Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

Il nostro laboratorio utilizza da molti anni il metodo del miografo a filo per misurare la contrattilità della muscolatura liscia vascolare. Usiamo questa tecnica per studiare il meccanismo della contrazione della muscolatura liscia. Utilizziamo questo metodo per esplorare nuovi farmaci per la terapia dell'ipertensione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il segmento del vaso sopravvive almeno quattro ore dopo il montaggio e mantiene la contrattilità indotta dall'alto potassio per molte volte. Il sistema multicanale offre l'opportunità di effettuare lo screening ad alta terapia di nuovi farmaci. Appuntare il corpo del topo soppresso con l'addome rivolto verso l'alto e inumidire l'addome con etanolo al 70%.

Quindi, dopo aver usato le forbici per tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale dall'inguine, praticare incisioni lungo ciascuna gamba dall'inizio della prima incisione. Tira indietro la pelle su entrambi i lati, quindi fai incisioni simili per aprire il peritoneo. Successivamente, usa le forbici per tagliare l'esofago, il colon e altri tessuti connettivi per isolare completamente il tratto gastrointestinale con la vascolarizzazione di alimentazione dal corpo.

Dopo aver risciacquato il sangue dal tratto gastrointestinale con HEPES-Tyrode, o soluzione HT, trasferire il segmento isolato in una piastra di Petri rivestita per la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente. Lisciare lo stomaco, il digiuno, l'ileo e il cieco in senso orario e fissare lo stomaco e il cieco rispettivamente sul lato sinistro e destro. Accendere la sorgente di luce di trasmissione di un microscopio stereoscopico e fissare l'intestino con dei perni per esporre le arterie mesenteriche sezionate.

Quindi bloccare i tessuti adiposi attorno alle arterie con una pinza e isolare accuratamente le arterie tagliando tutti i tessuti connettivi con le forbici da dissezione. Afferrare un'arteria in eccesso con una pinza e trasferire e immergere l'albero dell'arteria mesenterica in una soluzione fredda di H-T priva di ioni di calcio. Tagliare una porzione di 1,4 millimetri dell'arteria prossimale alla parete intestinale di un'arcata mesenterica e utilizzare due pinze per aprire con cautela entrambi i lati di questo segmento di arteria.

Preparare due segmenti di filo di acciaio inox di 2,5 centimetri di lunghezza e disporli nello stesso piatto. Usa una pinza per bloccare delicatamente un'estremità dell'arteria. Quindi utilizzare un'altra pinza per inserire con cura due fili nel lume dell'arteria uno per uno.

Assicurarsi che i fili siano mantenuti dritti e non tocchino l'endotelio. Utilizzando due pinze, bloccare contemporaneamente entrambi i fili all'esterno del recipiente filettato e trasferire con cura il recipiente dalla capsula di Petri a una camera del miografo riempita con soluzione HT. Avvitare le ganasce della camera per fare spazio per il montaggio, quindi afferrare entrambi i lati di uno dei due fili inseriti utilizzando due pinze e posizionare il recipiente nella fessura delle ganasce.

Avvolgere entrambi i lati del filo clamped attorno alle viti della ganascia collegata al micrometro. Fissare la vite sul lato sinistro ruotandola in senso orario. Quindi usa una pinza per raddrizzare il filo.

Quindi, fissare la vite sul lato destro ruotandola in senso orario. Assicurarsi che il recipiente sia sempre all'interno della fessura della ganascia, ma non toccare la ganascia per evitare danni. Chiudere le due ganasce con il micrometro.

Assicurarsi che le due ganasce siano abbastanza vicine ma che non si tocchino e che il filo non fissato si trovi sopra il filo fisso. Utilizzando la pinza destra, piegare con cautela il filo svitato all'angolo della ganascia collegata al trasduttore di forza e avvolgerlo in senso orario attorno alla vite sul lato destro. Quindi, fissare la vite.

Ripetere l'apertura e l'avvolgimento del lato sinistro del filo e fissare la vite sul lato sinistro. Quindi, allontanare leggermente le ganasce senza allungare il recipiente ruotando con attenzione il micrometro in modo che lo spazio tra le due ganasce possa accogliere solo i due fili. Quindi utilizzare una pinza per spostare il filo sul lato del micrometro sul piano orizzontale del filo sul lato del trasduttore.

Dopo aver montato le arterie nelle altre camere, collegare tutte le camere all'apparecchiatura e coprire le camere. Collegare l'alimentazione di ossigeno al 100% e una sonda di temperatura e iniziare a riscaldare a 37 gradi Celsius. Apri il software per la creazione di grafici.

Premere il pulsante Start per avviare la registrazione. Selezionare il canale di interesse dal menu DMT per aprire la finestra di normalizzazione DMT per il canale corrispondente. Immettere i seguenti valori costanti nella finestra:Punti finali del tessuto a1, 0.1; Punti finali del tessuto a2, 4; Diametro del filo, 40.

La finestra visualizza quindi la lunghezza dell'imbarcazione calcolata come 1,40 millimetri. Leggere il micrometro della camera tissutale appropriata. Immettere il valore nella casella di lettura del micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto.

Questo valore è il valore iniziale di X.Dopo un ritardo di 60 secondi, la finestra visualizza la forza e la pressione effettiva corrispondenti a questo valore micrometrico. Contemporaneamente, la casella di lettura del micrometro diventa attiva. Allungare il recipiente da normalizzare ruotando il micrometro in senso antiorario.

Immettere il valore del micrometro nella casella di lettura del micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto. Attendere nuovamente un ritardo di 60 secondi. Continuare ad allungare il recipiente e aggiungere valori micrometrici fino a quando la finestra non visualizza il valore del micrometro X-one, che è l'impostazione micrometrica calcolata necessaria per allungare il recipiente al suo IC-one.

Impostare il micrometro sul valore X-uno. Dopo la normalizzazione, equilibrare il recipiente nella camera per 15-20 minuti. Una volta equilibrato, sfidare il recipiente con una soluzione ad alto contenuto di potassio sostituendo la soluzione H-T con 5 millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio per indurre la contrazione per 10 minuti.

Dopo aver ripetuto l'incubazione di 10 minuti in una soluzione fresca ad alto contenuto di potassio, lavare con cinque millilitri di soluzione di H-T tre o quattro volte. Ancora una volta, sfida il vaso con cinque millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio per indurre la contrazione. Dopo cinque minuti, aggiungere 0,5 microlitri della soluzione madre di Neoliensinina nella camera per rilassare il recipiente alla concentrazione finale di un micromolare di Neoliensinina.

Quando la forza è stabile dopo alcuni minuti, aggiungere altri 0,5 microlitri di soluzione madre di Neoliensinina per aumentare la concentrazione a due micromolari. Aggiungere ogni volta un microlitro della soluzione madre per aumentare la concentrazione a quattro, sei, otto e 10 micromolari per generare la curva dose-risposta. Durante la procedura di normalizzazione, il recipiente è stato allungato più volte fino a raggiungere il valore di IC-100 e ogni ciclo allungato includeva una contrazione robusta, un rapido rilassamento e un mantenimento della forza in 60 secondi.

La contrazione della muscolatura liscia vascolare indotta da una soluzione ad alto contenuto di potassio di solito mostrava due fasi, una fase robusta e una fase sostenuta. Abbiamo descritto un metodo per misurare la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica di topo utilizzando un sistema miografico multifilo. Questo metodo può essere utilizzato per valutare le funzioni della muscolatura liscia vascolare e per lo screening dei rilassanti della muscolatura liscia.

La principale differenza tra questo metodo e gli altri sta nelle fasi di montaggio. Questo passaggio utilizzato qui è facile da eseguire e non danneggia il tessuto o il dispositivo. Dopo questa procedura, altri stimolatori come l'EP e l'angiotensina II possono essere utilizzati anche per stimolare la contrazione della muscolatura liscia al fine di trovare alcuni nuovi farmaci sensibili a questo agonista.