Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu prosedürün amacı, mekanik stresin dallanma morfogenezi üzerindeki etkisini belirlemek gibi birçok deneysel bağlamda kullanılmak üzere bir kollajen jel içine gömülü özdeş üç boyutlu dokuların bir yükseltmesini tasarlamaktır. Bu yöntem, kolektif hücre davranışının altında yatan mekanizmaların belirlenmesi gibi doku morfogenezindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mühendislik dokularının geometrisinin kontrollü ve tekrarlanabilir olması, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin hassas bir şekilde manipüle edilmesini ve ölçülmesini sağlamasıdır.

Bu nedenle, örneklem büyüklüğü, yüksek istatistiksel güvenle sonuçlara varılabilecek kadar büyüktür. Standart fotolitografi tekniklerini kullanarak istediğiniz diziyle fotodesenli bir silikon ana fotodesen hazırlayarak başlayın. Bu videoda kullanılan desen, 200 mikron aralıklı dikdörtgen yapılardan oluşmaktadır.

Daha sonra, prepolimeri ve bir kürleme maddesini tek kullanımlık bir tabakta 10:1 oranında birleştirerek 50 gram PDMS'yi karıştırın. Ardından, karıştırma işlemi sırasında ortaya çıkan hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 15 ila 30 dakika vakum altına koyun. Silikon ana dokulu tarafı yukarı bakacak şekilde plastik tartı teknesine yerleştirin ve gazı alınmış PDMS solüsyonunu kalıbın üzerine dökün.

Ardından, çanağı bir fırına koyun ve PDMS'yi 12 saat boyunca 60 santigrat derecede kürleyin. Sertleştikten sonra, PDMS'yi ve master'ı plastik kaptan çıkarın. PDMS'yi silikon gofretten dikkatlice ayırın.

Ardından, basılı özelliklerin etrafındaki fazla PDMS'yi çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Şimdi, desenli PDMS'yi ayrı dikdörtgen pullar halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Bu pulları 100 milimetre çapında temiz bir petri kabında yukarı bakacak şekilde saklayın.

Daha sonra, aynı 10:1 oranında prepolimer / kürleme maddesi kullanarak yeni bir gazdan arındırılmış PDMS çözeltisi partisi hazırlayın. Bu çözeltinin iki ila üç gramını 100 milimetre çapında bir petri kabına sıkın ve ardından PDMS'yi 60 santigrat derecede 12 saat boyunca sertleştirin. Ardından, pullar için destek olarak kullanılmak üzere ince PDMS tabakasını dikdörtgenler halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.

Her damga için iki desteğe ihtiyaç vardır. Tüm destekler kesildikten sonra, PDMS damgalarını ve desteklerini %70 etanole batırarak ve bir biyogüvenlik kabininde bir aspiratör kullanarak kurutarak sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabininde, her damganın üstüne PBS'de 50 mikrolitre %1 BSA ekleyin.

BSA'nın damganın yüzeyine emilmesini sağlamak için damlacık kaplı pulları en az dört saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Ardından, damgaları biyogüvenlik kabinine geri koyun ve BSA solüsyonunu PDMS damgalarından aspire edin. Daha sonra, pulların yüzeylerini 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile iki kez yıkayın.

Her yıkamadan sonra ortamı aspire edin. Her PDMS damgası için 35 milimetre çapında bir doku kültürü kabı yerleştirin. Her tabakta, PDMS damgalarının uzunluğundan biraz daha az bir mesafe ile ayrılmış iki PDMS desteği yerleştirin.

Ardından, 15 milimetre çapında cam kapak fişlerini almak için bir cımbız kullanın ve bunları %70 etanol kullanarak sterilize edin. Kapak fişlerindeki fazla sıvıyı cımbızla tutarken aspire edin ve ardından ayrı bir petri kabında saklayın. Daha sonra, PDMS damgalarının yüzeyini eşit şekilde kaplamak için mililitre başına dört miligram kollajen karışımından 50 mikrolitre doğrudan her bir damgaya dağıtın.

Cımbızı kullanarak, kollajen kaplı PDMS damgalarının her birini alın ve nazikçe ters çevirin. Doku kültürü kaplarındaki PDMS desteklerinin üzerine ters çevrilmiş damgaları kollajen tarafı aşağı gelecek şekilde indirin. Ardından, bulaşıkları 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kalan kollajen karışımından 50 mikrolitreyi dairesel örtü fişlerinin her birine dağıtın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bu noktada, ilgilendiğiniz hücre türünü hasat edin. Burada, mililitrede bir ila 10 milyon hücre arasında bir konsantrasyonda askıya aldığımız EpH4 fare meme epitel hücrelerine sahibiz.

Şimdi, jelleşmiş kollajen örneklerini inkübatörden çıkarın. Cımbızı kullanarak, PDMS damgalarını kalıplanmış kolajenden ayırmak ve atmak için yavaşça yukarı doğru kaldırın. Kollajen jelindeki özellikleri bozmamak için damgayı düz bir şekilde yukarı doğru kaldırmak önemlidir.

İstenilen geometriye sahip kalıplanmış boşluklar içeren her bir kollajen jelinin yüzeyine 30 mikrolitre konsantre hücre süspansiyonu dağıtın. Hücrelerin boşluklara yerleşmesini sağlamak için bulaşıkları hafifçe yan yana sallarken hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Boşluklar beş dakika içinde doldurulmalıdır.

Boşlukların etrafındaki fazla hücreleri çıkarmak için, her bir doku kültürü kabını yan yatırın ve 400 mikrolitre hücre kültürü ortamını kollajen jelinin yüzeyine nazikçe dağıtın. Jel yüzeyindeki fazla hücrelerin uzaklaştırılması ve jelin boşluklarındaki hücrelerin yer değiştirmemesi için tabağı eğerken kültür ortamını jel üzerine yavaşça dağıtarak nazikçe yıkamak önemlidir. Sıvıyı aspire edin ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Fazla hücrelerin ne zaman durulandığını gözlemlemek için her yıkama arasında kollajen jellerini mikroskop altında kontrol edin. Fazla hücreler, hücre dolu boşlukların etrafından temizlendikten sonra, doku kültürü kaplarını 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, cımbız kullanarak, kollajen kaplı cam örtü fişlerini nazikçe ters çevirin ve bunları hücre dolu kollajen kalıplarının üzerine yerleştirin, böylece kapak astarından gelen kollajen hücre dolu boşluklar üzerinde bir kapak oluşturur.

Numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Kollajen kapakları hücre dolu kollajen kalıplarına yapıştıktan sonra, iki ila 2 1/2 mililitre hücre kültürü ortamını jellerin üzerine cam kapak kızakları üzerine yavaşça dağıtın ve numuneleri bir ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede kültürleyin. Bu görüntüler, hücre tohumlamasından önce bir tip I kollajen jeli haline getirilen dizilerin düşük ve yüksek büyütmeli görünümlerinden alınmıştır.

Kuyuların şekli, silikon usta üzerindeki özelliklerin şekli ile belirlenir. Burada, dikdörtgen kuyular meme epitel hücreleri ile doldurulmuştur. Bu örnekte, her 200 x 50 mikron dikdörtgen kuyu yaklaşık 80 ila 100 hücre içerir.

Hücre tohumlamasından 24 saat sonra, hücrelerin bir doku oluşturmak için kuyucuklar içinde birbirine yapıştığı gözlemlendi. Kültür ortamına bir büyüme faktörü HGF'nin eklenmesinden 24 saat sonra, dokuların dallanma morfogenezine uğradığı görülür. Hücre göçü ile ilgili proteinlerden biri, bu kompozit görüntüden de görebileceğiniz gibi, dallanmanın tipik olarak meydana geldiği kuyucukların uçlarında artan fokal yapışma kinazdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, hücrelerin göç ederken uyguladıkları kuvvetleri ve ilgilenilen genlerin transkript ve protein seviyelerindeki değişiklikleri belirlemek için çekiş kuvveti mikroskobu, gerçek zamanlı RT-PCR ve Western Blot gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış başlangıç geometrisine sahip dokuların bir kollajen jeli içine gömüldüğü bu 3D hücre kültürü modelinin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.