Valutare Murino Resistenza Funzione Arteria Utilizzando myography Pressione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la reattività vascolare in tempo reale dell'arteria resistente del topo in vitro in condizioni prossime a quelle fisiologiche. Questo risultato si ottiene montando un piccolo segmento del vaso su due cannule microscopiche e mantenendolo a pressione luminale fisiologica. Il vaso viene quindi costritto con un agonista del recettore alfa-1, la fenilefrina, al fine di studiare la capacità di un qualsiasi farmaco di dilatare il vaso.

La somministrazione di acetilcolina a un vaso restringito valuta la sua capacità di dilatarsi in tempo reale attraverso un meccanismo dipendente dall'endotelio. I risultati mostrano la variazione percentuale del diametro del lume in risposta all'acetilcolina e confermano che la carenza della subunità alfa uno della GCS determina un'alterata vasodilatazione dipendente dall'endotelio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mamografia con filo, è che la mamografia a pressione permette la caratterizzazione di piccoli vasi microscopici, che risultano più rilevanti nel mantenimento dell'omeostasi della pressione arteriosa rispetto ai vasi di conduzione di maggiori dimensioni.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiovascolare, come l'ipertensione, in cui i vasi macroscopici resistenti svolgono un ruolo cruciale. Iniziare praticando l'eutanasia a un topo con pentobarbital. Aprire ora la cavità addominale e iniziare a dissezionare il tessuto mesenterico.

Ora identificare un'arteria mesenterica di terzo ordine e isolarla dal tessuto connettivo e adiposo. La differenziazione tra arterie e vene a livello di microvasi è problematica quando non è presente sangue nei vasi. Pertanto, è preferibile effettuare questa procedura nell'animale intatto.

Successivamente, tagliare un segmento lungo due-tre millimetri dell'arteria mesenterica di terzo ordine e posizionarlo in una piastra contenente PSS buffer. Il segmento arterioso non deve contenere alcuna diramazione.

Preparare la camera miografica riempiendo delicatamente le cannule attraverso le valvole di ingresso e di uscita con soluzione PSS da una siringa da 10 millilitri, facendo attenzione al fatto che una pressione eccessiva potrebbe danneggiare il trasduttore fragile collegato alle cannule. Dopo aver riempito completamente le cannule, chiudere entrambe le valvole. Trasferire ora il segmento arterioso isolato nella camera e montare un'estremità del vaso sulla cannula destra.

Legare con attenzione utilizzando un sottile filamento di sutura in nylon, quindi sciacquare con una siringa e riempire il vaso con soluzione heap attraverso la valvola di ingresso. Montare ora l'altra estremità del vaso sulla cannula sinistra e fissare la cannula al vaso con la sutura in nylon. Riempire la camera con fino a 10 millilitri di soluzione heap.

Verificare la presenza di perdite spingendo delicatamente la soluzione dal serbatoio attraverso la valvola di ingresso con l'aiuto di una siringa. Posizionare ora la camera sotto la videocamera. Avviare l'erogazione di ossigeno e riscaldare la camera a 37 gradi Celsius mentre la valvola di ingresso è chiusa e collegata al tubo P1 dal serbatoio della prima soluzione.

Fare passare qualsiasi bolla e soluzione attraverso il tubo fino a quando non ci sono più bolle nel tubo. Quindi aprire la valvola. Collegare alla valvola sinistra della camera con il tubo P due.

Provenendo dal regolatore di pressione, assicurarsi che non vi siano bolle o perdite in tutto il sistema. Accedere al menu della pressione sul pannello dell'interfaccia myo o nel software e accendere la pompa disattivando il flusso. Aprire il programma e fare clic su "collect".

È ora possibile monitorare e analizzare il diametro del lume vascolare e lo spessore della parete. Per aumentare gradualmente la pressione intraluminale, selezionare la pressione P1 e impostare una sequenza di pressioni crescenti. Valori compresi tra cinque e 60 millimetri di mercurio; i vasi sanguigni a volte si torcono o si convolvono durante l'aumento della pressione, quindi regolare la tensione o la deformazione di conseguenza con l'aiuto di un microposizionatore verticale o longitudinale.

Una volta che la pressione raggiunge i 60 millimetri e il bagno è a 37 gradi Celsius, equilibrare il vaso per almeno 45 minuti e fino a un'ora durante il periodo di equilibrazione. Cambiare la soluzione del bagno una volta con soluzione pre-riscaldata. Ora che la sezione arteriosa è equilibrata, applicare 10 millilitri di soluzione depolarizzante di cloruro di potassio a 37 gradi Celsius.

Il muscolo liscio si depolarizzerà completamente e raggiungerà la massima costrizione. Dopo aver ottenuto una costrizione stabile, risciacquare il bagno con soluzione heap per tre volte a intervalli di 10 minuti. A questo punto verificare la vitalità del vaso e l'integrità dell'endotelio.

Prima di tutto, prestringere il vaso aggiungendo fenilefrina fino a raggiungere la concentrazione di 10 alla meno cinque moli per litro. Quando si è ottenuta una costrizione stabile, eseguire una curva di risposta vasodilatatoria cumulativa mediante aggiunte sequenziali di dosi crescenti di acetilcolina, da 10 alla meno nove a 10 alla meno cinque moli per litro. Dopo l'ultima dose di acetilcolina, risciacquare il preparato tre volte con abbondante soluzione, a intervalli di 10 minuti.

Ora, determinare il diametro passivo della luce applicando PSS privo di calcio contenente due millimoli di EGTA per litro dai tracciati registrati. Misurare il diametro della luce per ogni risposta alla dose, che verrà utilizzato per calcolare tutti i parametri. Esprimere la risposta di rilassamento dell'acetilcolina come confronto tra il trattamento con l'agonista e il tampone privo di calcio in termini di quanto ciascuno abbia modificato il diametro della luce rispetto alla costrizione indotta dalla fenilefrina.

È stata utilizzata la micografia da pressione per studiare il rilasciamento vascolare in risposta all'acetilcolina in arterie di resistenza mesenteriche isolate da topi di tipo selvaggio e da topi knockout per SGC alpha one, con background S six e black six, precedentemente costritte con fenilefrina. La carenza di SGC alpha one è risultata associata a una ridotta capacità dell'acetilcolina di indurre rilasciamento vascolare, indipendentemente dall'background genetico dei topi analizzati. Tuttavia, il rilasciamento dipendente dall'endotelio nei topi null per SGC alpha one era maggiormente compromesso nell'background S six rispetto all'background black six.

Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la ridotta sensibilità della vascolatura al rilassamento dipendente dall'endotelio potrebbe contribuire all'ipertensione specifica del ceppo nei topi knock-out per SGC Alpha one. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due ore, se effettuata correttamente. Oltre a questa procedura, altri metodi, come la microscopia confocale, possono essere eseguiti contemporaneamente sui vasi sanguigni vitali. Ciò permetterebbe, ad esempio, la misurazione delle concentrazioni intracellulari di ferro, utili per identificare i meccanismi di segnalazione sottostanti.