Name: Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri come mappare le proprietà meccaniche dei tessuti vegetali con la microscopia a forza atomica (AFM). Questo metodo consente di correlare i cambiamenti meccanici delle pareti cellulari con la crescita e la morfogenesi in Arabidopsis.

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Rendiamo grazie speciale a Yves Couder per molte discussioni utili. Ringraziamo Atef Asnacios per la calibrazione del cantilever e la discussione. Ringraziamo Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, e Oliver Hamant per la lettura critica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da Human Frontier Science Program sovvenzione RGP0062/2005-C; l&#39;Agence Nationale de la Recherche progetti&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; e&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Preparare vetrini in vetro per il campione di montaggio <ol><li> Preparare imbedding mezzi di agarosio: 0,7% agarosio low melting nel 10% mannitolo (in acqua). </li><li> Utilizzando uno strumento metallico forte (ad esempio punta trapano, calce), etch su un&#39;area cm 0.5 x 0.5 nel centro di un vetrino al microscopio. O invece, incollare un piccolo pezzo di lamelle di vetro (circa 20 x 200 micron) per vetrino con colla Araldite. NOTA: Questo irruvidisce la superficie per favorire l&#39;adesione del agarosio per garantire che i bastoni multimediali agarosio o correzioni alla diapositiva. Questa diapositiva può essere riutilizzato. </li><li> Posizionare una goccia di circa 20 ml di imbedding supporti agarosio sulla regione incisa del vetrino. Questo dà una sottile pellicola di agarosio. </li><li> Conservare il vetrino in una scatola di umido e attendere per i media agarosio solidificare. </li></ol> 2. Dissezione e montaggio meristema Campioni <ol><li> Meristemi Microdissect per l&#39;immaginario confocaleng: togliere le gemme floreali uno per uno dallo stelo tirando giù con le pinzette ultrafini. È importante rimuovere tutte le gemme floreali fino alle papille che non presentano sepali (ossia la primordi P1 14). </li><li> Utilizzando una lama di rasoio o la punta delle pinzette, tagliare il meristema lontano dallo stelo. Il taglio deve essere parallelo alla regione della superficie meristema che deve essere misurato con l&#39;AFM. L&#39;apice ottenuto deve essere compresa tra 300 micron e 600 micron alto per adattarsi sotto la punta AFM. </li><li> Spingere l&#39;apice nel film dei media agarosio preparati nella fase 1.1.4. Scegliere una posizione sul vetrino / agarosio e spingere delicatamente tale che il meristema sia direttamente a contatto con il vetrino e sporge fuori dal agarosio. E &#39;fondamentale per posizionare il meristema nella agarosio entro pochi secondi che seguono il suo taglio dallo stelo. NOTA: Questo è per impedire il meristema secchi. In questa fase, il meristema sarà in piedi in un crack perché l&#39;agarosio fratturato in seguito all&#39;applicazione di pressione. </li><li> Preparare diverse meristemi questo modo per l&#39;imaging batch, fornendo che sono della stessa altezza e sono posizionati a meno di 500 pm l&#39;uno dall&#39;altro sulla diapositiva. Tenere i meristemi preparati nella casella umida mentre dissezione ulteriori campioni. NOTA: Esso limita la variazione proveniente dalla taratura. Idealmente 2 campioni di ogni condizione possono essere preparati e misurati in modo casuale. Finora non vi è alcun effetto osservato di immagini in batch sulla misura (stress indotto risposta). Questo potrebbe essere grazie alla diluizione di molecole di stress segnalazione in agar e / o la soluzione di montaggio. In alternativa la risposta allo stress è lo stesso indipendentemente alla quantità di campione preparato. </li><li> Prima di passare alla fase successiva, accertarsi che il confine tra il meristema e le gemme floreali è asciutto. In caso contrario, rimuovere delicatamente l&#39;acqua in eccesso con carta da filtro. Ciò dovrebbe evitare che nella fase successiva che il fusoagarosio inonda il campione a causa di forze capillarità. </li><li> Con una pipetta 20 ml, aggiungere abbastanza sciolto il montaggio agarosio per riempire la fessura creata al punto 1.2.3. e per circondare ogni meristema. L&#39;agarosio deve raggiungere il livello della cicatrice del bocciolo rimosso (primordio). Per ottenere ciò, può essere necessario aggiungere agarosio a ciascuna estremità della fessura. </li><li> Quando si aggiunge l&#39;agarosio, che invaderanno rapidamente nella fessura; con la pipetta, succhiare parte di montaggio agarosio per garantire che il meristema è il punto più alto sulla diapositiva del fuso. Questo risolve il meristema in modo che non possa muoversi durante l&#39;imaging. </li></ol> 3. Montaggio di radici o hypocotyl Campioni <ol><li> Per radici e ipocotili, dissezione è necessario. Nel film sottile di agarosio sul vetrino preparato, fare una scanalatura direttamente sopra un etch in vetro o lungo una lamella di vetro. Posizionare la radice o hypocotyl in questa scanalatura assicurando che sia in contatto con l&#39;vetro su tutta la sua lunghezza. </li><li> Prima di passare alla fase successiva, accertarsi che il campione è secco sulla sua superficie. In caso contrario, rimuovere delicatamente l&#39;eccesso di acqua con carta da filtro. </li><li> Aggiungi sciolto il montaggio agarosio intorno al campione, come nel passaggio 1.2.6. </li></ol> 4. AFM preparazione e sensibilità di calibrazione (per un JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Montare una mensola sul AFM. Il cantilever deve essere montata con penetratore di forma rotonda. Il raggio determinerà la x, y, z la risoluzione e la profondità di penetrazione a cui misurazione accurata potrebbe essere archiviata. <ol><li> Per effettuare misurazioni meso-scala nanometrica sulla superficie della epidermide, utilizzare un penetratore rotonda raggio di 50 nm; di prendere le misure mesoscala, utilizzare un 0,5 micron raggio penetratore turno; di prendere le misure microscala (tutti 2-3 celle), utilizzare un penetratore rotonda 2,5 micron raggio. </li></ol></li><li> Posizionare il laser sulla punta del cantilever. Allineare il laser al centrodel catturatore utilizzando lo specchio. </li><li> Posizionare un bicchiere pulito sotto l&#39;AFM. NOTA: il seguente è destinata a trasformare il segnale di posizione laser sul recettore AFM in una deformazione del cantilever e, valutando la costante elastica del cantilever, per tradurlo in una forza. </li><li> Approccio con una forza target &quot;set point&quot; di 1 V. </li><li> Selezionare &quot;spettroscopia di forza&quot;. Effettuare una rientranza impostando la massima &quot;set point relativo&quot; a 2 V, il &quot;estendere velocità&quot; a 40 pm / sec, e la &quot;lunghezza z&quot; a 5 micron. </li><li> Dal menu &quot;Calibrazione manager&quot;, selezionare la parte lineare della curva forward per adattarsi alla sensibilità utilizzando il tasto &quot;select gamma adatta&quot;. Il &quot;set point relativo&quot; dovrebbe essere trasformata da &quot;volt&quot; a &quot;meter&quot;. </li><li> Dal menu &quot;direttore calibrazione&quot;, selezionare &quot;costante elastica&quot; per valutare l&#39;elasticity del cantilever usando fluttuazioni termiche. Premere &quot;run&quot; per ottenere la trama densità spettrale del cantilever. Trova il picco di risonanza con la frequenza più bassa. Montare utilizzando il tasto &quot;select gamma adatta&quot;. NOTA 1: Per maggiori dettagli sulla messa a punto fluttuazioni termiche, leggi Cook et al 15. Nota 2: E &#39;preferibile utilizzare un metodo diretto per valutare l&#39;elasticità del cantilever utilizzando un cantilever di riferimento (o materiale con rigidità noto). Quello usato qui è stato gentilmente donato da Atef Asnacios 16. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di mannitolo al 10% sotto la punta cantilever. Riallineare il laser per mezzo della catturatore utilizzando lo specchio. </li><li> Ricalibrare la sensibilità: dal menu &quot;taratura manager&quot;, fare clic sul pulsante &quot;sconosciuto&quot;; ripetere i passaggi da 2.3 fino alla 2.5. </li></ol> . 5 Acquisizione Dati: apparente Modulo di Young Cartografia <ol&gt; <li> Posizionare i campioni montati sotto la AFM e aggiungere una goccia di 500 ml di soluzione di mannitolo al 10% sul campione. La soluzione di mannitolo plasmolyzes le cellule in pochi minuti. </li><li> Approccio con una forza di destinazione (&quot;set point&quot;), del 20 nN (&quot;set point&quot; non deve essere superiore a 3 V) </li><li> Rientro con un &quot;set point parente&quot; di 200 nN, una &quot;estendere velocità&quot; di 40 micron / sec, e &quot;la lunghezza z&quot; di 5 micron. </li><li> Regolare il &quot;set point relativo&quot; al fine di ottenere un rientro di 100 nm per il 200 nm montato a sbalzo o 0,5 micron per il 1 micron / 5 micron fissata a sbalzo. </li><li> In modalità &quot;forza mapping&quot;, selezionare una regione per la scansione: per meristemi, 70 micron x 70 micron con una risoluzione (&quot;pixel&quot;) di 64 x 64; per ipocotili e radici, 100 micron x 100 micron con una risoluzione di 64 x 64. </li><li> Premere SCAN per avviare gli esperimenti. Salvare l&#39;output. </li&gt; </ol> . 6 Analisi dei dati: Calcoli apparente modulo di Young <ol><li> Aprire il file di dati nel software di analisi dati. </li><li> Seleziona &quot;elaborazione batch&quot; per applicare la stessa analisi di tutte le curve di una singola mappa. </li><li> Seleziona &quot;correggere l&#39;altezza per la piegatura del cantilever&quot; in modo da estrarre la profondità di penetrazione. </li><li> Seleziona &quot;modulo funzione in forma di Young&quot; che assume la forza è proporzionale all&#39;area di rientro. Impostare la &quot;forma di punta&quot; per parabolici per supporre che la forma rientro è una parabolica. </li><li> Indicare il raggio della punta. </li><li> Selezionare preferenzialmente la curva &quot;ritrazione&quot; per l&#39;analisi perché è meno sensibile alla topografia rispetto alla curva &quot;estendere&quot;. Tuttavia, se vi è una significativa incollaggio della sonda durante il &quot;ritrazione&quot; usare la curva &quot;estendere&quot;, che è insensibile ad attaccare. </li><li> Setil rapporto di Poisson di 0,5. Premere analizzare e salvare l&#39;output. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nelle piante, la modifica delle proprietà meccaniche svolgono un ruolo importante nel dirigere la crescita e la morfogenesi. Ad oggi ci sono stati grandi progressi nel chiarire le reti genetiche e chimiche che controllano la crescita delle piante, ma la nostra conoscenza di come queste reti contribuiscono e sono influenzati dalle variazioni delle proprietà meccaniche è rudimentale. Questo metodo ci dovrebbe consentire di colmare questa lacuna, e quindi dovrebbe essere di forte interesse per gli scienziati che studiano o...

Crescita nelle piante è ottenuta dall&#39;espansione coordinata delle pareti cellulari rigide che circondano ogni cellula dell&#39;organismo. Accumulando prove indicano che è attraverso la modifica della chimica parete cellulare che le piante controllano localmente questa espansione. L&#39;espansione è pensato per essere determinata principalmente da sforzo sulle pareti cellulari, causate da alta pressione turgore della cellula; questa risposta ceppo di turgore è regolato dalle proprietà meccaniche delle pareti cellulari 1. Si sa poco di queste proprietà meccaniche e come cambiano durante lo sviluppo. Inoltre si sa poco di come queste proprietà meccaniche sono controllate e se le risposte contribuiscono ad alterare la chimica della parete cellulare in un modo che è apparentemente coordinata tra un tessuto. Se vogliamo comprendere la connessione tra cambiamenti chimici e meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo, e in ultima analisi come queste interazioni microscopiche governare una piantaÈ necessario s &#39;crescita macroscopica, un metodo che può monitorare le proprietà meccaniche di pareti cellulari nello sviluppo organi a scala cellulare o tessutale. Il metodo di microscopia a forza atomica (AFM) qui descritto, che si basa su micrometriche o nanometriche compressioni tessuto o rientranze, è stato sviluppato proprio per misurare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari nello sviluppo organi contemporaneamente a risoluzioni subcellulari e attraverso intere regioni di tessuto. Altri metodi hanno o una risoluzione che è troppo basso o troppo alto: l&#39;estensimetro è solo in grado di misurare le proprietà medie meccaniche di un intero tessuto alla scala millimetrica 2-4, una scala che è ad esempio troppo grande per misurare eventi precoci organogenesi; il microindenter può prendere misure a risoluzione subcellulare su scala nanometrica, ma si è limitato a misurare cellule isolate e non gruppi di cellule o organi 5-7. Con l&#39;AFM, l&#39;richiedonod tessuto, cellulare, e risoluzioni subcellulari possono essere raggiunti 8-10. Recentemente diversi protocolli sono stati sviluppati specificamente per misurare meccanica di piante tessuto che potrebbero anche essere utilizzati 11, 12. Nel seguito verrà illustrato come valutare l&#39;elasticità del tessuto attraverso la misurazione della apparente modulo di Young 13. Il modulo di Young è comunemente usato per descrivere la rigidità di un materiale. Durante piccola deformazione la forza necessaria per deformare un materiale è proporzionale all&#39;area di rientro. Il modulo di Young è tale coefficiente. Nel caso di un materiale omogeneo continua lo stesso coefficiente sarà misurato indipendentemente dal tipo rientranza (dimensioni e forma) ma cambia con la velocità della misurazione. Nel caso della struttura complessa di piante tessuto, abbiamo osservato finora che la forza è proporzionale alla deformazione permettendo la determinazioneun coefficiente di proporzionalità che chiamiamo &quot;giovani modulo apparente&quot;. In contrasto da continue medias nelle piante, questa apparente modulo di Young è sensibile alla dimensione della rientranza. Non corrisponde alla giovane moduli di una parete cellulare puro. Esso descrive meglio l&#39;elasticità del ponteggio della parete cellulare del tessuto.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Tutte le 3 generazioni sono in grado di fare il lavoro con la stessa preferenza.</td></tr><tr><td>Stadio AFM</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Richiesto per campioni con bassa topografia (meno di 11 & micro; m tra il punto più basso e quello più alto nell'area di scansione forzata).</td></tr><tr><td>Ottica AFM</td> Ottica <td>JPK</td><td>Top View Molto</td><td>importante per posizionare il campione. Potrebbe essere sostituito da un binocolo a lungo raggio o da un microscopio.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Qualsiasi tipo di stereomicroscopio potrebbe andare bene.</td></tr><tr><td>150 nm montato cantilever</td><td>Nanosensori Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Svizzera</td><td>R150-NCL-10</td><td>Per misurare solo la parete cellulare sulla superficie dell'epidermide utilizzare.</td></tr><tr><td>1 &micro; m montato a sbalzo</td><td>Nanosensori Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Svizzera</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Per misurare la meccanica della parete cellulare ortogonale alla superficie dell'epidermide.</td></tr><tr><td>Nanosensori a sbalzo senza punta</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Svizzera</td><td>TL-NCH-20</td><td>Per misurare la meccanica locale del tessuto (2-3 cellule) utilizzare un 5 &micro; m montato a sbalzo. Abbiamo attaccato un 5 &micro; m perlina borosilicata a un cantilever senza punta.</td></tr><tr><td>5 &micro; m microsfere di silicio</td><td>Corpuscolare</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, Francia</td><td></td><td>Araldite per il fissaggio del cordone al cantilever senza punta.</td></tr><tr><td>Basso punto di fusione agarosio</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176; C temperatura di</td></tr><tr><td>gelificazione D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 pinzette in acciaio inossidabile n. 5</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Svizzera&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

mapping basato afm delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Descriviamo un metodo recentemente sviluppato per misurare le proprietà meccaniche delle superfici dei tessuti vegetali utilizzando microscopia a forza atomica (AFM) micro / nano-rientranze per un JPK AFM. In particolare, in questo protocollo misuriamo modulo apparente di Young delle pareti cellulari con risoluzione subcellulare in tutte le regioni fino a 100 micron x 100 micron di meristemi floreali, ipocotili e radici. Questo richiede un&#39;attenta preparazione del campione, la corretta selezione di micro-penetratori e profondità di rientro. Per spiegare le proprietà della parete cellulare solo, le misurazioni vengono eseguite in soluzioni altamente concentrate di mannitolo per plasmolyze le cellule e rimuovere il contributo del turgore cellulare circoscritta. A differenza di altre tecniche esistenti, utilizzando diversi penetratori e profondità di rientro, questo metodo consente misurazioni multiscala simultanea, <em&gt; Cioè a risoluzioni subcellulare e su centinaia di cellule che compongono un tessuto. Ciò significa che è ora possibile caratterizzare spazialmente-temporalmente i cambiamenti che avvengono nelle proprietà meccaniche dei pareti cellulari durante lo sviluppo, consentendo a questi cambiamenti essere correlato con la crescita e la differenziazione. Questo rappresenta un passo fondamentale per capire come i cambiamenti cellulari microscopiche coordinati portare a eventi morfogenetici macroscopici. Tuttavia, diverse limitazioni restano: il metodo può essere usato solo abbastanza piccoli campioni (circa 100 micron di diametro) e solo su tessuti esterni; il metodo è sensibile alla topografia tessuto; misura solo alcuni aspetti del complesso proprietà meccaniche del tessuto. La tecnica è stata sviluppata rapidamente ed è probabile che la maggior parte di queste limitazioni saranno risolti nel prossimo futuro.

Nella figura 1 presentiamo tipici Giovani mappe di moduli di meristemi floreali (Figure 1A e 1B), giovani e vecchi ipocotili (Figure 1C-F), e meristema root (Figura 1G e 1H). In tutti gli esperimenti penetratore è emisferico, ma il suo raggio si differenzia in modo che le diverse risoluzioni spaziali possono essere raggiunti figure 1C e 1D mostrano risultati tipici per penetratori meso-...

Descriviamo un metodo per mappare le proprietà meccaniche dei tessuti vegetali utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Ci concentriamo su come registrare i cambiamenti meccanici che avvengono nelle pareti cellulari durante lo sviluppo delle piante a mesoscala ad ampio campo, consentendo a questi cambiamenti di essere correlati con la crescita e la morfogenesi.

Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare le proprietà meccaniche dei tessuti vegetali utilizzando un microscopio a forza atomica. Preparare innanzitutto le lamelle di vetro pipettando una goccia di agarosio a bassa temperatura di fusione su una regione incisa della lamella, in modo da formare un sottile film di agarosio. Il secondo passaggio consiste nel dissezionare e montare il campione.Rimuovere i boccioli floreali dal fusto, tagliare il fusto di marris lontano dal fusto principale e immergere immediatamente il fusto di me tagliato nel film sottile di Agros presente sul vetro. Successivamente, aggiungere abbastanza agros fuso di montaggio per riempire la fessura creata quando il fusto di Maris è stato incorporato nel film di Aros. L'ultimo passaggio consiste nell'impostare il microscopio a forza atomica per l'acquisizione dei dati.Alla fine, l'analisi dei dati e le misurazioni del modulo apparente di Young delle pareti cellulari generano una mappa meccanica delle proprietà delle pareti cellulari simultaneamente a risoluzione subcellulare e su intere regioni del tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che può misurare le proprietà meccaniche della parete cellulare simultaneamente a risoluzione subcellulare e su un'intera regione del tessuto. Il mezzo Aros per l'inclusione dei campioni è preparato con aros allo 0,7% a bassa temperatura di fusione in 10% di mannitolo in acqua.Utilizzando uno strumento metallico resistente, come la punta di un trapano, intagliare un'area di 0,5 per 0,5 centimetri al centro di un vetrino per microscopia. Questa operazione rende la superficie ruvida per favorire l'adesione dell'agarosio, assicurando che il mezzo di agarosio aderisca o si fissi al vetrino. Depositare una goccia di circa 20 microlitri di mezzo di agarosio per inclusione sulla zona intagliata del vetrino.Questo produce un sottile film di agros. Conservare il vetrino in una scatola umida e attendere che il mezzo Agros si solidifichi nei campioni di Arabidopsis. Ana verrà utilizzato per la microscopia a forza atomica per preparare i campioni di meristema.Rimuovere i boccioli floreali uno alla volta dal fusto tirandoli verso il basso con pinzette ultrasottili. È importante rimuovere tutti i boccioli floreali fino ai boccioli che non presentano sviluppi successivi, noti come primordi allo stadio P1. Utilizzando una lametta o la punta delle pinzette, tagliare il meristema staccandolo dal fusto.Il taglio deve essere parallelo alla regione della superficie del meristema che si intende misurare con il microscopio a forza atomica o un FM. L'apice ottenuto dovrebbe avere un'altezza compresa tra 300 micrometri e 600 micrometri, in modo da non disintegrarsi durante l'esperimento. Inserire immediatamente l'apice nel sottile strato di mezzo aros preparato in precedenza. Scegliere una posizione sulla lamella di vetro o sul mezzo aros e spingere delicatamente in modo che il meristema sia a diretto contatto con la lamella di vetro e sporga dal mezzo aros.La frattura dell'agros si verifica applicando pressione, quindi il fusto di mari sarà ora posizionato in una crepa. È fondamentale posizionare il fusto di marit nell'aros entro pochi secondi successivi al taglio dal fusto. Ciò impedisce al fusto di MA di seccarsi.È possibile preparare diversi steli di MA in questo modo per l’imaging in batch, a condizione che abbiano la stessa altezza e siano posizionati a meno di 500 micron l’uno dall’altro. Sul vetrino, mantenere gli steli di MA preparati nella scatola umida mentre si procede alla dissezione di ulteriori campioni. Prima di passare al passaggio successivo, utilizzare carta da filtro per rimuovere delicatamente qualsiasi eccesso di acqua presente al confine tra il meristema e le gemme floreali.Questo serve a impedire che l'agarosio fuso inondi il campione a causa delle forze capillari. Successivamente, con una pipetta da 20 microlitri, aggiungere abbastanza agarosio fuso da riempire la fessura creata in precedenza e da circondare ciascun meristema; l'agarosio dovrebbe raggiungere il livello della cicatrice lasciata dal gemmio o dal primordio floreale rimosso. Per raggiungere questo risultato, potrebbe essere necessario aggiungere agarosio a ciascuna estremità della fessura.Quando l'agarosio viene aggiunto, si diffonderà rapidamente nella fessura. Utilizzando la pipetta, aspirare una parte dell'agarosio fuso per assicurarsi che il picciolo ME sia il punto più alto del vetrino. Questo fissa il picciolo ME in modo che non possa muoversi durante l'acquisizione delle immagini di radici e ipocotili.Non è necessaria alcuna dissezione nel sottile strato di agar. Sulla vetrina preparata, utilizzare pinzette microscopiche per creare una scanalatura direttamente sopra un'intaccatura nel vetro o lungo una lamella di vetro; posizionare la radice o l'ipocotile nella scanalatura, assicurandosi che sia a contatto con il vetro lungo tutta la sua lunghezza. Aggiungere agar fuso intorno al campione nello stesso modo mostrato per il campione di fusto.Un mago nano JP PK. In questa dimostrazione viene utilizzato un FM. Per iniziare la procedura, montare una mensola con un indentatore di forma rotonda sull'FM A. Il raggio determinerà la risoluzione X, Y, Z e la profondità di indentazione a cui può essere ottenuta una misurazione accurata.Per effettuare misurazioni da meso a nanoscala sulla superficie dell'epidermide, utilizzare un'indentazione rotonda con raggio di 50 nanometri. Per effettuare misurazioni a mesoscala, utilizzare un'indentazione rotonda con raggio di 0,5 micron; per effettuare misurazioni a microscala su due o tre cellule, utilizzare un'indentazione rotonda con raggio di 2,5 micron posizionando il laser sulla punta della mensola. Allineare il laser al centro del captatore utilizzando lo specchio.Posizionare un vetro pulito sotto l'approccio A FM con un obiettivo di set point di un volt, selezionare la spettroscopia. Eseguire un'indentazione impostando il set point relativo massimo a due volt, la velocità di estensione a 40 micron al secondo e la lunghezza Z a cinque micron. Dal menu del gestore di calibrazione, selezionare la parte lineare della curva in avanzamento per adattare la sensibilità.Utilizzando il pulsante seleziona intervallo di adattamento, il punto di riferimento relativo deve essere trasformato da vol a metro a 200 microlitri di soluzione di manitolo al 10%. Sotto la punta della mensola, riallineare il laser al centro del rilevatore utilizzando lo specchio e, spostando il rispettivo dispositivo, ricalibrare la sensibilità tramite il menu del gestore di calibrazione. Fare clic sul pulsante sconosciuto, selezionare quattro spettroscopie ed eseguire un'indentazione come mostrato in precedenza.Selezionare la parte lineare della curva in avanti per adattare la sensibilità utilizzando il pulsante seleziona intervallo di adattamento per iniziare questa procedura, posizionare i campioni montati sotto la FM A e aggiungere una goccia di 500 microlitri di soluzione di manitolo al 10% sui campioni. La soluzione di manitolo plasma le cellule entro pochi minuti; avvicinarsi con l'obiettivo di un valore di forza di 20 nanoNewton di indentazione con un valore di forza relativo di 200 nanoNewton e una velocità di estensione di 40 micron al secondo e una lunghezza Z di cinque micron. Regolare il valore di forza relativo al fine di ottenere un'indentazione di 100 nanometri per la mensola montata da 200 nanometri oppure di 0,5 micron per quella da un micron.Modalità di mappatura della forza con cantilever montato da 5 micron. Selezionare una regione da scansionare per i fusti mar 70 per 70 micron con una risoluzione di 64 per 64 e per le radici 100 per 100 micron con una risoluzione di 64 per 64. Premere scansiona per avviare gli esperimenti, salvare l'output.Aprire innanzitutto il file di dati nel software di analisi. Quindi selezionare l'elaborazione batch per applicare la stessa analisi a tutte le curve di una singola mappa.Selezionare l'altezza corretta per la flessione della mensola al fine di estrarre la profondità di incavo. Selezionare la funzione di adattamento per il modulo di Young. Questa assumerà che la forza sia proporzionale all'area di incavo.Impostare la forma della punta su parabolica per assumere che la forma dell'indentazione sia una parabola. Indicare il raggio della punta. Successivamente, selezionare la curva di ritrazione per l'analisi.La curva di retrazione è preferita rispetto alla curva di estensione perché è meno sensibile alla topografia. Impostare il rapporto poso a 0,5. Infine, premere su analizza e salvare l'output.Di seguito sono mostrate mappe modulari tipiche ottenute con AFM a forza atomica su fusti floreali di Mars, giovani e vecchi, e su fusti MA delle radici in tutti gli esperimenti. L'indentazione è emisferica, ma il suo raggio varia in modo da ottenere diverse risoluzioni spaziali. Queste mappe mostrano risultati tipici per indentazioni da meso a nanometriche con un raggio di 50 nanometri e profondità di indentazione di 50 nanometri.Il cardiografo rivela eterogeneità su scala microscopica nelle pareti cellulari superficiali delle cellule epidermiche ipocotiledonari. Sono inoltre mostrati risultati tipici di indentazioni su scala mesoscopica con un raggio di 500 nanometri e profondità di 500 nanometri per il meristema floreale, l'ipocotile e la radice. Questo cardiografo relativo a indentazioni su scala microscopica con un raggio di 2,5 micron e profondità di 500 nanometri ha rivelato un ammorbidimento del tessuto durante l'initiazione degli organi, che precede qualsiasi crescita visibile.Tuttavia, questa scansione è stata interrotta a causa dell'escursione dell'altezza del campione che superava la massima escursione Z della FM. Il movimento del campione durante l'esperimento, dovuto a un fissaggio inadeguato, può provocare una scansione sfocata come mostrato qui. Le regioni coperte da agros non possono essere misurate correttamente, come illustrato in questo esempio. Una volta padroneggiata, questa tecnica potrebbe essere completata in un'ora se eseguita correttamente.

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Biologia

La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

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Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

La cellulosa cristallina è un importante costituente della parete cellulare delle piante. Tuttavia, la sua quantificazione a una risoluzione cellulare è tecnicamente impegnativa.  Qui, riportiamo l'uso della tecnologia della luce polarizzata e delle sezioni trasversali delle radici per ottenere informazioni sulla composizione della parete cellulare con una risoluzione spazio-temporale.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Qui, presentiamo la microscopia a forza atomica (AFM), operata come strumento di nano- e micro-rientranza su cellule e tessuti. Lo strumento consente l'acquisizione simultanea della topografia della superficie 3D del campione e delle sue proprietà meccaniche, tra cui il modulo della parete cellulare Young e la pressione del turgor.

Uso della microscopia a forza atomica per misurare le proprietà meccaniche e la pressione del turgor delle cellule vegetali e dei tessuti vegetali

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).

Microscopia a forza atomica per studiare le proprietà fisiche delle cellule epidermiche delle radici vive di Arabidopsis

Gli studi sulla biomeccanica della parete cellulare sono essenziali per comprendere la crescita e la morfogenesi delle piante. Il seguente protocollo è proposto per studiare le pareti cellulari primarie sottili nei tessuti interni di giovani organi vegetali utilizzando la microscopia a forza atomica.

Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

La quantificazione dell'area di contatto e della forza applicata dalla punta di una sonda a forza atomica (AFM) su una superficie del campione consente la determinazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica. Vengono discusse le migliori pratiche per implementare la nanoindentazione basata su sbalzo AFM in aria o fluido su campioni morbidi e duri per misurare il modulo elastico o altre proprietà nanomeccaniche.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

Questo protocollo visualizza come preparare criosezioni di tessuto polmonare murino, eseguire esperimenti di mappa della forza di microscopia a forza atomica e analizzare i dati per determinare il modulo di Young della membrana basale polmonare murina nativa.

Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

Scopri come mappare le proprietà meccaniche dei tessuti vegetali con la microscopia a forza atomica (AFM). Questo metodo consente di correlare i cambiamenti meccanici delle pareti cellulari con la crescita e la morfogenesi in Arabidopsis.

Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

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