İnsan 3D Doku Mühendisliği In vitro Tümör Test Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerden arındırılmış bir biyolojik iskele üzerinde birincil hücrelerle bir 3D tümör test sistemi oluşturmaktır. Bu, ilk olarak, bir domuz segmentinin hücre giderme çözeltisi ile pompalandığı bir hücre giderme işlemi kullanılarak iskelenin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, standart bir izolasyon protokolü kullanarak birincil insan hücrelerini bir hastanın biyopsisinden izole etmektir.

Daha sonra, boru şeklindeki ince bağırsak submukozasını bir taraftan keserek, iki metal halka arasına sabitleyerek ve tanımlanmış hücre yoğunluklarında tümör hücreleri ve ilişkili stromal hücrelerle tohumlayarak tümör test sistemini kurun. Son adım, hücre yüklü yapıyı statik veya dinamik koşullar altında uygun bir kurulumda kültürlemektir. Sonuçta, tümör büyümesinin özelliklerini değerlendirmek için immünohistokimyasal mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin TT tümör test sistemleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemle, bir tümörün in vivo koşullarını yaygın 2D modellerden daha doğru bir şekilde simüle eden 3D doku modelleri oluşturmanın mümkün olmasıdır. Dinamik kültürün avantajı, hücreye özgü özelliklerin korunmasıdır. Bu yöntem, kanser hücrelerinin 3 boyutlu bir ortamda hücre hücresi ve hücre matrisi etkileşimlerini nasıl oluşturduğu gibi tümör biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bu da tümör ilerlemesi ve metastaz gibi kanserle ilgili süreçleri aydınlatmaya yardımcı olacaktır.

Bu tümör test sisteminde kullanılan biyolojik vaskülarize iskele veya biyova, bir domuz jaal segmentinden türetilmiştir. Domuz segmentinin vasküler sistemini ve bağırsak lümenini kanüllü arteriyel erişim yoluyla PBS ile durulayın. Tamamen temiz olana kadar tekrarlayın.

Dört adaptörlü 200 milimetre çapında bir cam tank hazırlayın ve bunları silikon tüplerle peristaltik pompaya bağlayın. Basınç kontrol ünitesi, steril tek kullanımlık bir kubbeye bağlı bir basınç sensörü aracılığıyla izlenebilir. Rezervuar şişelerini hücre giderme veya DZ solüsyonu ile doldurun.

Boru sisteminde olası hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Luminal akış için bağırsak lümenini kablo bağlarıyla cam konektörlere bağlayın. 500 mililitre DZ çözeltisini vasküler sistemin kırmızı arteriyel erişimine pompalayın.

Tüm bağırsak lümenini manuel olarak bastırmak için pompalama işlemini her 15 dakikada bir kısa bir süre içinde durdurun. Hücre giderme işlemi sırasında tampon çözeltisinin basıncını izlemek önemlidir. Basınç, doğal kan basıncından sonra modellenen 80 ila 100 milimetre cıva arasında olmalıdır.

Biova'yı hücre kalıntılarından arınana ve vasküler yapı tamamen beyaz renkte olana kadar PBS ile yıkayın. Bu prosedüre, deri biyopsisini bir neşter ile iki ila üç milimetre genişliğinde şeritler halinde keserek ve PBS solüsyonu ile üç kez durulayarak başlayın. Dokuyu disbe solüsyonu ile inkübe ettikten sonra, epidermisi dermisten ayırmak için iki cımbız kullanın.

Primer dermal mikrovasküler endotel hücrelerini izole etmek için her ikisini de ayrı ayrı PBS ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın veya MV EECS dermis şeritlerini durulayın Ene ile bir kez, dermis şeritlerine EDTA çözeltisinde 10 mililitre trip ekleyin ve 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin. Enzim reaksiyonunu %1 FCS ile durdurun ve deri şeritlerini vasküler yaşamla dolu bir Petri kabına aktarın. Her bir şeridi neşterle her iki tarafta sekiz kez çizin ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için biraz basınç ekleyin.

Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve resüsleyin, hücre peletini vasküler ömür boyu askıya alın. Fibroblastları izole etmek için. İlk olarak, dermis şeritlerini küçük parçalar halinde doğramak için bir neşter kullanın.

Dermis parçalarını bir Falcon tüpüne aktarın ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edilmiş 10 mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Ardından, çözeltiyi santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletleri DMEM artı %10 FCS artı %1 kalem strep ile yıkayın.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın, peleti kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücrelerin statik koşullar altında doku inkübe edilmesinden büyümesine izin vermek için bir T 75 kültür şişesine aktarın. Önce tümör test sistemini kurmak için, boru şeklindeki ince bağırsak submukozasını veya SIS mukozasını kesin, bir tarafı açın ve iki metal halka arasına sabitleyin. Bu kendi kendine inşa edilen hücre kronlarının çapı 10 milimetredir.

Ertesi gün gece boyunca SIS mu'yu hücre kültürü ortamında örtün, birincil MVE CS'yi SIS'in bazal sonraki yüzeyine tohumlayın, eski CI.37 santigrat derecede, üç saat boyunca% 5 karbondioksitte inkübe edin. Üç saat sonra, daldırılmış kültürü sağlamak için kuyuyu orta ile doldurun ve inkübatöre geri koyun. Endotel hücrelerinin üç gün sonra üç gün boyunca yapışmasına izin verin.

Statik kültür sistemini 180 derece çevirin ve 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra, SIS'in apikal yüzeyindeki primer dermal fibroblastlar ve tümör hücrelerinin bir karışımına bakın. Eski lümenin tarafı.

Hücrelerin üç saat boyunca yapışmasına izin verin. Kültür kültürünü, tümör test sistemini 37 santigrat derecede statik koşullar altında, 5 gün daha% 14 karbondioksite daldırmak için kuyuyu ortamla doldurun ve dinamik kültür için kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. SIS mu'yu daha önce gösterildiği gibi iki metal halka ile tohum birincil MV EEC'leri arasına sabitleyin.

Üç gün sonra, SIS mu'yu metal halkalardan çıkarın ve zarı bir şırınga ve kanül ile akış reaktörüne yerleştirin. Primer dermal fibroblastları ve tümör hücrelerini biyoreaktördeki matris üzerine uygulayın. Ertesi gün biyoreaktör sistemini kültür ortamıyla doldurmadan önce hücrelerin üç saat yapışmasına izin verin, biyoreaktörü kendi kendine inşa edilen bir inkübatör sistemine yerleştirin ve peristaltik bir pompaya bağlayın.

Bu kurulum, basınç ayarlı pulsatil akış veya sabit akış ile dinamik kültüre izin verir. Bu deneyde, dakikada 3.8 mililitrelik sabit bir orta akış kullanılır. Dinamik kültürü 14 gün boyunca koruyun, yedi gün sonra kültür ortamını değiştirin.

Deneylerin tamamlanmasının ardından dokular sabitlenir, parafine sarılır, gömülür ve boyanır ve daha sonra ters mikroskop kullanılarak görüntülenir. Temsili sonuçlar burada gösterilmektedir. Panel A, hemat tolin ile boyanmış 2D monokültürde statik olarak kültürlenmiş S 4 62 tümör hücre hattına genel bir bakış sunar.

Bu H ve e boyalı görüntü, SIS MU ve MVEC'in apikal tarafındaki tümör hücreleri S 4 62 ve primer fibroblastların üçlü kültürünü göstermektedir. Bazal lateral tarafta, oklar endotel hücrelerini işaretler. Panel C'de gösterilen MVEC ve panel D'de gösterilen P 53'ü etiketlemek için von Willebrand faktörü gibi hücre tipine özgü belirteçlerin boyanmasıyla farklı hücre tipleri tanımlanabilir. P 53 pozitif S4 62 hücreleri, P 53 negatif primer fibroblastlardan ayırt edilebilir ve hücrelerin 3 boyutlu dağılımı aynı şekilde analiz edilebilir.

Dinamik olarak kültürlenmiş üçlü kültür panelinde farklı hücre tipleri tanımlanabilir: A, okların endotel hücrelerini işaretlediği H ve E lekeli bir görüntüdür. Bu işlemi takiben Panel B'de von Willebrand faktörü için immünohistolojik boyanma, panel C'de ise P 53 için boyanma görülmektedir. Yeni kanser tedavilerinin nasıl bulunacağı veya tümör oluşumunda önemli sinyal yollarının analizi gibi ek soruları yanıtlamak için ilaç testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Ayrıca, birincil hücreler, bireysel hastalar için en iyi kişiselleştirilmiş tedaviyi tanımlamak için kullanılabilir.