Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4 ⁺ CD45RB ^Alto T Cells in topi immunodeficienti

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre l'infiammazione intestinale mediante il trasferimento adottivo di cellule T naive in topi immunodeficienti. Ciò si ottiene isolando prima le cellule dalla milza di topo, lisando le cellule del sangue e quindi arricchendo la popolazione per CD quattro cellule T positive. Il secondo passo consiste nell'etichettare queste cellule con anticorpi fluorescenti DI coniugati CD 4 e CD 45 RB.

Successivamente, le cellule marcate vengono ordinate utilizzando i dati in popolazioni CD 45, RB basse e CD 45 RB alte. Il passaggio finale consiste nel trasferire le cellule alte del CD 45 RB in topi immunodeficienti mediante iniezione intraperitoneale. Alla fine, le cellule trasferite vengono attivate e causano danni tissutali locali in assenza di cellule T regolatorie, con conseguente colite sperimentale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle malattie infiammatorie intestinali, come il ruolo di specifiche popolazioni cellulari e del microbiota gastrointestinale nella patogenesi della malattia. Dopo l'eutanasia del topo donatore, spruzzare l'addome con etanolo al 70% per sterilizzare l'area. Quindi praticare un'incisione orizzontale sull'addome e staccare la pelle per esporre il peritoneo usando una pinza.

Tenere il peritoneo lontano dagli organi interni e praticare un'incisione nel peritoneo addominale sinistro. Quindi, asportare la milza dal topo e metterla in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di terreno completo ghiacciato. Frantumare la milza con due vetrini sterili per ottenere una sospensione a cellula singola.

Filtrare le cellule attraverso un colino da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri e quindi sciacquare il colino con cinque millilitri di ceppo medio completo fino a cinque milze in un tubo conico. Quindi, centrifugare le celle a 450 volte G per sette minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante in un contenitore per rifiuti e quindi risospendere delicatamente le cellule in 10 millilitri di tampone per etichettatura a freddo ghiacciato.

Combinare 20 microlitri di sospensione cellulare con 180 microlitri di soluzione di trian blue allo 0,4% e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a un emocitometro e contare il numero di cellule non blu al microscopio per iniziare il pellet di arricchimento e sospendere delicatamente le cellule in un tampone di marcatura a freddo ghiacciato a una concentrazione di 20 volte 10 per le sei cellule per millilitro. Aggiungere cinque microlitri di anticorpi biotinilati per l'arricchimento delle cellule T CD quattro volte 10 alle sei cellule, quindi incubare le cellule su ghiaccio con l'anticorpo per 15 minuti.

Aggiungere 10 volte il volume del tampone di marcatura alla sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule a 450 volte G per sette minuti. Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Successivamente, risospendere le particelle magnetiche coniugate con streptavidina mediante vortice e aggiungere cinque microlitri di particelle per uno volte 10 alle sei cellule delle cellule.

Mescola le particelle con le cellule muovendo delicatamente la provetta e poi incuba la miscela a una temperatura compresa tra sei e 12 gradi Celsius per 30 minuti. Risospendere le cellule a una concentrazione da 20 a 80 volte 10 a sei cellule per millilitro con tampone di marcatura. Quindi trasferire un millilitro di cellule marcate in una provetta a fondo tondo da 12 millimetri per 75 millimetri e posizionare questa provetta a frazione positiva su un magnete per sei-otto minuti.

Con la provetta sul magnete, rimuovere con cura il surnatante con una pipetta per pasta di vetro senza disturbare le cellule marcate e trasferirlo in una nuova provetta conica sterile da 50 millilitri. Questa frazione contiene le cellule T positive CD. Rimuovere la provetta della frazione positiva dal magnete e risospendere le cellule nel tampone di marcatura pipettando energicamente.

Rimetti il tubo nel magnete per altri sei-otto minuti. Anche in questo caso, trasferire con cura il SUP nain nel tubo della frazione arricchita. Aumentare la resa di quattro cellule T positive CD ripetendo l'arricchimento necessario per preparare le cellule per la marcatura Per prima cosa, centrifugare la frazione arricchita a 450 volte G per sette minuti e scartare il surnatante.

Quindi risospendere le cellule nel tampone di marcatura a una concentrazione di 10 volte 10 per la sesta cellula per millilitro. Aliquotare cinque volte 10 delle quinte cellule in singoli tubi micro fuge per cellule di controllo colorate con isotopi non colorati e cellule di controllo colorate singolarmente. Quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro di anticorpi CD 45 RB PE alla provetta contenente la sospensione cellulare originale.

Aggiungere le colorazioni di controllo isotopica e le singole colorazioni alla stessa concentrazione alle aliquote cellulari appropriate. Mescolare delicatamente le cellule con gli anticorpi e poi incubare le provette con ghiaccio per 30 minuti. Copri i tubi per proteggerli dalla luce.

Successivamente, lavare le cellule due volte nel tampone di marcatura come indicato nel protocollo di testo e risospendere le cellule a 10 volte 10 delle sei cellule per millilitro nel tampone di marcatura. Quindi passare la sospensione cellulare attraverso un colino da 70 micron in un tubo fax. Posizionare il tubo sul ghiaccio e coprirlo per evitare lo sbiancamento fotografico delle macchie.

Utilizzare le celle di controllo non colorate e a stadio singolo per calibrare la compensazione sulla selezionatrice di cellule. Escludere le celle non vitali utilizzando il gating sparso in avanti e lateralmente. E poi impostare il gating per le celle CD quattro positive e CD quattro RB positive con i controlli colorati con isotopi.

Al cancello successivo, la popolazione CD quattro positiva e quindi ordinare le cellule in popolazioni CD 45, RB alte e CD 45 RB basse. Raccogliere le cellule in provette contenenti due millilitri di terreno completo, quindi eseguire un'aliquota di circa 10 volte 10 alle terze cellule di ciascuna frazione sul selezionatore di cellule per valutare la purezza del campione per preparare le cellule CD 45 RB high e CD 45 RB low per l'iniezione, lavarle e risospenderle in PBS alla densità cellulare appropriata come indicato nel protocollo di testo. Quindi, trattenere saldamente il topo ricevente e iniettare 100 microlitri di sospensione cellulare intraperitoneale nei lati destro e sinistro dell'addome.

Monitorare i topi riceventi per i parametri clinici come indicato nel protocollo di testo ogni settimana. La progressione della malattia dopo l'iniezione è tipicamente evidente alla quinta settimana. Sacrifica un topo in un momento predeterminato o quando ha perso il 20% del suo peso corporeo iniziale ed estrai il colon.

Quindi misura e registra la lunghezza e il peso del colon. CD, quattro cellule T positive CD 45 RB sono state trasferite a topi riceventi RAG one knockout e NFIL, tre RAG un doppio knockout entro cinque settimane dopo l'iniezione. I topi avevano perso il 10% del loro peso corporeo iniziale, i due punti di entrambi i topi di uno e doppio knockout.

I topi riceventi erano ispessiti e accorciati rispetto ai colon dei topi di controllo CD quattro cellule T alte CD positive 45 RB per un trasferimento a topi riceventi mutanti 10 delta L'analisi istologica a tre settimane dopo il trasferimento ha indicato iperplasia epiteliale, infiltrati di cellule infiammatorie e ascessi criptici nei riceventi delta knockout ma non topi knockout una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in quattro o sei ore se eseguita correttamente.