Name: Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4 + CD45RB Alto T Cells in topi immunodeficienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara a indurre colite sperimentale nel topo mediante trasferimento adottivo di cellule T CD4+ CD45RBhigh. Questo modello immunologico replica le caratteristiche delle malattie infiammatorie intestinali umane per studiare patogenesi e terapie.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Gastroenterologiche American Association (AGA) Research Scholars Award e morbo di Crohn e Colite Foundation of America (CCFA) Career Development Award (a SOI), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), e University of North Carolina Centro di Biologia gastrointestinale e la malattia di Grant P30 DK34987 (Istologia Core). Il Fondo UNC Citometria a flusso Core è sostenuto in parte da un nucleo di supporto NSC Centro Grant (P30CA016086) alla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo Luca B. Borst da North Carolina State University College di Medicina Veterinaria per il suo aiuto con analisi istopatologica e immunoistochimica.

NOTA: Assicurarsi che tutti i protocolli animali sono approvati dal e nel rispetto Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) regolamenti e guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Topo donatore può essere maschio o femmina, ma topi riceventi devono essere di sesso maschile. Se i destinatari femmina devono essere utilizzati, i topi donatori devono essere femmina 5. Mantenere le colonie con regolare, biancheria da letto non sterili e acqua non acidificato, in quanto potrebbero avere un impatto del microbiota intestinale, e, quindi, il fenotipo colite dei topi 5,6. Preparazione 1. Sperimentale <ol><li> Utilizzare supporti e tamponi ghiacciate. Mantenere cellule in ghiaccio durante l&#39;esperimento. </li><li> Eseguire l&#39;esperimento in cappa di rischio biologico sterile con tecnica sterile. </li></ol> 2. Isolamento delle cellule della milza T <ol><li> Euthanize topo donatore / mice in CO 2 da camera seguiti da dislocatio cervicalen. Spray addome con etanolo al 70%. </li><li> Fare un incisione orizzontale nell&#39;addome e staccarsi la pelle per esporre il peritoneo. Tenere peritoneo lontano dagli organi interni con le pinze e fare un&#39;incisione nel peritoneo addominale sinistro per esporre e asportare la milza. </li><li> Posizionare la milza in 10 ml di completo media in una capsula di Petri. Rimuovere e gettare il tessuto in eccesso dalla milza. </li><li> Utilizzare 2 vetrini sterilizzati per schiacciare e prendere in giro a parte milza in cella singola sospensione. Sospensione cellulare Filtrare attraverso un filtro 70 micron in una provetta conica da 50 ml e risciacquare il filtro con 5 ml di completo media. Luogo fino a 5 milze in un tubo da 50 ml conica. </li><li> Cellule centrifugare a 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante versando off o per aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in 5 ml per milza di tampone di lisi per lisare i globuli rossi per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere un volume uguale di Complete mezzi (5 ml per milza) al tubo. </li><li&gt; cellule centrifugare a 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante versando off o per aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in 10 ml di Labeling Buffer. </li><li> Contare le celle di trypan esclusione blu. <ol><li> Rimuovere 20 ml di sospensione cellulare e aggiungere 180 microlitri blu trypan ad una provetta per microcentrifuga e mescolare accuratamente. Dopo 5 minuti, aggiungere 10 ml di cellule emocitometro e contare le cellule non-blu al microscopio etichettati. Determinare il numero totale di cellule vitali. Eliminare cell / trypan blue mix. </li></ol></li><li> Centrifugare le cellule in 10 ml di Labeling Buffer a 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante versando off o per aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li></ol> 3. Arricchimento di cellule CD4 + T NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per i prodotti specifici utilizzati in questa sezione. <ol><li> Risospendere delicatamente le cellule a una cella singola sospensione di 20 x 10 6 cellule / ml in freddo LabelBuffer ing. </li><li> Aggiungere 5 ml per 1 x 10 6 cellule di anticorpi arricchimento delle cellule T CD4 biotinilati. Incubare le cellule in ghiaccio per 15 min. </li><li> Aggiungere 10x volume di Labeling Buffer. Cellule centrifugare a 450 g per 7 min. Aspirare accuratamente tutto il surnatante con aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Vortice accuratamente particelle magnetiche streptavidina coniugato. Aggiungere 5 ml di particelle per 1 x 10 6 cellule. </li><li> Mescolare accuratamente, ma delicatamente. Tenere mix a 6-12 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere Labeling Buffer ad una concentrazione di 20-80 x 10 6 cellule / ml. Trasferimento fino a 1,0 ml cellule marcate per 12 x 75 mm provetta a fondo tondo (denominato &quot;tubo positivo frazione&quot;). </li><li> Collocare ogni provetta positiva frazione sulla calamita per 6-8 min. </li><li> Con i tubi positivo frazione ancora sul magnete, trasferire accuratamente surnatante dal tubo positiva frazione con Pasteur vetro pipetta ad un nuovo tubo conico sterili 50 ml (referred come la &quot;frazione arricchita&quot;). Questa frazione arricchita contiene cellule CD4 + T. Fare attenzione a non distruggere le cellule marcate attratti al magnete. </li><li> Risospendere le cellule lasciati nei tubi positivo frazione nello stesso volume di Labeling Buffer come al punto 3.6 pipettando su e giù vigorosamente. Posizionare il tubo positivo frazione indietro calamita per 6-8 min. </li><li> Con i tubi positiva frazione ancora sul magnete, trasferire attentamente surnatante (arricchito frazione, CD4 +) dal tubo di positivo-frazione con vetro Pasteur pipetta per sterile tubo da 50 ml da punto 3.8 senza interrompere le cellule attaccate a magnete. </li><li> Ripetere i passaggi 3,9-3,10 per aumentare la resa delle cellule CD4 + T ottenuti. Continuare protocollo utilizzando frazione arricchita (cellule CD4 +). </li></ol> 4. L&#39;etichettatura e Ordinamento Cells 7 <ol><li> Centrifugare arricchito cellule a 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante versando off o SUCT vuotoione nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di Labeling Buffer. Rimuovere aliquota di cellule per contare e valutare per la vitalità cellulare del trypan blu come al punto 2.9. </li><li> Aggiungere un volume di Labeling Buffer a 10 x 10 6 cellule / ml; se le cellule sono già &lt;10 x 10 6, centrifugare a 450 xg per 7 minuti, scartare il surnatante versando off o di aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti, e aggiungere il volume di Labeling Buffer a 10 x 10 6 cellule / ml. <ol><li> Impostare aliquote separate di circa 5-10 × 10 5 celle ciascuno per le cellule di controllo non colorate, isotipo macchiati, e single-macchiato in tubi microcentrifuga. </li></ol></li><li> Aggiungere 5 ug / ml CD4-FITC e 1 mg / ml CD45RB-PE alle cellule. Aggiungere macchie di controllo isotipico e macchie singoli alla stessa concentrazione di appropriarsi aliquote in tubi microcentrifuga. Mescolare bene ma delicatamente e incubare su ghiaccio al riparo dalla luce per 30 min. </li><li> Aggiungere 10x volume di Labeling Buffer alle cellule e di controllos. Centrifuga 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante mediante aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Risospendere in Labeling Buffer di volume in fase 4.5. Centrifuga 450 xg per 7 minuti. Gettare il surnatante mediante aspirazione di vuoto nel contenitore dei rifiuti. </li><li> Risospendere in Labeling Buffer a 10 x 10 6 cellule / ml. Passare cellule attraverso 70 micron filtro nel tubo FACS. Tenere su ghiaccio al riparo dalla luce fino al momento FACS. </li><li> Impostare e stabilire un&#39;adeguata compensazione sul cell sorter con le cellule non colorate e controlli singoli macchiati. </li><li> Escludi cellule non vitali con forward e side-scatter gating (Figure 1A). Impostare gating per CD4 + e + cellule CD45RB con controlli isotipici macchiato. Cellule CD4 + cancello sulla popolazione. </li><li> Ordina CD4 + cellule in CD45RB alta e CD45RB basse popolazioni utilizzando una semplice istogramma per le cellule PE macchiate in tubi con 2 ml di completo media. Il CD45RB alta </sup&gt; popolazione rappresenta la più alta del 40% di CD4 + CD45RB + cellule (CD45RB alta), e la popolazione bassa CD45RB è il più basso del 20% + CD45RB cellule CD4 + (CD45RB basso; Figura 1B). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Figura 1: flusso rappresentante citometria appezzamenti di popolazioni di cellule CD4 + T CD45RB durante l&#39;analisi FACS (A - C) FITC CD4- e splenociti PE CD45RB-macchiato da donatori C57BL / 6 topi sono stati ordinati per FACS in CD4 + CD45RB alta e CD4 +. CD45RB popolazioni di cellule T basso. Eventi (A) Doppietti stati esclusi nella rappresentazione della dispersione in avanti. (B) I linfociti sono stati gated nella trama in avanti e scatter laterale. (C) CD4 + </sup&gt; cellule T sono stati gated, e cellule (D) CD4 + CD45RB + T sono state tracciate su un PE contro Eventi istogramma. Cellule CD4 + bassi CD45RB sono stati considerati i più bassi del 20% delle cellule + CD45RB. Cellule di alta CD4 + CD45RB sono stati definiti come la più alta del 40% delle cellule + CD45RB. <ol start="11"><li> Eseguire un&#39;aliquota di ciascuna popolazione cellulare sulla macchina FACS per valutare la purezza delle popolazioni. </li><li> Centrifugare allineati cellule a 450 xg per 7 minuti. Risospendere in 1 ml di PBS. Rimuovere aliquota di cellule per contare e valutare per la vitalità cellulare del trypan blu come al punto 2.9. </li></ol> 5. iniezione di cellule in Destinatari <ol><li> Risospendere allineati alle cellule di 4 x 10 6 cellule / ml (CD45RB alta) o 2 x 10 6 cellule / ml (CD45RB basso) in PBS. </li><li> Trasferire 100 ml di cellule di alta CD45RB per destinatario di nuova provetta sterile. Aggiungere 100 ml di PBS perdestinatario di questo tubo. Così, il volume di iniezione totale per animali è di 200 ml, e l&#39;importo totale delle cellule per destinatario è di 4 alti cellule T naive x 10 5 CD4 + CD45RB. </li><li> Se si desidera gruppo sperimentale che riceve le cellule T regolatorie, trasferire 100 ml di cellule di alta CD45RB per destinatario di nuova provetta sterile. Aggiungere 100 ml di CD45RB bassi cellule per destinatario lo stesso tubo. Volume di iniezione totale per animali è di 200 ml; Rapporto di alto CD45RB: CD45RB cellule bassi è di 2: 1. </li><li> Iniettare 100 ml di CD45RB alta o CD45RB alto / basso CD45RB CD4 + cellule per via intraperitoneale nel lato destro e sinistro dell&#39;addome (totale di 200 ml) di ciascun destinatario. </li></ol> 6. Monitoraggio della progressione della malattia in animali destinatari <ol><li> Per valutare lo stato clinico degli animali beneficiari, assegnare punteggi clinici aggregati per le seguenti parameters 8 il giorno dell&#39;iniezione, poi settimanalmente e al momento del sacrificio: <ol><li> Determinare sprecare misurando la perdita di peso: 0 - nessuna perdita di peso; Perdita 0,1-10% del peso corporeo iniziale - 1; 2 - perdita più del 10% del peso corporeo iniziale (Figura 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2: segni patologici clinici e lordi di infiammazione si verificano dopo il trasferimento di tipo selvaggio cellule T CD4 + alta CD45RB in Rag1 - / - e NRDKO topi riceventi 11 (A) i destinatari NRDKO perso in media il 10% del loro peso corporeo iniziale del 5. settimane dopo il trasferimento, mentre Rag1- / - I beneficiari non hanno mostrato segni clinici di malattia in questo momento. Ogni punto rappresenta la percentuale media del peso corporeo iniziale per la coorte ± SEM. **, P &lt;0.005. (B) Alcuni topi hanno sviluppato una grave infiammazione intestinale, come dimostrato dalla presenza di prolasso rettale. Questo è un quadro rappresentativo di prolasso rettale in un topo ricevente NRDKO. (C) fortemente, i due punti sia da Rag1 - / - e NRDKO topi riceventi sono ispessite e accorciati rispetto a due punti dal Rag1 - / - mice e NRDKO senza T cell trasferimento adottivo. I due punti di NRDKO topi riceventi mostrano grave infiammazione e aumento del peso del colon (dati non riportati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Determinare la qualità delle feci mettendo animali in recipiente pulito fino a quando non è passatosgabello: 0 - nessuno; 1 - feci molli; 2 - feci acquose e / o sanguinosa. </li><li> Determinare la salute generale di animale presenza dei seguenti segni di malattia: 0 - no postura ingobbita, setole pelliccia, pelle o lesioni; 1 - uno qualsiasi dei seguenti presente: curvo postura, setole di pelliccia, o lesioni cutanee. </li><li> Determinare la presenza di prolasso rettale: 0 - assente; 1 - presente (Figura 2B). </li></ol></li><li> Sacrifica animali da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale quando hanno perso il 20% del loro peso corporeo iniziale o nel punto desiderato momento, quello che viene prima. Malattia clinica è di solito evidente a partire da settimana 5 post-sazietà. </li><li> Valutare per la gravità della malattia, come descritto in precedenza 5,7. <ol><li> Assegnare punteggi clinici come al punto 6.1 8. </li><li> Misurare la lunghezza del colon e del peso (Figura 2C). </li><li> Eseguire l&#39;analisi istologica di infiammazione5. </li><li> Determinare citochine spontanea in intestinali culture espianto dei tessuti 9, la linfa mesenterica nodi 10, e / o siero 11. <ol><li> In breve, per le culture espianto 9, rimuovere i due punti dopo il sacrificio, aperta longitudinalmente, e pulire con PBS. Incubare due punti in un agitatore orbitale a 250 rpm impostato in completa media per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Tritare il tessuto in piccoli pezzi e incubate a 37 ° C in media completa per 24 ore. Raccogliere il surnatante e utilizzare per la quantificazione di citochine per 100 mg di tessuto di ELISA. </li></ol></li><li> Eseguire caratterizzazione ex vivo di fenotipi di cellule T e / o la funzione 10. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui si descrive un protocollo step-by-step indurre infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule CD4 + T + CD45RB in topi immunodeficienti. Abbiamo usato milza C57BL / 6 donatori e Rag1 singenico - / - topi riceventi, anche se altri ceppi (ad esempio, BALB / c, 129S6 / SvEv, non-obesi diabetici (NOD)) Modelli e genetici di immunodeficienza (ad esempio, SCID, Rag2 - / -) può essere utilizzato anche 4,14-16.<...

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) Il morbo di Crohn e la colite ulcerosa derivano da un'interazione complessa e non completamente definita tra le risposte immunitarie dell'ospite, la suscettibilità genetica, i fattori ambientali e il contenuto luminale enterico1. Recenti studi di associazione sull'intero genoma riportano associazioni tra i geni regolatori delle cellule immunitarie e la suscettibilità all'IBD2,3. In questi studi sono rappresentati sia i geni intrinseci delle cellule immunitarie innate che quelli adattativi, indicando un ruolo centrale per queste popolazioni cellulari nella patogenesi delle IBD.
Attualmente esistono più di 50 modelli animali di IBD umana. Sebbene nessun modello fenocopia perfettamente l'IBD umana, molti sono utili per studiare vari aspetti della malattia umana, tra cui l'insorgenza e la progressione della malattia e la risposta alla guarigione delle ferite. Nel metodo qui descritto, l'infiammazione intestinale viene avviata con il trasferimento adottivo di cellule T singeneiche splenicheCD4+CD45RB in topi riceventi carenti di cellule T e B4. La popolazione di cellule TCD4+CD45RB contiene principalmente cellule T naive preparate per l'attivazione che sono in grado di indurre infiammazione cronica dell'intestino tenue e del colon. Questo metodo consente al ricercatore di modificare le variabili sperimentali chiave, comprese le popolazioni di cellule immunitarie innate e adattative, per rispondere a domande biologicamente rilevanti relative alla patogenesi della malattia. Inoltre, questo metodo fornisce un inizio preciso dell'insorgenza della malattia e un decorso temporale sperimentale ben caratterizzato. Ciò consente lo studio cinetico delle caratteristiche cliniche della progressione della malattia nei topi. L'infiammazione intestinale indotta da questo metodo condivide molte caratteristiche con l'IBD umana, tra cui l'infiammazione transmurale cronica dell'intestino crasso e tenue, la patogenesi guidata da citochine come TNF e IL-12 e sintomi sistemici come il deperimento5. Pertanto, è un sistema modello ideale per studiare la patogenesi dell'IBD umana.
Il metodo qui descrive in dettaglio il protocollo per indurre la colite sperimentale mediante trasferimento adottivo di cellule TCD4+CD45RB alte in topi Rag1-/-. Discutiamo i passaggi tecnici chiave, i risultati attesi, l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi. Affrontiamo gli elementi necessari per il successo dello sviluppo di questo modello murino di infiammazione intestinale a scopo di ricerca.

<table><tbody><tr><td>Nome del reagente/</td><td>Apparecchiatura Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti/Descrizione</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tubo a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conico</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Ago</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conico</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956; m Filtro cellulare</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> completo <td>RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0,0004% &beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS tubo + filtro</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>FBS inattivato a caldo</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di marcatura <td>1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lisi <td>0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr>Set <tr><td>per l'arricchimento dei linfociti T CD4 di topo</td><td></td><td></td> MoFlo XDP Beckman Coulter - DM BD Biosciences 558131 <td></td></tr><tr><td>IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>di</td> topo 553457 <td></td></tr><tr><td>IgG2b-FITC di topo</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td></td><td></td> di penicillina-streptomicina, 100X <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Petri Dish Fisherbrand</td><td></td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo puro 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>RPMI-1640, 1% penna/streptococco, 0,0004% &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

induzione di murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di effector cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; alto</sup&gt; t cells in topi immunodeficienti

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Ci sono molti modelli animali differenti disponibili per lo studio della patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali umane (IBD), ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi. Descriviamo qui un modello di colite sperimentale che è iniziata da trasferimento adottivo di cellule della milza alta T CD4 + CD45RB singenici in T e cellule B topi riceventi deficienti. La popolazione di cellule T CD4 + alta CD45RB che consiste in gran parte di cellule effettrici naïve è in grado di indurre infiammazione intestinale cronica, molto simili aspetti chiave di IBD umana. Questo metodo può essere manipolato per studiare gli aspetti di insorgenza della malattia e la progressione. Inoltre può essere utilizzata per studiare la funzione di innata, adattabile e popolazioni regolamentazione cellule immunitarie, e il ruolo delle esposizioni ambientali, cioè, il microbiota, infiammazione intestinale. In questo articolo si illustra il metodo per indurre la colite con un protocollo passo-passo. Questo incLudes un video dimostrativo di aspetti tecnici chiave necessari per sviluppare con successo questo modello murino di colite sperimentale per scopi di ricerca.

Circa 10 x 10 6 CD4 + CD45RB cellule di alta T da 10 milza di adulti C57BL / 6 topi donatori sono affidabile isolati. Questo numero varia a seconda dell&#39;età e la tensione del mouse donatore e la competenza del ricercatore. Quando 4 x 10 5 C57BL / 6 celle ad alta T CD4 + CD45RB vengono trasferiti in C57BL / 6 Rag1 - / - topi riceventi, i segni clinici della malattia emergono intorno settimana 5 post-sazietà o prima, se i topi sono g...

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule T singeniche CD4+CD45RBin riceventi carenti di cellule T e B. Le caratteristiche cliniche e istopatologiche imitano le malattie infiammatorie intestinali umane. Questo metodo consente lo studio dell'inizio dell'infiammazione del colon e della progressione della malattia.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un'infiammazione intestinale mediante il trasferimento adottivo di linfociti T naïve in topi immunodeficienti. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le cellule dalle milze di topo, lisando le cellule del sangue e arricchendo quindi la popolazione per linfociti T positivi per CD four. Il secondo passaggio consiste nell'etichettare queste cellule con anticorpi fluorescenti DI coniugati anti-CD four e anti-CD 45 RB.Successivamente, le cellule marcate vengono separate mediante FACS in popolazioni CD45 RB bassa e CD45 RB alta. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire le cellule CD45 RB alta in topi immunodeficienti mediante iniezione intraperitoneale. In definitiva, le cellule trasferite vengono attivate e causano danni tissutali locali in assenza di cellule T regolatorie, determinando una colite sperimentale.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nello studio delle malattie infiammatorie intestinali, come il ruolo di specifiche popolazioni cellulari e della microbiota gastrointestinale nella patogenesi della malattia. Dopo l'eutanasia del topo donatore, spruzzare l'addome con etanolo al 70% per sterilizzare la zona. Quindi effettuare un'incisione orizzontale sull'addome ed esporre il peritoneo sollevando la pelle con una pinzetta.Tenere il peritoneo lontano dagli organi interni ed effettuare un'incisione nel peritoneo addominale sinistro. Successivamente, escindere la milza dal topo e posizionarla in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di mezzo completo freddo di ghiaccio. Schiacciare la milza con due vetrini sterili per ottenere una sospensione monocellulare.Filtrare le cellule attraverso un setaccio da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri, quindi risciacquare il setaccio con cinque millilitri di mezzo completo, raccogliendo fino a cinque milze in un unico tubo conico. Successivamente, centrifugare le cellule a 450 ×g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il sopranatante in un contenitore per rifiuti e quindi risospendere delicatamente le cellule in 10 millilitri di tampone di marcatura freddo su ghiaccio.Combinare 20 microlitri di sospensione cellulare con 180 microlitri di soluzione al 0,4% di trian blu e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a un emocitometro e contare il numero di cellule non blu al microscopio per iniziare l'arricchimento del pellet e risospendere delicatamente le cellule in buffer di etichettatura ghiacciato alla concentrazione di 20 × 10⁶ cellule per millilitro. Aggiungere 5 microlitri di anticorpo di arricchimento per cellule T CD4 biotinilato per ogni 1 × 10⁶ cellule, quindi incubare le cellule sul ghiaccio con l'anticorpo per 15 minuti.Aggiungere un volume di buffer di etichettatura pari a 10 volte quello della sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule a 450 ×g per sette minuti. Aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Successivamente, risospendere i microparticelle magnetiche coniugate con streptavidina mediante vortex e aggiungere cinque microlitri di microparticelle per 1 × 10⁶ cellule alle cellule.Mescolare le particelle con le cellule agitando leggermente il tubo, quindi incubare la miscela a sei-dodici gradi Celsius per 30 minuti. Ri-sospendere le cellule a una concentrazione di 20-80 × 10⁶ cellule per millilitro con il buffer di marcatura. Successivamente, trasferire un millilitro di cellule marcate in un tubo da prova rotondo da 12 millimetri per 75 millimetri e posizionare questo tubo della frazione positiva su un magnete per sei-otto minuti.Con il tubo sul magnete, rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta Pasteur di vetro senza disturbare le cellule marcate e trasferirlo in un nuovo tubo conico sterile da 50 millilitri. Questa frazione contiene le cellule T positive per CD4. Rimuovere il tubo della frazione positiva dal magnete e risospendere le cellule nel buffer di marcatura pipettando vigorosamente.Riportare il tubo sul magnete per altri sei-otto minuti. Nuovamente, trasferire con attenzione il SUP nain nel tubo della frazione arricchita. Aumentare il rendimento di cellule T positive al CD4 ripetendo l'arricchimento secondo necessità per preparare le cellule all'etichettatura. Centrifugare innanzitutto la frazione arricchita a 450 × g per sette minuti e scartare il soprannuante.Quindi risospendere le cellule nel buffer di marcatura a una concentrazione di 10 × 10⁶ cellule per millilitro. Aliquotare 5 × 10⁵ cellule in provette microcentrifuga individuali per le cellule di controllo non colorate, colorate con isotopo e singolarmente colorate. Successivamente, aggiungere 5 µg/mL di anticorpi CD4-FE e 1 µg/mL di anticorpi CD45RB-PE al tubo contenente la sospensione cellulare originale.Aggiungere le colorazioni di controllo con isotopi e le colorazioni singole alla stessa concentrazione alle aliquote cellulari appropriate. Mescolare delicatamente le cellule con gli anticorpi e quindi incubare i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Coprire i tubi per proteggerli dalla luce.Successivamente, lavare le cellule due volte nel buffer di etichettatura come indicato nel protocollo e risospendere le cellule a 10 volte 10 alla sesta cellule per millilitro nel buffer di etichettatura. Quindi far passare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 70 micron in un tubo FACS. Posizionare il tubo sul ghiaccio e coprirlo per prevenire lo sbiancamento fotochimico dei coloranti.Utilizzare le cellule di controllo non colorate e a singolo stadio per calibrare la compensazione sul citofluorimetro. Escludere le cellule non vitali mediante l'uso di porte basate sulla diffusione della luce in avanti e laterale. Impostare quindi le porte per le cellule positive per CD4 e per le cellule positive per CD4 RB utilizzando i controlli colorati con isotopo.Successivo, selezionare la popolazione positiva per CD4 e quindi ordinare le cellule in popolazioni CD45, RB alta e CD45 RB bassa. Raccogliere le cellule in provette contenenti due millilitri di terreno completo e quindi analizzare un'aliquote di circa 10 volte 10 alla terza cellule di ciascuna frazione sul citometro a flusso per valutare la purezza del campione. Preparare le cellule CD45 RB alta e CD45 RB bassa per l'iniezione, lavarle e risospendere in PBS alla densità cellulare appropriata, come indicato nel protocollo. Successivamente, immobilizzare fermamente il topo ricevente e iniettare 100 microlitri della sospensione cellulare per via intraperitoneale nei lati destro e sinistro dell'addome.Monitorare i topi riceventi per i parametri clinici indicati nel protocollo testuale ogni settimana. Di solito, la progressione della malattia dopo l'iniezione diventa evidente alla quinta settimana. Sacrificare un topo in un punto temporale predeterminato o quando ha perso il 20% del suo peso corporeo iniziale ed estrarre il colon.Quindi misurare e registrare la lunghezza e il peso del colon. Cellule T CD4 positive CD45 RB high sono state trasferite nei topi riceventi knock-out per rag uno e nei topi riceventi doppio knock-out NFIL3 RAG1 a cinque settimane dal trattamento. I topi doppio knock-out avevano perso il 10% del loro peso corporeo iniziale, così come i colon sia dei topi knock-out per rag uno che dei topi doppio knock-out.I topi riceventi presentavano colon ispessiti e accorciati rispetto a quelli dei topi di controllo CD4 positivi per cellule T CD45RB elevate trasferite in topi riceventi knock-out per rag1 e in topi riceventi knock-out per rag1 con mutazione delta P110. Un'analisi istologica a tre settimane dal trasferimento ha rivelato iperplasia epiteliale, infiltrati di cellule infiammatorie e ascessi criptici nei riceventi knock-out per rag1 con mutazione delta, ma non nei topi knock-out per rag1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro-sei ore se effettuata correttamente.

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Immunologia e Infezioni

Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T...

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

Il trapianto di pelle di coda è un potente modello per studiare il rigetto dipendente dalle cellule T e l'induzione della tolleranza durante le risposte immunitarie allogeniche nei topi. I vantaggi di questo protocollo sono la chirurgia invasiva minore e la facilità di monitoraggio senza la necessità di sacrificare il topo ricevente.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

In questo modello di colite guidata dall'antigene, le cellule T CD4+ OT-II che esprimono una proteina fluorescente rossa sono state trasferite adottivamente in topi RAG-/- che esprimono una proteina fluorescente verde nei fagociti mononucleati (MP). Gli ospiti sono stati sfidati con Escherichia coli (E.coli) che esprime la proteina dell'ovoalbumina (OVA) fusa con una proteina fluorescente ciano (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.

Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

Qui presentiamo un protocollo per l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule T regolatorie gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre localmente alte concentrazioni della vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e la vitamina attiva A (acido retinoico o RA) de novo.

In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.

Induzione dell'infiammazione intestinale mediante trasferimento adottivo di cellule T CBir1 TCR transgeniche CD4 + a topi immunodeficienti

L'interazione tra suscettibilità genetica, immunità mucosa e ambiente microecologico intestinale è coinvolta nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). In questo studio, abbiamo applicato il trapianto di microbiota fecale a topi carenti di IL-10 e abbiamo studiato il suo impatto sull'infiammazione del colon e sulla funzione cardiaca.

Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

Lo studio dimostra il ruolo della pelle nella modulazione delle risposte immunitarie nei topi attraverso l'immunizzazione epicutanea (EC). L'immunizzazione EC con un antigene proteico può sopprimere le risposte immunitarie nell'ipersensibilità da contatto o invertire la soppressione indotta dalla pelle se combinata con modelli molecolari associati a patogeni. L'immunizzazione EC si dimostra promettente come approccio efficace e senza ago all'immunoterapia.

Modello murino di immunomodulazione indotta per via epicutanea

Impara a indurre colite sperimentale nel topo mediante trasferimento adottivo di cellule T CD4+ CD45RBhigh. Questo modello immunologico replica le caratteristiche delle malattie infiammatorie intestinali umane per studiare patogenesi e terapie.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4 + CD45RB Alto T Cells in topi immunodeficienti (Video) | JoVE Journal

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4

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