Name: Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, kolajen jel içine gömülü üç boyutlu epitel dokuları mühendislik yöntemiyle nasıl üretileceğini. Bu teknik, mekanik stresin hücre davranışlarına etkisini yüksek verimli tarama ile inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David ve Lucile Packard Vakfı, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı ve Burroughs hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Fonu hoş geldiniz. ASP Charlotte Elizabeth Procter yüceltici Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmiştir.

Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> Insülin, 5 mg / ml çözelti hazırlamak (çözücü, 100 ml, 500 mg insülin) O dH 2 5 mM, hidroklorik asit (HCI) ile toz haline getirilmiş insülin stokları sulandırmak. Damıtılmış su, 100 ml konsantre HCI, 50 ul ekleyerek çözücü 100 ml (DH 2 O) hazırlayın. </li><li> PBS 1x solüsyon yapmak için, steril koşullar altında DH 2 O 1x, 10x, fosfat tamponlu tuz (PBS) stok çözeltisi seyreltilir. </li><li> şöyle polidimetilsiloksan (PDMS) bir elastomer çözeltisi hazırlayın: 1 (ağ: ağ) oranı, bir 10 ısıyla sertleştirme maddesi ile bir araya PDMS prepolimeri karıştırın. </li><li> aşağıda hücre kültür ortamı hazırlayın: Hazır Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı 500 ml: Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F-12), 10, steril fetal sığır serumu ml (FBS), gentamisin reaktif 500 ul ve ek 5 mg / ml insülin, 500 ul. </li><li> (w% 1 ekleyin, 1 x PBS çözeltisi içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlamak için: BSA tozu v) çözeltisi PBS 1x ve iyice karıştırın. </li><li> ekleyin I kolajen nötralize sığır tipi bir 4 mg / ml çözelti hazırlamak için, 50 ul 10x Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) tampon maddesi, 30 ul 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH), 30 ul hücre kültür ortamı ve hazır kollajen 400 ul soğutulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne. Yukarı ve aşağı pipetleme yavaş yavaş karıştırın; kabarcıkları almaktan kaçınması. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için, kısaca 4 ° C&#39;de karışım santrifüj. </li><li> 4 (v: v) 1 x PBS içinde% 16 paraformaldehit 1 seyrelterek bir sabitleyici çözelti hazırlayın. </li><li> 1,000 (v: v) stok çekirdekleri etiketleme çözümü 1 seyreltilmesi ile bir çekirdek etiketleme çözümü hazırlayın 1x PBS içinde. </li><li> Deterjan:% 0.3 (v v) ile 1X PBS karıştırılarak% 0.3 fosfat tamponlu tuzlu su ve deterjan (PBST) çözeltisi hazırlayın. </li><li> % 0.3 PBST: keçi serumu 01:10 (v v) seyreltilmesi ile engelleme tampon hazırlayın. </li><li> PRI seyrelterek, ilgilenilen özel bir protein için bir birincil antikor çözeltisi hazırlayın(Örneğin, tavşan anti-fokal yapışma kinaz (FAK)) Mary antikoru 1: 200 (hacim: hacim) blokaj tamponunda. </li><li> (V v) blokaj tamponunda 1.000 (örneğin, keçi anti-tavşan) 1 floresan prob ve konjüge olmamış antikor seyrelterek bir ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 3D micropatterning Elastomerik Pullar 2. Hazırlık Not: Elastomerik pulları PDMS ile yapılır. <ol><li> Adım 1.3 açıklandığı gibi aynı oranda bir PDMS çözüm yapmak ve iyice karıştırın. Karıştırma işlemi sırasında oluşan olan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için 15-30 dakika süreyle bir vakumlu odasında karışımın yerleştirin. </li><li> tekne ya da lithographically istenen geometri özellikleri ile desenli bir silikon ustası içeren Petri kabı tartın bir plastik içine Tolüen dökün. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 saat ~ 60 ° C&#39;de PDMS çözeltisi tedavi. Not: silikon ustaları son derece özelleştirilebilir; Bu protokol 50 ölçülerinde dikdörtgen yapılar kullanırmm x 200 mm x 50 mm 200 mm aralıklı. Silikon Masters, standart fotolitografi teknikleri kullanılarak yapılabilir. Kısaca, bir epoksi-bazlı fotorezist silikon göbeğin üzerine spin-kaplanır. İstenilen damga özelliklerini ayrıntılı bir maske daha sonra UV ışığına maruz fotorezist kaplı gofret, üstüne yerleştirilir. maske tarafından bloke istenen özellikleri ışığa maruz kalır ve ışığa dirençli kaplamanın geri kalanı çözünür olduğu ve yıkanmasını edilebilir ise bu yerlerde fotorezist, çapraz bağlanmış olur. </li><li> PDMS silikon ana istenilen özelliklere etrafında tamamen donduktan sonra plastik bir kaba gelen PDMS ve master&#39;ı çıkarın. Dikkatle silikon gofret PDMS ayırmak ve temiz bir jilet kullanarak baskılı özellikleri çevresinde aşırı PDMS çıkarın. </li><li> Hemen bir jilet ile tek tek dikdörtgen pullar halinde kalıplanmış özelliklerine (~ 8 mm x 5 mm), desenli PDMS kesti. Bir cle bu özellik yan-up MağazaBir 100 mm çaplı Petri kabı. </li><li> Ayrıca, dikdörtgen pulları için destek yapmak için adım 1.3 açıklanan PDMS çözümü kullanın. </li><li> bir eğirme kaplayıcı kullanılarak, 100 mm çapında bir Petri tabağına eşit PDMS çözeltisi ~ 2-3 g yaymak ve adım 2.1 60 ° C&#39;de ~ 12 saat boyunca PDMS tedavi. Sonra, bir jilet kullanarak, dikdörtgenler içine PDMS ince bir tabaka (~ 5 mm x 2 mm) kesti. Not: İki destekler adım 2.3 yapılan her PDMS damga için gereklidir. destekleri PDMS pulları içeren 100 mm çapında Petri kabındaki saklanabilir. </li><li> PDMS pulları ve destekler hücre kültürü için kullanılmadan önce, bir biyogüvenlik kabini içinde bir aspiratör (hücre kültürü kaput) kullanılarak% 70 etanol ve kuru batırılarak sterilize edin. </li></ol> 3D Epitel Dokuların 3. hazırlanması <ol><li> Bir biyo-güvenlik kabini, her pul en PBS içinde% 1 BSA, yaklaşık 50 ul&#39;lik bir damla ekleyin. Bir mini 4 ° C&#39;de pul kaplı damlacık yerleştirin4 saat içinde anne BSA damgası yüzeyine adsorbe sağlamak. </li><li> PDMS pul aspire BSA çözüm. </li><li> Her yıkamadan sonra aspire, hücre kültür ortamı (pul her yıkama başına 50 ul yeterli olmalıdır) ile iki kez pul yüzeyleri yıkayın. </li><li> Kavisli paslanmaz çelik cımbız kullanarak sterilize PDMS pulları ve destekleri anlaştım. Her damgası PDMS için bir biyogüvenlik kabini, bir 35 mm çaplı doku kültürü çanak yatıyordu. her yemeğin, PDMS pul uzunluğu biraz daha az bir mesafe ile ayrılmış iki PDMS destekler uzandı. </li><li> cımbız kullanarak, birçok yuvarlak cam lamelleri sterilize (çapı 15 mm, # 1)% 70 etanol kullanarak PDMS pulları olduğu gibi. cımbız ile onları tutarken lamelleri fazla sıvıyı aspire. Ayrı bir 100 mm çapında Petri kabındaki yıkandı lamelleri saklayın. </li><li> ~ Kollajen karışımı 50 ul eşit kat, her yüzey damgası PDMS için dağıtın. </li><li> AlmakHer kollajen kaplı PDMS cımbızla damga ve onları hafifçe ters çevirin. PDMS üstüne ters pullar indirin 35 mm çaplı doku kültüründe ortaya koydu destekler kollajen mühür ve doku kültürü çanak alt arasında olacak şekilde bombeli. 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de yemekler inkübe edin. </li><li> Dairesel lamelleri her birine ~ kalan kollajen karışımı 50 ul koyun ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe (daha sonra bu, tamamen kollajen bunları kapsüllemek için mühendislik dokularının üzerine yerleştirilir). </li><li> % 40 konfluansa ~ epitel hücreleri (ör. EpH4 fare meme epitelyal hücreleri) ihtiva eden bir 100 mm çaplı bir doku kültürü çanağı elde edilir. Hücre kültür ortamı aspire edildi ve PBS 1x 10 ml ile bir kez yıkanır. hücrelere tripsin 2 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> doku kültürü çanağı, tripsinize edilmiş hücre ihtiva eden çanak kalan yapışık hücreler ayırma taze kültür ortamı 8 ml ekleyin. pipetleme ile yavaşça karıştırın ve 5 dakika boyunca 100 x g &#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj hücre karışımı hareket ettirin. </li><li> Konik tüpten aspire ve hücre kültür ortamı içinde hücre pelletini. hücreler bir hemasitometre kullanarak saymak süspansiyon konsantrasyonunu belirlemek için. 10 6 -10 7 hücre / ml ~ nihai bir konsantrasyon elde etmek için süspansiyon ses seviyesini ayarlayın. </li><li> inkübatör jölelenmişti kollajen örnekleri çıkarın. cımbız kullanarak, yavaşça kalıplı kollajen onları ayırmak ve onları atmak için düz yukarı PDMS pulları kaldırın. </li><li> istenen geometriye kalıplanmış boşluklar içeren her kollajen jel yüzeyi üzerine ~ konsantre hücre süspansiyonu 30 ul koyun. Hafifçe yemekler yan sallayarak boşlukları içinde yerleşen hücreyi teşvik yan ise 10X / 0.25 NA amacı ile bir aydınlık mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. boşluklar ~ 5 dakika içinde doldurulması gerekmektedir. </li><li> rBoşlukların etrafında aşırı hücre birikimleri temizlenmelidir yan, her bir doku kültürü çanağı eğim ve yavaşça kollajen jel yüzeyi üzerine hücre kültürü ortamında ul 400 ~ dağıtın. Her yıkama arasında mikroskop altında kolajen jelleri kontrol sıvı aspire ve yıkama 1-2 kez daha tekrarlayın. </li><li> fazla hücreler kolajen kalıp hücre dolu boşlukların etrafında temizlendikten sonra, 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir hücre kültür inkübatörü içine doku kültür kaplarına yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak, yavaşça kollajen kaplı sınıf lamelleri ters ve lamelleri kollajen hücre dolu boşlukların üzerine bir kap oluşturduğu hücre dolu kollajen kalıpların üstüne koyun. 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kollajen kapaklar hücre dolu kollajen kalıba yapıştırılır sonra, jeller üstüne cam lamel üzerinde yavaşça ~ 2-2.5 ml hücre kültür ortamı dağıtmak. Kültür 1-3 gün boyunca 37 ° C &#39;de örnekler. Not:24 saat ilk ekimden sonra epitel dokular, epidermal büyüme faktörü (EGF) veya dal uyarılması için hepatosit büyüme faktörü (HGF) gibi büyüme faktörleri ile muamele edilir. </li></ol> 4. İmmünofloresan ve Görüntü Analizi <ol><li> Doku kültür kaplarından, hücre kültür ortamı aspire ve hücre-ihtiva eden jeller karşılamak için yeterli sabitleyici solüsyonu ekleyin. 200 rpm&#39;de bir çalkalayıcıda 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin yemekler. </li><li> , Fiksatif aspire 1X PBS ile doku kültür kaplarına doldurun ve 200 rpm&#39;de bir çalkalama 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Üç toplam yıkar iki kez tekrarlayın. </li><li> Doku kültürü çanak aspire PBS ve Hoechst çözümü ile değiştirin: çekirdekleri etiketlemek için. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FAK veya antikorlar ile saptanabilir başka marker için leke, 4.5 adıma geçin. </li><li> nükleer etiketleme çözeltisi aspire ve hücre-ihtiva eden g yıkamakAşama 4.2 olarak 1 x PBS ile üç kez kavuşmaktadır. Lekeli örnekler sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de 1 x PBS içinde saklanabilir. </li><li> , PBS aspire doku kültür kaplarından% 0.3 PBST 300 ul ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir örnek: ilgi konusu bir protein için leke için. </li><li> PBS aspire Blokaj tamponu ile jeller kapak ve ~ 4 saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalama (200 rpm) üzerinde inkübe edin. </li><li> Aspire bloke tamponu, primer antikor çözeltisi ile jeller kapağı ve 4 ° C&#39;de bir gece 200 rpm&#39;de bir çalkalama üzerinde inkübe edin. </li><li> Primer antikor çözeltisi aspire% 0.3 PBST solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında 200 rpm&#39;de bir çalkalama üzerinde inkübe edin. PBST aspire ve 3-4 saat süreyle her 30 dakikada bir tekrarlayınız. </li><li> Tekrarlayın 4.7 ve 4.8, ikincil antikor çözeltisi ile inkübe bu kez yineleyin. İkincil antikor photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile doku kültür tabaklarında sarın. fina sonraL yıkama, lekeli numuneler sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de 1 x PBS içinde saklanabilir. </li><li> Örnekleri görselleştirmek için, epitel dokuda midplane odaklanmış bir 10X / 0.30 NA objektif kullanın. </li><li> Hücre çekirdekleri, UV aydınlatma altında 10X / 0.30 NA objektif kullanarak bir nükleer işaretleyici ile etiketlenmiş görüntü sabit örnekleri görselleştirmek için. </li><li> Ters bir floresan mikroskopu üzerinde bir 10X / 0.30 NA objektif kullanılarak ilgi konusu bir protein, görüntü için boyandı örnekleri görselleştirmek için. </li><li> aynı ilk geometri birçok dokuda (tipik olarak 50 veya daha fazla) protein boyama frekans haritalar oluşturmak için, ilk ithalat standart görüntü analiz yazılımı kullanarak her görüntü (Malzeme) ve 8-bit gri tonlama onları dönüştürmek. </li><li> Bu görüntülerin eşik için, gri tonlama kesme noktası tanımlayarak ikili (yani, yarım ton / siyah ve beyaz) onları dönüştürmek; eşiğin altına gri tonlama değerleri siyah olur ve eşiğin üstünde o beyaz olur. Daha sonra, kombinetek bir görüntü yığını içine bireysel ikili görüntülerin her. </li><li> Sonraki yığılmış görüntüleri kayıt (yani hizalamak veya onları maç) analiz yazılımı. Birçok görüntü analiz yazılımı paketleri serbestçe kullanılabilir kayıt eklentisi ile geliyor. <ol><li> sonraki görüntüye uyum için bir şablon olarak bir yığın her görüntü kullanın, tüm yığın görüntüleri yayılması ile hizalanır şekilde. Son olarak, bindirme (proje) ortalama yoğunluğuna dayalı hizalanmış görüntü yığınında görüntüleri piksel frekansı harita ile tek bir görüntü oluşturmak için. Bu görüntü daha sonra renk kodlu seçim 10,11 görüntü düzenleme yazılımını kullanarak olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).</li>
<li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK%28ERK-1%2C2%29+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li>
<li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li>
<li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li>
<li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li>
<li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458(2015).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li>
<li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yukarıda açıklanan protokol, dokudaki hücrelerin yaşadığı mekanik stresin uzamsal kontrolünü sağlayan, önceden tanımlanmış şekle sahip özdeş epitel dokuları üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Tip I kollajende boşluklar oluşturmak için elastomerik bir kalıp kullanılır, bunlar daha sonra epitel hücreleriyle doldurulur ve hücrelerin bir 3D kollajen matris ortamında tamamen kapsüllenmesi için ek bir kollajen tabakası ile kaplanır. Bu dokuların daha fazla kültürü ve başlangıç mimarisinden dallanmayı indüklem...

morfojenezi dallanma olarak bilinen kollara ayrılmış epitelyal dokuların gelişimi, hücre-türevli, fiziksel ve çevresel faktörler ile düzenlenir. meme bezinde, morfolojilerinden dallanma toplu hücre göçü bir ağaç gibi mimari oluşturur güdümlü aracılığıyla tekrarlanan bir süreçtir. İlk adım şube başlatılması ve uzama 1,2 izledi süt kanallarından birincil tomurcuğu oluşumu vardır. Çevredeki stromaya dalları Invasion ergenlik steroid hormonların sistemik salınımı ile indüklenir. Yeni birincil tomurcukları sonra varolan şube uçlarından başlatabilir ve bu süreç bir epitel ağacı 3 yaratmaya devam ediyor. Birçok önemli biyokimyasal sinyaller tespit edilmiş olmasına rağmen, bu karmaşık gelişim süreci şu anda eksiktir rehberlik hücre biyolojik mekanizmaların kapsamlı bir anlayış. Ayrıca, belirli ipuçlarının etkilere mekanik çalışmalar deney gelen yapısızlaştırmak zorin vivo likte olarak hassas uzaysal tedirginlikler ve ölçümler çoğu zaman mümkün değildir. Böyle tüm organ kültürü, birincil organoids ve hücre kültür modelleri gibi üç boyutlu (3D) kültür teknikleri, sistematik doku morfolojilerinden 4-6 yatan mekanizmaları araştırmak için yararlı araçlardır. Bu hareketi, çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere hücre davranışları çeşitli, bu gibi mekanik güçler ve biyokimyasal sinyallerin gibi, tek tek özel faktörlerin etkileri belirlemek için yararlı olabilir. 6 tasarlanan hücre kültürü modelleri, özellikle, hali hazırda pertürbasyon etkinleştirmek tek tek hücreler ile bunların mikro arasında. Böyle bir kültür modeli a ile uyarılan zaman tutarlı ve tekrarlanabilir toplu göç dalları oluşturan kontrollü 3D yapısı ile örnek meme epitel doku mühendisi bir mikroüretim tabanlı bir yaklaşım kullanırppropriate büyüme faktörleri. modelin en büyük avantajı tam işlemek ve bu tür yüksek istatistiksel güven ile mekanik stres desen, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin etkilerini ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik, bir araya hesaplama modelleme ile, daha önce meme epitelyal dokusunda ve dallı epitel 7-11 normal gelişimin rehberliğinde fiziksel ve biyokimyasal sinyallerin nispi katkılarını belirlemek için kullanılmıştır. Burada sunulan kolaylıkla hücreler ve hücre-dışı matrisi (ECM) jellerin diğer tiplerinin uzatılabilir, bu model, dokular, bina için ayrıntılı bir protokoldür ve terapötiklerinin test edilmesi için potansiyel bir araç olarak hizmet eder.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Ellsworth Yapıştırıcılar</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS kürleme maddesi</td><td>Ellsworth Yapıştırıcılar</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Litografik desenli silikon usta</td><td>kendi kendine yapılan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tartı teknesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100 mm çapında Petri kapları</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol 200 Korumalı</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>dH2O Tıraş Bıçağı ile karıştırarak %70 EtOH (v:v) çözeltisi yapın</td></tr><tr><td></td><td>Amerikan Emniyetli Tıraş Bıçağı</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta : Jambon' s F12 Besin Karışımı (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hiklon</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank' s dengeli tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sığır tip I kollajen (pepsinizsiz)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumundan elde edilen albümin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli paslanmaz çelik cımbız</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35 mm çaplı doku kültürü kapları</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Güvenli Kilit Tüpü</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Dairesel #1 cam lameller, 15 mm çapında</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>% 0.05 1x Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>50 mg / ml'de dH 2 O'da Yeniden Süspansiyon</td></tr><tr><td>Tavşan anti-fare FAK antikoru</td><td>Hayat Teknolojiler</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa 488 antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Renk kodlamalı piksel frekans haritaları için kullanılır.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH N</td><td>/A</td><td>Bir piksel frekans haritası oluşturmak için görüntüleri eşiklemek, kaydetmek ve üst üste bindirmek için kullanılan ücretsiz görüntü analiz yazılımı. StackReg eklentisi, ikili görüntüleri kaydetmek için kullanıldı.</td></tr></tbody></table>

ekstraselüler matrix içinde gömülü mühendislik Üç boyutlu epitel dokular

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Akciğerler, böbrekler ve meme bezleri gibi dallanmış organların mimarisi, mikro çevredeki çeşitli çözünür ve fiziksel sinyaller tarafından düzenlenen dallanma morfogenezinin gelişimsel süreci boyunca ortaya çıkar. Burada açıklanan, hücre dışı bir matris (ECM) içine tamamen gömülü, tanımlanmış şekil ve boyutta tasarlanmış üç boyutlu (3B) epitel dokuları oluşturarak dallanma morfogenezi sürecini incelemek için oluşturulmuş bir yöntemdir. Bu yöntem, aynı doku dizilerinin oluşturulmasını sağlar ve doku geometrisi, aralık ve ECM bileşimi dahil olmak üzere çeşitli çevresel faktörlerin kontrolünü sağlar. Bu yöntem, hücreler ve çevrelerindeki ECM arasındaki etkileşimler hakkında daha fazla bilgi edinmek için çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) gibi yaygın olarak kullanılan tekniklerle de birleştirilebilir. Protokol, kanser istilası da dahil olmak üzere dallanma morfogenezinin ötesinde çeşitli hücre ve doku süreçlerini araştırmak için kullanılabilir.

Meme epitelyal dokusu mikroimalat genel şematik Deneysel çalışma akışını özetleyen mikroimalat prosedürünün genel şematik Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Sonuçta tamamen bir ECM jel içinde gömülü olan özdeş geometri ve aralık epitel dokuda bir dizidir. Temsili deney I, 4 mg / ml bir konsantrasyonda kolajen sığır türü bir jel içinde kültürlenmiş EpH4 fare meme epitelyal hücreleri kullanılmaktadır. Mühendislik dokuların en yükse...

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Bu prosedürün amacı, dallanma morfogenezi üzerinde mekanik stresin etkisini belirlemek gibi birçok deneysel bağlamda kullanılmak üzere, kolajen jel içerisine gömülmüş özdeş üç boyutlu dokuların üretilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, kolektif hücre davranışının altında yatan mekanizmaların belirlenmesi gibi doku morfogenezindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mühendislik ürünü dokuların geometrisinin kontrollü ve tekrarlanabilir olmasıyla fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin kesin şekilde manipülasyonuna ve ölçümüne olanak tanımasıdır.Böylece, yüksek istatistiksel güvenle sonuçlar çıkarılabilecek kadar büyük bir örneklem boyutu elde edilir. Standart fotolitografi tekniklerini kullanarak, istediğiniz dizinin fotodesenlendiği bir silikon kalıp hazırlayarak başlayın. Bu videoda kullanılan desen, aralarında 200 mikron mesafe bulunan dikdörtgen yapılardan oluşmaktadır.Ardından, prepolimer ve kürleme ajanını tek kullanımlık bir kapta 10:1 oranında birleştirerek 50 gram PDMS karıştırın. Daha sonra, karıştırma işlemi sırasında oluşan hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 15 ila 30 dakika boyunca vakum altına alın. Silikon kalıbı dokulu tarafı yukarı bakacak şekilde plastik tartım kabına yerleştirin ve gazı alınmış PDMS çözeltisini kalıbın üzerine dökün.Ardından, kabı bir fırına yerleştirin ve PDMS'i 60 °C'de 12 saat boyunca kürleyin. Kürleme işlemi tamamlandığında, PDMS'i ve master'ı plastik kaptan çıkarın. PDMS'i silikon wafer'dan dikkatlice ayırın.Ardından, baskılanmış özelliklerin çevresindeki fazla PDMS'i temizlemek için temiz bir jilet kullanın. Şimdi, desenli PDMS'i tekil dikdörtgen damgalar halinde kesmek için bir jilet kullanın. Bu damgaları, özellik tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir 100 millimeter çaplı petri kabında saklayın.Ardından, prepolimer ile kürleme maddesinin aynı 10:1 oranını kullanarak taze bir gazı alınmış PDMS çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiden iki ila üç gramı 100 milimetre çapındaki bir petri kabına spin coat yöntemiyle kaplayın ve ardından PDMS'i 60 °C'de 12 saat boyunca kürleyin. Daha sonra, damgalar için destek olarak kullanılacak olan ince PDMS tabakasını dikdörtgenler şeklinde kesmek için bir jilet kullanın.Her bir damga için iki destek gereklidir. Tüm destekler kesildikten sonra, PDMS damgaları ve destekleri %70 etanol içine daldırarak sterilize edin ve bir biyogüvenlik kabininde aspiratör kullanarak kurutun. Bir biyogüvenlik kabininde, her bir damganın üzerine 50 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin.BSA'nın damganın yüzeyine tutunmasını sağlamak için damla kaplı damgaları minimum dört saat boyunca dört santigrat derecede bekletin. Ardından, damgaları biyogüvenlik kabinine geri getirin ve BSA solüsyonunu PDMS damgalardan aspire edin. Sonrasında, damga yüzeylerini iki kez 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile yıkayın.Her yıkama sonrası medyumu aspire edin. Her bir PDMS damgası için 35 milimetre çapında bir doku kültürü kabı hazırlayın. Her bir kabın içine, PDMS damgalarının uzunluğundan biraz daha kısa bir mesafeyle ayrılmış iki adet PDMS desteği yerleştirin.Ardından, bir cımbız kullanarak 15 milimetre çapındaki cam lamelleri alın ve %70 ethanol ile sterilize edin. Lamelleri cımbızla tutarken fazla sıvıyı aspire edin ve ardından onları ayrı bir petri kabında saklayın. Sonra, PDMS damgaların yüzeyini eşit şekilde kaplamak için her bir damganın üzerine doğrudan 50 mikrolitre dört miligram/mililitre kolajen karışımı damlatın.Cımbız kullanarak, kolajen kaplı PDMS damgaların her birini alın ve nazikçe ters çevirin. Ters çevrilmiş damgaları, kolajen tarafı aşağı gelecek şekilde doku kültürü kaplarındaki PDMS desteklerin üzerine yerleştirin. Ardından, kapları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, kalan kollajen karışımından 50 µL'yi dairesel lamel camların her birine paylaştırın ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bu aşamada, ilgilendiğiniz hücre tipini hasat edin. Burada, mL başına 1 ile 10 milyon hücre arasındaki bir konsantrasyonda süspanse ettiğimiz EpH4 fare meme epitel hücrelerini kullandık.Şimdi, jelleşmiş kolajen örneklerini inkübatörden çıkarın. Cımbız kullanarak, PDMS damgaları kalıplanmış kolajenden ayırmak için nazikçe düz yukarı doğru kaldırın ve damgaları atın. Kolajen jeldeki yapıların bozulmaması için damganın düz yukarı doğru kaldırılması önemlidir.İstenen geometride kalıplanmış boşluklar içeren her bir kolajen jel yüzeyine 30 µL konsantre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin boşluklar içine çökmesini teşvik etmek için kapları nazikçe yanlara doğru sallarken hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Boşluklar beş dakika içinde dolmalıdır.Kavite çevresindeki fazla hücreleri uzaklaştırmak için her bir doku kültürü kabını yan yatırın ve kolajen jel yüzeyine nazikçe 400 µL hücre kültürü besiyeri ekleyin. Jel yüzeyindeki fazla hücrelerin temizlenmesi ve jel kavitelerindeki hücrelerin yerinden oynamaması için, kabı eğik tutarak besiyerini jel üzerine yavaşça ekleyip nazikçe yıkamak önemlidir. Sıvıyı aspire edin ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.Fazla hücrelerin ne zaman durulandığını gözlemlemek için her yıkama arasında kolajen jelleri mikroskop altında kontrol edin. Hücre dolu boşlukların etrafındaki fazla hücreler temizlendikten sonra, doku kültürü kaplarını 37 °C'ye ayarlı bir inkübatöre 15 dakika boyunca yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak kolajen kaplı cam lamelleri nazikçe ters çevirin ve lameldeki kolajen, hücre dolu boşlukların üzerinde bir kapak oluşturacak şekilde lamelleri hücre dolu kolajen kalıpların üzerine yerleştirin.Numuneleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Kollajen kapaklar, hücre dolu kollajen kalıplara yapıştıktan sonra, jellerin üzerindeki cam lamellerin üzerine yavaşça 2 ila 2 1/2 mL hücre kültürü medyumu ekleyin ve numuneleri 37 °C'de bir ila üç gün boyunca kültüre edin. Bu görüntüler, hücre ekimi öncesinde tip I kollajen jel içine kalıplanmış dizilerin düşük ve yüksek büyütmeli görünümleridir.Kuyucukların şekli, silikon kalıptaki özelliklerin şekli tarafından belirlenir. Burada, dikdörtgen kuyucuklar meme epitel hücreleri ile doldurulmuştur. Bu örnekte, 200 x 50 mikron boyutundaki her bir dikdörtgen kuyucuk yaklaşık 80 ila 100 hücre içermektedir.Hücre ekiminden 24 saat sonra, hücrelerin kuyucuklar içinde birbirine tutunarak bir doku oluşturduğu gözlemlenmiştir. Kültür ortamına büyüme faktörü HGF eklendikten 24 saat sonra, dokuların dallanan morfolojiden geçtiği görülmektedir. Hücre göçünde yer alan proteinlerden biri olan fokal adhezyon kinazın, bu kompozit görüntüden de görülebileceği üzere, dallanmanın tipik olarak gerçekleştiği kuyucuk uçlarında arttığı tespit edilmiştir.Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığında iki saat içinde tamamlanabilir. Hücrelerin göç ederken uyguladıkları kuvvetleri ve ilgilenilen genlerin transkript ve protein seviyelerindeki değişimleri belirlemek için, bu prosedürün ardından traksiyon kuvveti mikroskobu, gerçek zamanlı RT-PCR ve Western Blotting gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir başlangıç geometrisine sahip dokuların kolajen jel içine gömüldüğü bu 3D hücre kültürü modelinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Doku mühendisliği fibroblast türevli doğal matris epitel hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyen bir stromal alt-tabakayı üretmek için gelişmekte olan bir araçtır. Burada tümör hücre biyolojisi farklı stromal hücre tiplerinin etkisini değerlendirmek için bu yöntemi uygulayarak bir protokol sunulmuştur.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.

Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi

Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.

İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Öğrenin, kolajen jel içine gömülü üç boyutlu epitel dokuları mühendislik yöntemiyle nasıl üretileceğini. Bu teknik, mekanik stresin hücre davranışlarına etkisini yüksek verimli tarama ile inceler.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Daha fazla video keşfet