Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu prosedürün amacı, dallanma morfogenezi üzerinde mekanik stresin etkisini belirlemek gibi birçok deneysel bağlamda kullanılmak üzere, kolajen jel içerisine gömülmüş özdeş üç boyutlu dokuların üretilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, kolektif hücre davranışının altında yatan mekanizmaların belirlenmesi gibi doku morfogenezindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mühendislik ürünü dokuların geometrisinin kontrollü ve tekrarlanabilir olmasıyla fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin kesin şekilde manipülasyonuna ve ölçümüne olanak tanımasıdır.

Böylece, yüksek istatistiksel güvenle sonuçlar çıkarılabilecek kadar büyük bir örneklem boyutu elde edilir. Standart fotolitografi tekniklerini kullanarak, istediğiniz dizinin fotodesenlendiği bir silikon kalıp hazırlayarak başlayın. Bu videoda kullanılan desen, aralarında 200 mikron mesafe bulunan dikdörtgen yapılardan oluşmaktadır.

Ardından, prepolimer ve kürleme ajanını tek kullanımlık bir kapta 10:1 oranında birleştirerek 50 gram PDMS karıştırın. Daha sonra, karıştırma işlemi sırasında oluşan hava kabarcıklarını gidermek için karışımı 15 ila 30 dakika boyunca vakum altına alın. Silikon kalıbı dokulu tarafı yukarı bakacak şekilde plastik tartım kabına yerleştirin ve gazı alınmış PDMS çözeltisini kalıbın üzerine dökün.

Ardından, kabı bir fırına yerleştirin ve PDMS'i 60 °C'de 12 saat boyunca kürleyin. Kürleme işlemi tamamlandığında, PDMS'i ve master'ı plastik kaptan çıkarın. PDMS'i silikon wafer'dan dikkatlice ayırın.

Ardından, baskılanmış özelliklerin çevresindeki fazla PDMS'i temizlemek için temiz bir jilet kullanın. Şimdi, desenli PDMS'i tekil dikdörtgen damgalar halinde kesmek için bir jilet kullanın. Bu damgaları, özellik tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir 100 millimeter çaplı petri kabında saklayın.

Ardından, prepolimer ile kürleme maddesinin aynı 10:1 oranını kullanarak taze bir gazı alınmış PDMS çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiden iki ila üç gramı 100 milimetre çapındaki bir petri kabına spin coat yöntemiyle kaplayın ve ardından PDMS'i 60 °C'de 12 saat boyunca kürleyin. Daha sonra, damgalar için destek olarak kullanılacak olan ince PDMS tabakasını dikdörtgenler şeklinde kesmek için bir jilet kullanın.

Her bir damga için iki destek gereklidir. Tüm destekler kesildikten sonra, PDMS damgaları ve destekleri %70 etanol içine daldırarak sterilize edin ve bir biyogüvenlik kabininde aspiratör kullanarak kurutun. Bir biyogüvenlik kabininde, her bir damganın üzerine 50 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin.

BSA'nın damganın yüzeyine tutunmasını sağlamak için damla kaplı damgaları minimum dört saat boyunca dört santigrat derecede bekletin. Ardından, damgaları biyogüvenlik kabinine geri getirin ve BSA solüsyonunu PDMS damgalardan aspire edin. Sonrasında, damga yüzeylerini iki kez 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile yıkayın.

Her yıkama sonrası medyumu aspire edin. Her bir PDMS damgası için 35 milimetre çapında bir doku kültürü kabı hazırlayın. Her bir kabın içine, PDMS damgalarının uzunluğundan biraz daha kısa bir mesafeyle ayrılmış iki adet PDMS desteği yerleştirin.

Ardından, bir cımbız kullanarak 15 milimetre çapındaki cam lamelleri alın ve %70 ethanol ile sterilize edin. Lamelleri cımbızla tutarken fazla sıvıyı aspire edin ve ardından onları ayrı bir petri kabında saklayın. Sonra, PDMS damgaların yüzeyini eşit şekilde kaplamak için her bir damganın üzerine doğrudan 50 mikrolitre dört miligram/mililitre kolajen karışımı damlatın.

Cımbız kullanarak, kolajen kaplı PDMS damgaların her birini alın ve nazikçe ters çevirin. Ters çevrilmiş damgaları, kolajen tarafı aşağı gelecek şekilde doku kültürü kaplarındaki PDMS desteklerin üzerine yerleştirin. Ardından, kapları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, kalan kollajen karışımından 50 µL'yi dairesel lamel camların her birine paylaştırın ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bu aşamada, ilgilendiğiniz hücre tipini hasat edin. Burada, mL başına 1 ile 10 milyon hücre arasındaki bir konsantrasyonda süspanse ettiğimiz EpH4 fare meme epitel hücrelerini kullandık.

Şimdi, jelleşmiş kolajen örneklerini inkübatörden çıkarın. Cımbız kullanarak, PDMS damgaları kalıplanmış kolajenden ayırmak için nazikçe düz yukarı doğru kaldırın ve damgaları atın. Kolajen jeldeki yapıların bozulmaması için damganın düz yukarı doğru kaldırılması önemlidir.

İstenen geometride kalıplanmış boşluklar içeren her bir kolajen jel yüzeyine 30 µL konsantre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin boşluklar içine çökmesini teşvik etmek için kapları nazikçe yanlara doğru sallarken hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Boşluklar beş dakika içinde dolmalıdır.

Kavite çevresindeki fazla hücreleri uzaklaştırmak için her bir doku kültürü kabını yan yatırın ve kolajen jel yüzeyine nazikçe 400 µL hücre kültürü besiyeri ekleyin. Jel yüzeyindeki fazla hücrelerin temizlenmesi ve jel kavitelerindeki hücrelerin yerinden oynamaması için, kabı eğik tutarak besiyerini jel üzerine yavaşça ekleyip nazikçe yıkamak önemlidir. Sıvıyı aspire edin ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Fazla hücrelerin ne zaman durulandığını gözlemlemek için her yıkama arasında kolajen jelleri mikroskop altında kontrol edin. Hücre dolu boşlukların etrafındaki fazla hücreler temizlendikten sonra, doku kültürü kaplarını 37 °C'ye ayarlı bir inkübatöre 15 dakika boyunca yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak kolajen kaplı cam lamelleri nazikçe ters çevirin ve lameldeki kolajen, hücre dolu boşlukların üzerinde bir kapak oluşturacak şekilde lamelleri hücre dolu kolajen kalıpların üzerine yerleştirin.

Numuneleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Kollajen kapaklar, hücre dolu kollajen kalıplara yapıştıktan sonra, jellerin üzerindeki cam lamellerin üzerine yavaşça 2 ila 2 1/2 mL hücre kültürü medyumu ekleyin ve numuneleri 37 °C'de bir ila üç gün boyunca kültüre edin. Bu görüntüler, hücre ekimi öncesinde tip I kollajen jel içine kalıplanmış dizilerin düşük ve yüksek büyütmeli görünümleridir.

Kuyucukların şekli, silikon kalıptaki özelliklerin şekli tarafından belirlenir. Burada, dikdörtgen kuyucuklar meme epitel hücreleri ile doldurulmuştur. Bu örnekte, 200 x 50 mikron boyutundaki her bir dikdörtgen kuyucuk yaklaşık 80 ila 100 hücre içermektedir.

Hücre ekiminden 24 saat sonra, hücrelerin kuyucuklar içinde birbirine tutunarak bir doku oluşturduğu gözlemlenmiştir. Kültür ortamına büyüme faktörü HGF eklendikten 24 saat sonra, dokuların dallanan morfolojiden geçtiği görülmektedir. Hücre göçünde yer alan proteinlerden biri olan fokal adhezyon kinazın, bu kompozit görüntüden de görülebileceği üzere, dallanmanın tipik olarak gerçekleştiği kuyucuk uçlarında arttığı tespit edilmiştir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığında iki saat içinde tamamlanabilir. Hücrelerin göç ederken uyguladıkları kuvvetleri ve ilgilenilen genlerin transkript ve protein seviyelerindeki değişimleri belirlemek için, bu prosedürün ardından traksiyon kuvveti mikroskobu, gerçek zamanlı RT-PCR ve Western Blotting gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir başlangıç geometrisine sahip dokuların kolajen jel içine gömüldüğü bu 3D hücre kültürü modelinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.