fluorescenza rossa offre anche la possibilità di visualizzare la distribuzione strutturale del ER e cambiamenti nelle dinamiche ER in condizioni di stimolazione.

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (Diidrossifenilglicina)</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, ATP sale disodico idrato</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 integratore,50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Carbamilcolina cloruro (Charbachol)</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>Acido ciclopiazonico (CPA)</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco senza Ca/Mg 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F12 di prosciutto</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank's BSS(1x) senza Ca, senza Mg, con fenolo rosso, HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina Ca2+ sale</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>murino EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 integratore 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, bassa assorbanza UV, 2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Po-DL-ornitina bromidrato PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina da Glycine MAX (soia)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Sistema confocale: microscopio a scansione laser invertito: FV1000 con</td><td>configurazione specifica per l'utente</td>IX81 <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Sistema confocale: combinatore laser FV10 e laser a diodi (405, 473, 559, 635)</td><td>Olympus</td><td></td><td>configurazione specifica per l'utente</td></tr><tr><td>Sistema confocale: testa di scansione FV10-SPD con rivelatore spettrale</td><td>Configurazione specifica per l'utente</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Controller del riscaldatore TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>per il controllo del riscaldatore della soluzione in linea</td></tr><tr><td>Software</td> <td>NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo: UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>Camera di perfusione, camera di perfusione inversa</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di perfusione: PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>per perfusione</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica MiniPlus 3 (4 canali)</td><td>Gilson</td><td>n.a.pompa</td> di <td>perfusione</td></tr><tr><td>Riscaldatore per soluzione in linea singola SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>controllato da controller di riscaldamento</td></tr><tr><td>Tubi di aspirazione: ST3R</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td><td>per perfusione</td></tr><tr><td>Inserto riscaldante: Tempocontrol 37-2 digitale a 2 canali</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging diretta di calcio er con targeted-esterasi induced loading dye (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca 2 + indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca 2 + pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un&#39;attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l&#39;imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All&#39;inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l&#39;imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l&#39;estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca 2 + indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L&#39;attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del + indicatore Ca 2 e una idrofila colorante fluorescente / Ca 2 + complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F 0.

Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l&#39;imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca 2 + indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l&#39;aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca 2 + indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche. Tipi di cellule per TED <p class="jove_conten...

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l&#39;analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicatore di coloranti in ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare direttamente la dinamica del calcio all'interno della cavità del reticolo endoplasmatico di cellule vive. Questo risultato si ottiene trasducendo le cellule con il costrutto vettoriale TED (dye esterase targeted) per indurre l'espressione eccessiva della carbossi esterasi CS2 nel reticolo endoplasmatico. Successivamente, le cellule vengono incubate con l'indicatore del calcio aceto metil estere flu oh five NA, che diffonde attraverso le membrane plasmatica e del RE.Quindi la carbossilesterasi scinde il gruppo estere, rilasciando l'indicatore sensibile al calcio nel lume del reticolo endoplasmatico. Si formano complessi fluorescenti al calcio.Si ottengono risultati che mostrano variazioni nella concentrazione di calcio libero nel reticolo endoplasmatico basate sull'immagineggiamento di cellule vive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la regolazione dell'omeostasi cellulare del calcio. I segnali di calcio vengono monitorati più frequentemente nel citosol, pertanto non è facile distinguere se il calcio che affluisce nel citosol proviene dallo spazio extracellulare o dalle riserve intra

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Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

L'obiettivo di questo articolo è quello di dimostrare un metodo per ottimizzare la rilevazione immunofluorescenza del recettore degli estrogeni-α (ERα) nel ratto fette piale arteriosa utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza.

Imaging del recettore dell&#39;estrogeno α in Rat Arteriole Pial utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza

Attività spontanea di sviluppare le reti neuronali può essere misurato con AM-estere forme di calcio-sensibili coloranti indicatore. Variazioni di calcio intracellulare, indicando l'attivazione neuronale, vengono rilevati come variazioni transitorie della fluorescenza indicatore con uno o due fotoni di imaging. Questo protocollo può essere adattato per una serie di reti neuronali...

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

L'omeostasi del calcio del reticolo endoplasmatico è interrotta in diverse patologie.  Un reporter della proteina di monitoraggio del calcio ER secreta (SERCaMP) può essere utilizzato per rilevare le interruzioni nella riserva di calcio ER.   Questo protocollo descrive l'uso di una Gaussia luciferasi SERCaMP per esaminare l'omeostasi del calcio ER in vitro e in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Questo protocollo presenta passaggi per acquisire e analizzare immagini fluorescenti di calcio da periciti che riscaldano il cervello e dati sul flusso sanguigno dai vasi sanguigni vicini in topi anestetizzati. Queste tecniche sono utili per gli studi di fisiologia delle cellule murali e possono essere adattate per studiare i transitori di calcio in qualsiasi tipo di cellula.

Calcio dei periciti cerebrali e imaging emodinamico nei topi transgenici in vivo

Il presente protocollo descrive il controllo completamente ottico e l'osservazione dell'attività cellulare innescata nei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CM) per lo screening dei farmaci ad alto rendimento e i test di tossicità. Viene mostrata la quantificazione multiparametrica dei modelli fenotipici nel tempo e nello spazio. Vengono dimostrati gli effetti a lungo termine dei farmaci nell'arco delle ore o delle misurazioni sequenziali nei giorni.

Controllo ottico ad alta produttività e registrazione del segnale di calcio nei cardiomiociti derivati da iPSC per test di tossicità e screening fenotipico dei farmaci

Scopri il metodo TED per analizzare la dinamica del calcio nel reticolo endoplasmatico di cellule viventi mediante imaging fluorescente. Questa tecnica migliora la visualizzazione degli indicatori calcio-sensibili per studiare la segnalazione intracellulare.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

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