Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre rapidamente il diabete di tipo uno nei topi trasferendo le cellule T diabetogene dai topi transgenici ai topi, che mancano di cellule T e B endogene. Inizia raccogliendo la milza e i linfonodi dai topi donatori e purificando le quattro cellule T positive del CD. Successivamente, in modo adottivo, trasferire le cellule T purificate del donatore in topi riceventi non scivolanti.

Quindi monitorare i topi riceventi per lo sviluppo del diabete di tipo uno. In definitiva, questo protocollo può essere utilizzato per studiare la patogenesi del diabete e per studiare interventi terapeutici rispetto ad altri metodi. Il vantaggio principale di questa tecnica di trasferimento di BDC 2.5, CD quattro cellule T positive in riceventi non skid è lo sviluppo rapido e riproducibile del diabete di tipo uno.

Per i donatori del CD diabetogeno, quattro cellule T positive utilizzano topi BDC 2,5 femmine pre-diabetiche di sei settimane che sono stati determinati come privi di diabete mediante misurazione del glucosio nelle urine. Per rimuovere la milza e i linfonodi, immergere la pelliccia con etanolo al 70%, quindi tagliare la pelle, ritrarre la pelle fino a quando i muscoli degli arti anteriori non sono esposti. Vicino alla base degli arti anteriori, dovrebbero essere visibili due linfonodi su ciascun lato Afferrare con cura ogni linfonodo con piccole pinzette e rimuoverlo tagliando il tessuto connettivo.

Quindi, fai un'incisione di un pollice nel peritoneo usando le piccole forbici. Ora afferra delicatamente la milza al centro. Tagliare con cura il tessuto connettivo e il grasso attaccato.

Quindi rimuovere la milza, il pizzo, la milza e i linfonodi in 10 millilitri di DMEM su ghiaccio. Con l'estremità di uno stantuffo sterile da 10 millilitri, premere delicatamente gli organi linfoidi attraverso un colino cellulare da 70 micrometri. Per ottenere una sospensione a cella singola.

Sciacquare più volte ogni colino con un millilitro di DMEM per massimizzare il recupero delle cellule. Quindi trasferire le cellule raccolte in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 400 Gs per sette minuti. A temperatura ambiente, risospendere il pellet della cella in tre millilitri di tampone CK.

Ora incubare ogni temperatura ambiente per cinque minuti. Per lisciare i globuli rossi, aggiungere 12 millilitri di DMEM e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Lavare il pellet cellulare una volta in 10 millilitri di DMEM.

Successivamente, sospendiamo le cellule in cinque millilitri di tampone di colorazione dei fatti e utilizziamo un microscopio a contrasto di fase e un emocitometro per contare il numero di cellule vitali. Ora rimuovi circa una volta 10 delle sei cellule per controllo di colorazione. Colorare anche le cellule con anticorpi monoclonali di topo per selezionare le cellule T transgeniche CD quattro positive non attivate.

Incubare tutti quei campioni a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti. Lavare ora le cellule con un volume di colorazione tre volte superiore al tampone fax e risospendere le cellule nel tampone fax una o due volte, da 10 a sette cellule per millilitro per lo smistamento del campione e 300 microlitri per i controlli a colorazione singola. Quindi, passare il campione cellulare attraverso un tubo con tappo del filtro cellulare da 35 micrometri.

Per rimuovere i grumi di cellule, elaborare i campioni per un selezionatore di cellule con un operatore addestrato Attendere circa tre ore, compreso il tempo di configurazione per ordinare circa 1,5 volte 10 all'ottavo totale di CD naive transgenico quattro cellule T positive. Ci si può aspettare circa 2,5 volte 10 delle sei celle per topo e la velocità di ordinamento sarà circa due volte 10 dei quarti eventi al secondo su uno strumento come il BD Fox Aria. Raccogli le cellule ordinate in tre millilitri di DMEM.

Registrare il numero assoluto di celle selezionate e centrifugarle per sette minuti. A 400 Gs, sospendiamo i pellet cellulari in soluzione salina sterile tamponata con fosfato per il trasferimento delle cellule T adottive. Utilizzando una siringa da un millilitro in un ago calibro 18, risospendere delicatamente il CD purificato fax a quattro cellule T positive.

Caricare la siringa da un millilitro, quindi, in preparazione per l'iniezione, collegare un ago da 27 punti a mezzo calibro alla siringa. Trattenere i topi riceventi del pattino del nodo e pulire la coda con etanolo al 70% per disinfettare il sito di iniezione. Quindi iniettare una volta il decimo dei sei CD purificati quattro cellule T positive per topo in una delle vene laterali della coda.

Quando fai le iniezioni della vena caudale, assicurati di non forzare lo stantuffo. Se l'ago è effettivamente nella vena, l'iniezione dovrebbe avvenire quasi senza resistenza a partire da cinque giorni dopo il trasferimento delle cellule T. Monitorare quotidianamente i topi riceventi di skid nod per lo sviluppo del diabete di tipo uno.

Misurare la glicemia nelle urine utilizzando le strisce reattive secondo il produttore e le istruzioni. Si noti che i topi con due letture consecutive della glicemia nelle urine superiori a 250 milligrammi per decilitro sono considerati diabetici. In un tipico esperimento, ogni topo donatore BDC 2.5 produce circa due volte e mezzo 10 delle sei cellule T transgeniche CD quattro positive dopo lo smistamento delle cellule dopo il trasferimento adottivo di quattro cellule T positive CD diabetogene, i topi sono stati monitorati per le concentrazioni di glucosio nelle urine.

Il trasferimento adottivo di un piccolo numero di cellule da topi donatori BDC 2.5 ha indotto il diabete di tipo uno in tutti i riceventi non sdrucciolevoli entro l'11° giorno. Se eseguita correttamente, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore dal prelievo degli organi al trasferimento delle cellule T.