Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

Questo protocollo consente di generare un gran numero di cellule T funzionali specifiche dell'antigene che sono un approccio sicuro desiderato nel trattamento delle malattie autoimmuni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ti fornisce un processo di trasduzione altamente efficiente e un gran numero di cellule T funzionali. Questa tecnica può essere estesa per trattare il diabete di tipo 1 e altre malattie autoimmuni in cui sono noti gli antigeni.

Inoltre, le cellule CAR T possono essere un trattamento promettente per alcuni tipi di cancro. Questo metodo può essere utilizzato per generare cellule immunitarie che esprimono altri CAR. È importante avere una buona tecnica accettata, leggere l'intero protocollo e pianificare l'intero esperimento in anticipo.

Questo protocollo di due settimane include mini-passaggi e il successo dipende dalle prestazioni corrette di ogni passaggio. Le dimostrazioni visive di questo metodo sono fondamentali per gli studenti da seguire correttamente. Preparare le celle di Phoenix per la trasfezione come descritto nel manoscritto.

È buona pratica contrassegnare la parete laterale dove verrà aggiunto e rimosso il mezzo per ridurre al minimo il soffiaggio delle celle. Il giorno zero aspirare il supernatante dalle cellule e lavarle con cinque millilitri di PBS. Aggiungere con cura sette millilitri di siero ridotto medio dropwise alla parete laterale della piastra e trasferire le cellule all'incubatrice.

Aggiungere 1,5 millilitri di siero ridotto medio a due tubi in polipropilene rotondo da 14 millimetri. Aggiungere 40 micrometri di reagente di trasfezione a uno dei tubi e 15 microgrammi di plasmide CAR reindirizzato dall'anticorpo insieme a cinque microgrammi di plasmide da imballaggio all'altro. Incubare i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti e quindi aggiungere il reagente di trasfezione al tubo plasmide.

Mescolare tubazione delicatamente la soluzione su e giù tre volte e incubarla a temperatura ambiente per almeno 20 minuti. Aggiungere tre millilitri della miscela alle cellule di Phoenix e metterli in un'incubatrice di coltura tissutale. Dopo quattro o cinque ore aggiungere un millilitro di FCS alle cellule e culturerle durante la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, rimuovere il supernatante dalle cellule e aggiungere quattro millilitri di nuovo mezzo di coltura prebellica. Raccogliere il virus il secondo giorno raccogliendo il virus contenente il mezzo dalle cellule di Phoenix e filtrandolo per rimuovere i detriti cellulari residui. Aggiungere il materiale UMANO IL-2 ricombinante al virus per una concentrazione finale di 200 unità internazionali per millilitro e utilizzarlo immediatamente per la trasduzione.

Aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco alle cellule phoenix e posizionarli nell'incubatrice durante la notte. Ripetere la raccolta dei virus il giorno successivo per una seconda trasduzione e scartare le cellule. Un giorno prima di seminare cellule MURINE CD8 T, aggiungere un millilitro di una miscela di anticorpi ANTI-mouse CD3 e CD28 ad ogni pozzo di una piastra di 24 pozzetti e incubare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno zero, raccogli le milza di topo e mettile su un colino cellulare che assorbe 10 millilitri di PBS in un piatto di coltura cellulare sul ghiaccio. In un cappuccio di coltura cellulare, tagliare ogni milza in tre o cinque pezzi e utilizzare uno stantuffo sterile di una siringa per premere il tessuto attraverso la rete metallica. Rimuovere delicatamente i globuli rossi rimescolando gli splenociti in uno o quattro tamponi diluiti di lisi dei globuli rossi e incubandoli a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi diluire 10 microlitri della sospensione cellulare con Trypan Blue per il conteggio delle cellule.

E pellettò il resto delle cellule centrifugando a 350 volte g per sette minuti. Utilizzare un kit di isolamento cellulare CD8 T del mouse per arricchire le cellule T CD8 e sospendere i pellet cellulari in 400 microlitri di tampone con 100 microlitri di cocktail di anticorpi alla biotina per uno per 10 alle otto cellule. Mescolare bene la sospensione cellulare e incubarla per cinque minuti a quattro gradi Celsius per consentire il legame anticorpale.

Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone di etichettatura e 200 microlitri di MicroBead anti-biotina per uno per 10 alle otto cellule. Mescolare bene e incubare per altri 10 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, impostare una colonna di separazione sul separatore e lavarla con tre millilitri di tampone di etichettatura.

Mettere un colino a celle di 40 micrometri sulla parte superiore di una colonna e passare un millilitro della perla e della miscela cellulare attraverso il colino nella colonna di separazione. Raccogliere il flusso attraverso un tubo prechilled da 15 millilitri e lavare la colonna secondo le indicazioni del produttore, raccogliendo gli effluenti nello stesso tubo. Contare le cellule e raccoglierle per centrifugazione a 350 volte g per cinque minuti.

Lavarli con due millilitri di mezzo cellulare T e centrifugare di nuovo. Quindi li ha rimorsi in mezzo cellulare T prebellico ad una concentrazione di 250.000-500.000 cellule per millilitro. Lavare tre volte le piastre rivestite con anticorpi CD3 e CD28 precedentemente preparate con un millilitro di PBS sterile e aggiungere due millilitri della sospensione cellulare ad ogni pozzo.

Utilizzare un movimento vorticoso per erogare le celle in modo uniforme. Come controllo, placcare lo stesso numero di cellule CD8 T in un singolo pozzo non rivestito della piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di serbatoi di gas di anidride carbonica al 10% per 48 ore. Il primo giorno, preparare piastre rivestite con frammenti di fibronectina umana aggiungendo 0,5 millilitri di fibronectina ai pozzi di una piastra di 24 po 'e incubandola durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo rimuovere la soluzione di fibronectina e aggiungere un millilitro di 2%BSA e PBS per pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare i pozzi trattati con un millilitro di PBS sterile. La piastra è pronta per l'uso dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio.

Contare le celle CD8 T attivate utilizzando Trypan Blue. Raccoglili per centrifugazione. E li rimussò a cinque milioni di cellule vitali per millilitro per la trasduzione.

Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare CD8 attivata ad ogni pozzo della piastra rivestita con fibronecina. Quindi aggiungere da 1,5 a due millilitri del virus precedentemente preparato contenente mezzo e mescolare utilizzando un movimento vorticoso per erogare uniformemente le cellule. Sigillare la piastra in una borsa Ziploc e centrifugarla a 2.000 volte g per 90 minuti a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la piastra dalla centrifuga e portarla in un armadietto di sicurezza biologico. Rimuovere con cura il sacchetto di plastica e assicurarsi che l'esterno della piastra non sia contaminato da mezzo. Trasferire la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius.

Dopo quattro ore, rimuovere un millilitro di mezzo da ogni pozzo, sostituirlo con un millilitro di mezzo cellulare T completo prebellito e rimettere la piastra nell'incubatrice. Gli aspetti critici di questo protocollo sono un virus ad alto formicolio, cellule T attivate sane e il metodo di trasduzione appropriato. Le celle sono state co-macchiate con pe dimensione sette coniugato anti-CD8, AF647 coniugato anti-CD3, e BV 421 coniugato anti-CD28 per l'analisi citometrica del flusso.

Circa, il 70% delle cellule CD8 T ha co-espresso GFP che indica l'espressione CAR. Hanno anche co-espresso CD28 e CD3. È importante sottolineare che tutte le cellule positive GFP di prova sono anche co-macchiate con tetrameri BR3 di insulina I-Ag7 che indicano l'espressione di CAR sulla superficie cellulare ma non con il tetramero di controllo.

Inoltre, il test ordinato e il controllo delle cellule CAR T hanno secreto alti livelli di gamma di interferone solo dopo la cocoltura con cellule bersaglio che esprimono i loro ligandi affini che conferma che le cellule trasdotte hanno un fenotipo di cellule T dell'effettore CD8 diretto verso il bersaglio degli anticorpi genitori. La trasduzione di cellule produttrici di virus, l'isolamento delle cellule T CD8 primarie e l'attivazione di queste cellule T sono i passaggi più importanti di questo esperimento. Avere cellule T attivate sane e trasduzione di queste cellule T con reagenti appropriati garantisce risultati favorevoli.

Questo metodo può essere utilizzato per trasdurre altre celle T, ma deve essere personalizzato per il tipo di cella T specifico. Questo protocollo apre la strada alla prevenzione del diabete di tipo 1 con terapia cellulare T del recettore dell'antigene chimerico specifico dell'antigene.