Name: Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Impara a indurre rapidamente il diabete di tipo 1 nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule CD4+ T diabetogeniche. Questo metodo riproducibile consente di studiare la patogenesi del diabete e di testare interventi terapeutici in vivo.

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Ringraziamo Drs. Robert Bonneau e Neil Christensen per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Pennsylvania State University College of Medicine fondi.

1. Isolamento delle cellule T da Milza e linfonodi di topi BDC2.5 <ol><li> Utilizzare 6 settimane di età pre-diabetici femminili BDC2.5 topi come donatori di cellule CD4 diabetogenici cellule T. I topi devono essere diabete libero come determinato dalla misurazione del glucosio nelle urine (vedere sotto). </li><li> Euthanize ogni mouse utilizzando CO 2 asfissia e rimuovere i linfonodi milza, ascellare e brachiale in condizioni sterili. Per rimuovere la milza, bagnare il pelo con il 70% di etanolo, quindi tagliare e ritrarre la pelle. La milza sarà visibile come un organo rosso scuro sul lato sinistro del mouse. Effettuare una incisione di 1 pollice nel peritoneo usando le forbici piccole e prenda delicatamente la milza al centro con un paio di pinzette. Tagliare accuratamente il tessuto connettivo e grasso adiacente il più possibile e rimuovere la milza. </li><li> Raccogliere le milze e linfonodi a 10 Media di ml Dulbecco&#39;s-Modified Eagle (DMEM) in un tubo da 15 ml su ghiaccio. </li><li> Preparare una sospensione singola cella utilizzando the fine di una sterile 10 ml pistone della siringa, premere delicatamente gli organi linfoidi attraverso 70 filtri cellulari micron (uno milza per filtro e 4-6 linfonodi al colino) nella stessa ml tubo conico 50. </li></ol> Durante il processo, sciacquare ciascun filtro con 1 ml di DMEM più volte per massimizzare il recupero delle cellule dal filtro. <ol start="5"><li> Trasferire le cellule raccolte dalla provetta conica da 50 ml in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300-400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per la lisi dei globuli rossi, scartare il surnatante, risospendere le cellule in 5 ml di ammonio-cloruro-potassio (ACK) tampone (pH 7,2) e incubare la sospensione ACK-cella a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM alla sospensione ACK-cellula e centrifugare la provetta come sopra. Lavare il pellet una volta in 10 ml DMEM. </li></ol> 2. Cella Ordinamento Fluorescence-activated di CD4 + T Cells diabetogenici da BDC2.5 Mice <ol><li> Risospendere le cellule in 5 ml FACS scontenenti tampone e contare il numero di cellule vitali (utilizzando un microscopio a contrasto di fase ed un emocitometro) by trypan blue. </li><li> Utilizzando tampone FACS, regolare il volume di sospensione cellulare per 5 x 10 7 cellule / ml. Rimuovere ~ 1 x 10 6 cellule per il controllo colorazione (1 nessuna macchia, macchie 3 singoli). Colorare il campione per non attivati ​​CD4 transgenici cellule T con anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) e anti-CD62L (PE), anticorpi monoclonali (mAb) in una provetta da 15 ml. Eseguire colorazione cella utilizzando le concentrazioni mAb suggerite dal costruttore per 20-30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare il campione e singoli controlli macchia con tampone FACS a&gt; 3 volte il volume di reazione di colorazione. Centrifugare la provetta a 300-400 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in FACS tampone (1-2 x 10 7 cellule / ml per l&#39;ordinamento del campione e 300 microlitri per singoli controlli macchia) e conservare in ghiaccio fino al prossimo passo. </li><li> Passare il campione cellulare attraverso una cella di 35 microncolino tubo tappo da rimuovere grumi di cellule. Ordinare i campioni di cellule CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celle su un cell sorter con un operatore esperto. Raccogliere le cellule filtrate in 3 ml di DMEM in una provetta da 15 ml. Lasciare 2.5-3 ore, la sua installazione, per ordinare 1,5 x 10 8 cellule (il numero approssimativo di cellule ottenute da topi 3 donatori) ad una velocità sorta di 2 x 10 4 totali eventi / sec. Aspettatevi ~ 2.5 x 10 6 non attivati ​​CD4 transgenici cellule T per topo dopo la separazione delle cellule. </li><li> Registrare il numero assoluto di cellule ordinati al termine del genere e li centrifugare per 7 minuti a 300-400 x g. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule (2 x 10 6 cellule / ml) in sterile tampone fosfato salino (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libero) per il trasferimento di cellule T adottivo. </li></ol> 3. Trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici da BDC2.5 Mice <ol><li> Usando una siringa da 1 ml e un ago calibro 18-1 ½, delicatamente risospendere le cellule CD4 FACS-purificati +Cellule T e caricare la siringa da 1 ml. In preparazione per l&#39;iniezione, sostituire il 18-1 ½ ago calibro 27 con un ago calibro ½. </li><li> Esporre 6-8 settimane di età femminile NOD.SCID topi riceventi di una lampada riscaldante fino esibiscono governare il comportamento. </li><li> Frena topi riceventi in un dispositivo di immobilizzazione e pulire la coda con il 70% (v / v) di etanolo per disinfettare il sito di iniezione. </li><li> Iniettare 1-2 x 10 6 FACS filtrate cellule / topo (in 500 microlitri di PBS) in una delle due vene coda laterali. </li></ol> Non forzare lo stantuffo. Se l&#39;ago si trova opportunamente nella vena, l&#39;iniezione avverrà con quasi nessuna resistenza. 4. Monitoraggio topi riceventi di iperglicemia e diabete di tipo 1 <ol><li> Cominciando cinque giorni dopo il trasferimento di cellule T, topi riceventi NOD.SCID sono monitorati quotidianamente per elevati livelli di glucosio nelle urine con strisce reagenti (Bayer Diastix) secondo le istruzioni del produttore. I topi con due orino consecutivoletture di glucosio e&gt; 250 mg / dl sono considerati diabetici. </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
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</ol>

Tutti i topi sono stati alloggiati presso la Penn State College of Medicine impianto privo di patogeni (SPF) specifico in conformità con le linee guida del Penn State Institutional Animal Care e uso Comitato. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

T1D può essere indotta in topi riceventi a varie efficienze di trasferimento adottivo di cellule della milza intere o sottoinsiemi di cellule T da topi NOD diabetici o topi transgenici per il TCR derivati ​​da cloni di cellule T diabetogenici. Riportiamo qui un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 in topi riceventi entro due settimane al 100% di incidenza con il trasferimento di FACS-purificati CD62L + BDC2.5 CD4 transgenici cellule T nei topi NOD.SCID. Vantaggi specifici de...

Topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo ed è stato ampiamente utilizzato come modello animale per 1,2 T1D umana. Patogenesi del diabete di tipo 1 nei topi NOD è caratterizzata da infiltrazione, con inizio alle 3-4 settimane di età, delle isole pancreatiche di Langerhans da parte delle cellule dendritiche e macrofagi, seguiti da cellule T e B. Questa fase di non distruttiva peri-insulitis porta ad una lenta, progressiva distruzione delle cellule che producono insulina β pancreatiche, con conseguente diabete manifesto da 4-6 mesi di età 3. Trasferimento di splenociti 4,5, CD4 + 8,9 + 6,7 o cellule CD8 T da topi NOD diabetici hanno dimostrato di mediare il diabete nei topi NOD immunocompromessi, il che indica che le cellule T isolotto-reattive giocano un ruolo centrale nella patogenesi T1D. A seconda delle condizioni sperimentali, diabete sviluppato in topi riceventi lentamente, nell&#39;arco di diverse settimane in questi studi. Analogamente, vari cloni di cellule T, derivato dal tempo e costosocoltura di cellule T diabetogenici, sono stati segnalati per mediare diabete diverse settimane dopo il trasferimento in topi riceventi 7,10. Con la disponibilità di topi transgenici che esprimono TCR derivati ​​da CD4-o cloni di cellule CD8-restricted diabetogenici T, diversi laboratori hanno successivamente dimostrato che le cellule T spleniche di questi topi sono stati in grado di trasferire il diabete ai destinatari 11-13. Specificamente, BDC2.5 topi NOD sono transgenici per la BDC2.5 TCR, che è specifico per cromogranina A, una proteina nelle cellule beta pancreatiche 14-16. Trasferimento di in vitro-attivato o cellule della milza interi o frazionati non-attivati ​​dal apertamente diabetici o prediabetico BDC2.5 topi trasferiti diabete di topi NOD neonatali o immunodeficienti a varie efficienze 11,17-19. Descriviamo un metodo semplice che utilizza CD4 transgenici purificate + cellule T dei pre-diabetici BDC2.5 topi per indurre diabete di tipo 1 in topi riceventi ad alta efficienza e ConsisteNCY. Un gran numero di ingenui, isolotto CD4 antigene-specifiche cellule T sono isolati da questi topi di selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) per CD4 + CD62L + cellule T che esprimono il TCR catena Vβ4 transgenico. Cellule purificate transgeniche T sono poi trasferiti senza attivazione in topi NOD.SCID, che mancano funzionale T e le cellule B e sono insulitis-e diabete-libero 20. I topi riceventi sono monitorati per elevate concentrazioni di glucosio nelle urine che indicano diabete di tipo 1, che si sviluppa rapidamente nel giro di due settimane dopo il trasferimento di cellule T. A differenza di altri metodi che trasferire le cellule T diabetogene con specificità eterogenee, il nostro protocollo utilizza FACS-ordinati cellule T CD4 + che esprimono quasi esclusivamente il diabetogeno BDC2.5 TCR. A causa della loro omogeneità, solo un piccolo numero di cellule T trasferite (~ 1x10 6 cellule / topo) sono necessari per un rapido sviluppo T1D entro 2 settimane al 100% di incidenza. Un altro vantaggio di questo protocollo è che irradiation di topi riceventi non è necessaria come lo è per alcuni altri metodi. Un potenziale limite di questo metodo è che non consente l&#39;indagine sul contributo di entrambi CD4 e CD8 sottoinsiemi di cellule T CD8 o specificamente cellule T nel diabete. Il protocollo descritto sarà utile per lo studio di un rapido sviluppo diabete di tipo 1, mediata da ingenui, monospecifici CD4 + cellule T, così come le strategie terapeutiche per intervenire in homing di antigene-specifiche cellule Th isolotto per l&#39;organo bersaglio.

<table><tbody><tr><td>I topi transgenici BDC 2.5 TCR NOD (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Topi SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubi conici</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubi conici</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette chirurgiche</td><td></td><td></td><td></td>sterili</tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>sterili a coppia piccola</tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>sterili a coppia grande</tr><tr><td>70 &mu; filtri per cellule m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; </td> BD <td>Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr>tampone <td></td><td></td><td>ammonio-cloruro-potassio (ACK)</td><td>0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 in dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM</td><td></td><td></td> tampone <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>colorante 342003 FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, sterilizzato con filtro</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>a contrasto di fase</tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a blu</td><td></td><td></td><td></td>di tripano</tr><tr><td>Anti-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend 1005616</td><td></td><td>clone RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946; 4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>clone KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>clone MEL-14</td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>es. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Lampada</td><td></td><td></td><td></td>riscaldante</tr><tr><td>Mouse retrattino</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml siringhe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Aghi calibro 18-1&frac12; (sterili)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&fratc12; aghi calibro (sterili)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule cd4 + t cells diabetogenici

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Il diabetico (NOD) topo non obesi sviluppa spontaneamente il diabete autoimmune dopo 12 settimane di età ed è il modello animale più studiato di umani di tipo 1 diabete (T1D). Studi trasferimento di cellule in topi riceventi irradiati hanno stabilito che le cellule T sono fondamentali nella patogenesi T1D in questo modello. Descriviamo qui un metodo semplice per indurre rapidamente T1D dal trasferimento adottivo di purificato, CD4 + cellule T primarie di pre-diabetici topi NOD transgenici per il recettore delle cellule T isolotto-specifica (TCR) BDC2.5 in topi riceventi NOD.SCID. I principali vantaggi di questa tecnica sono che isolamento e trasferimento adottivo di cellule T diabetogene può essere completato entro il giorno stesso, non è richiesta irradiazione dei destinatari, e una elevata incidenza di T1D è suscitato entro 2 settimane dopo il trasferimento delle cellule T. Così, gli studi di patogenesi e di interventi terapeutici nel diabete di tipo 1 possono avvenire a un ritmo più veloce rispetto ai metodi che si basano su eterogenee popolazioni di cellule T o cloniderivato da topi NOD diabetici.

I nostri risultati mostrano l&#39;isolamento di transgenici BDC2.5 cellule che esprimono CD62L, che è fondamentale per le cellule T a casa per organi linfoidi secondari, come i linfonodi pancreatici. I nostri risultati dimostrano ulteriormente la potente capacità di questa popolazione di cellule T monospecifico per il trasferimento rapido ed efficiente T1D di topi riceventi NOD.SCID. Isolamento di diabetogeni CD4 + cellule T dei BDC2.5 topi è mostrato in Figura 2. Circa 5 x ...

Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre rapidamente il diabete di tipo uno nei topi trasferendo cellule T diabetogeniche da topi transgenici a topi privi di cellule T e B endogene. Iniziare prelevando le milze e i linfonodi dai topi donatori e purificando le cellule T positive per CD4. Successivamente, trasferire in modo adottivo le cellule T donatrici purificate in topi riceventi di ceppo non obeso diabetogeno (NOD).Quindi monitorare i topi riceventi per lo sviluppo del diabete di tipo 1. In definitiva, questo protocollo può essere utilizzato per studiare la patogenesi del diabete e per indagare interventi terapeutici rispetto ad altri metodi. Il vantaggio principale di questa tecnica, che prevede il trasferimento di cellule T CD4 positive BDC 2.5 in riceventi non irradiati, è lo sviluppo rapido e riproducibile del diabete di tipo 1.Per i donatori di cellule T CD4 positive diabetogeniche, utilizzare topi femmine BDC 2.5 pre-diabetici di sei settimane di età, determinati privi di diabete mediante misurazione del glucosio nelle urine. Per rimuovere la milza e i linfonodi, inumidire il pelo con etanolo al 70%, quindi tagliare la pelle e tirarla indietro fino a quando i mus

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi. Le cellule sono concentrate in pellet nel tubo finale utilizzato per il trapianto delle cellule sotto la capsula renale. La facilità di questa tecnica riduce lo stress per le cellule e il mouse.

Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici

Descriviamo epatica neo-isolotto formazione STZ (streptozotocina)-indotta topi diabetici mediante trasferimento genico di Neurogenin3 (Ngn3) e Betacellulin (Btc) utilizzando helper-dipendente vettore adenovirale (HDAd) e l'inversione di iperglicemia. Il nostro metodo sfrutta le vettori adenovirali dipendenti da helper con la loro alta efficienza nella trasduzione vivo e l'espressione genica lunga durata.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

Questo video dimostra un metodo basato sull'imaging per visualizzare le cellule beta trapiantate che esprimono luciferasi in un topo diabetico immunodeficiente non obeso. L'introduzione di splenociti da un topo diabetico porta alla progressiva distruzione delle cellule beta, confermata visivamente dal calo della luminescenza dopo l'introduzione del substrato.

Imaging di cellule beta transgeniche in un topo immunodeficiente sfidato con splenociti diabetici

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule T singeniche CD4+CD45RBin riceventi carenti di cellule T e B. Le caratteristiche cliniche e istopatologiche imitano le malattie infiammatorie intestinali umane. Questo metodo consente lo studio dell'inizio dell'infiammazione del colon e della progressione della malattia.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di cellule T CD8 specifiche dell'antigene e la loro espansione in vitro, con l'obiettivo di produrre un numero elevato di cellule T funzionali da utilizzare in vitro e in vivo.

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.

Induzione dell'infiammazione intestinale mediante trasferimento adottivo di cellule T CBir1 TCR transgeniche CD4 + a topi immunodeficienti

Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.

Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Qui, riportiamo un protocollo che stabilisce un modello murino di artrite reumatoide (RA) attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4+ da topi SKG, fornendo uno strumento sperimentale rapido e affidabile per studiare i meccanismi immunologici, la progressione patologica e lo sviluppo di nuovi trattamenti per l'artrite reumatoide.

Un modello di trasferimento adottivo dell'artrite reumatoide nei topi

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Saggi di citotossicità per misurare le risposte delle cellule naturali litici killer per le cellule infettate da HIV è limitata dalla purezza delle cellule bersaglio. Dimostriamo qui l'isolamento di una popolazione altamente purificata di infezione da HIV-1 primario a cellule T colpi sfruttando la capacità di HIV-1 s di down-modulare CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

Impara a indurre rapidamente il diabete di tipo 1 nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule CD4+ T diabetogeniche. Questo metodo riproducibile consente di studiare la patogenesi del diabete e di testare interventi terapeutici in vivo.

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

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