Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare le proprietà meccaniche dei tessuti vegetali utilizzando un microscopio a forza atomica. Per prima cosa preparare i vetrini pipettando una goccia di aros a bassa temperatura di fusione su una regione incisa del vetrino per formare un sottile film di aros. Il secondo passo consiste nel sezionare e montare il campione.

Rimuovi i boccioli floreali dal gambo, taglia il gambo di marris dal gambo e incorpora immediatamente il gambo tagliato nella sottile pellicola Agros sul vetro. Scorrere successivamente, aggiungere abbastanza agro di montaggio fusi per riempire la fessura creata quando lo stelo Maris è stato incorporato nella pellicola Aros. Il passo finale è quello di impostare il microscopio a forza atomica per l'acquisizione dei dati.

In definitiva, l'analisi dei dati e le misurazioni del modulo apparente di Young delle pareti cellulari generano una mappa meccanica delle proprietà delle pareti cellulari simultaneamente a risoluzioni subcellulari e in intere regioni di tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che può misurare le proprietà meccaniche della parete cellulare contemporaneamente alla risoluzione subcellulare e su tutta la regione del tessuto. Il terreno Aros per l'inclusione dei campioni è preparato a partire dallo 0,7% di bassa temperatura di fusione, aros in 10% di mannitolo in acqua.

Utilizzando uno strumento metallico resistente, come una punta da trapano, incidere un'area di 0,5 x 0,5 centimetri al centro di un vetro per microscopia. Scivolare questo irruvidisce la superficie in modo da facilitare l'adesione degli agros per garantire che l'agros media aderisca o si fissi allo scivolo. Pipeda droplet di circa 20 microlitri di terreno agros incorporato sulla regione incisa del vetrino.

Questo produce un film sottile di agros. Conservare il vetrino in una scatola umida e attendere che il terreno Agros solidifichi i campioni di Arabidopsis. Ana sarà utilizzato per la microscopia a forza atomica per preparare campioni di meristema.

Rimuovi i boccioli floreali uno ad uno dal gambo tirandoli verso il basso con una pinzetta ultra fine. È importante rimuovere tutti i boccioli floreali fino ai boccioli che non presentano sequel noti come P uno stadio primor. Usando una lama di rasoio o la punta delle pinzette, taglia il meristema lontano dal gambo.

Il taglio deve essere parallelo alla regione della superficie del meristema che deve essere misurata con il microscopio a forza atomica o con un FM. L'apice ottenuto dovrebbe essere alto tra i 300 micron e i 600 micron in modo che non si sbricioli durante l'esperimento. Spingere immediatamente l'apice nella sottile pellicola di aros media preparata in precedenza. Scegliere una posizione sul vetrino o sull'aros e spingere delicatamente in modo che il meristema sia direttamente a contatto con il vetrino e sporga dall'aros.

L'agros si rompe con l'applicazione della pressione, quindi lo stelo del mari si troverà ora in una fessura. È fondamentale posizionare il gambo di marit negli aros entro pochi secondi che seguono i suoi tagli dal gambo. Ciò impedisce l'essiccazione dello stelo MA.

In questo modo è possibile preparare diversi steli di MA per l'imaging in batch, a condizione che siano della stessa altezza e siano posizionati a meno di 500 micron l'uno dall'altro. Sul vetrino, conservare gli steli di ma preparati nella scatola umida mentre si sezionano ulteriori campioni. Prima di procedere con il passaggio successivo, utilizzare la carta da filtro per rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso al confine tra il meristema e i boccioli floreali.

Questo per evitare che gli agro fusi allaghino il campione a causa delle forze capillari. Successivamente, con una pipetta da 20 microlitri a un numero sufficiente di agro di montaggio fusi per riempire la fessura creata in precedenza e per circondare ogni meristema, gli aros dovrebbero raggiungere il livello della cicatrice del bocciolo del fiore rimosso o della palestra primordiale. Per ottenere ciò, potrebbe essere necessario aggiungere agro a ciascuna estremità della fessura.

Quando l'agros viene aggiunto, si allagherà rapidamente nella fessura. Utilizzando la pipetta, aspirare alcuni degli agro di montaggio fusi per assicurarsi che il gambo sia il punto più alto del vetrino. Questo fissa il gambo in modo che non possa muoversi durante l'imaging per radici e ipo coccole.

Non è necessaria alcuna dissezione nel film sottile degli agros. Sul vetrino preparato, utilizzare una micro pinzetta per creare una scanalatura direttamente sopra un'incisione nel vetro o lungo una lamella di vetro. Posizionare la radice o l'ipococcola in questa scanalatura, assicurandosi che sia a contatto con il vetro per tutta la sua lunghezza di tenuta. Aggiungere agro di montaggio fusi attorno al campione nello stesso modo dimostrato per il campione mestem.

Una procedura guidata JP PK nano. In questa dimostrazione viene utilizzato un FM. Per iniziare questa procedura, montare un cantilever con una rientranza di forma rotonda sull'A FM. Il raggio determinerà la risoluzione X, Y, Z e la profondità di indentazione alla quale è possibile archiviare una misurazione accurata.

Per effettuare misurazioni su scala nanometrica sulla superficie dell'epidermide, utilizzare una rientranza rotonda con raggio di 50 nanometri. Per effettuare misurazioni su mesoscala, utilizzare una indenture rotonda con raggio di 0,5 micron e per effettuare misurazioni su microscala su due o tre celle, utilizzare una indenture rotonda con raggio di 2,5 micron e posizionare il laser sulla punta del cantilever. Allineare il laser al centro del catturatore utilizzando lo specchio.

Posizionare un vetro pulito sotto l'approccio A FM con un target per il set point di un volt, selezionare per la spettroscopia. Eseguire un'indentazione impostando il set point relativo massimo su due volt, la velocità di estensione a 40 micron al secondo e la lunghezza Z a cinque micron. Dal menu del gestore della calibrazione, selezionare la parte lineare della curva in avanti per adattarla alla sensibilità.

Utilizzando il pulsante di selezione dell'intervallo di adattamento, il setpoint relativo deve essere trasformato da vol a metro a 200 microlitri di soluzione di manitolo al 10%. Sotto la punta a sbalzo, riallineare il laser al centro del captatore utilizzando lo specchio e, spostando il rispetto, ricalibrare la sensibilità dal menu del gestore di calibrazione. Fare clic sul pulsante sconosciuto, selezionare quattro spettroscopie ed eseguire un'indentazione come mostrato in precedenza.

Selezionare la parte lineare della curva in avanti per adattarla alla sensibilità utilizzando il pulsante di selezione dell'intervallo di adattamento per iniziare questa procedura, posizionare i campioni montati sotto l'A FM e aggiungere una goccia da 500 microlitri di soluzione di manitolo al 10% sui campioni. La soluzione di manitolo plasma le cellule in pochi minuti con l'obiettivo di un set point di 20 nano Newton in dent con un set point relativo di 200 nano newton e una velocità di estensione di 40 micron al secondo e una lunghezza Z di cinque micron. Regolare il set point relativo in modo da ottenere un'indentazione di 100 nanometri per il cantilever montato a 200 nanometri o di 0,5 micron per il cantilever di un micron.

Modalità di mappatura della forza a sbalzo montata a cinque micron. Selezionare una regione per la scansione di steli di 70 x 70 micron con una risoluzione di 64 x 64 per ipo cos e radici di 100 x 100 micron con una risoluzione di 64 x 64. Premere scansione per avviare gli esperimenti, salvare l'output.

Inizia aprendo il file di dati nel software di analisi dei dati. Quindi selezionare l'elaborazione batch. Per applicare la stessa analisi a tutte le curve di una singola mappa.

Selezionare correggere l'altezza per la flessione del cantilever per estrarre la profondità di indentazione. Selezionare la funzione di adattamento del modulo di Young. Ciò presuppone che la forza sia proporzionale all'area di indentazione.

Impostate la forma della punta su parabolica per presumere che la forma dell'indentazione sia una parabola. Indicare il raggio della punta. Quindi, selezionate la curva di retrazione per l'analisi.

La curva di retrazione è preferita alla curva di estensione perché è meno sensibile alla topografia. Impostare il rapporto poso su 0,5. Infine, premi, analizza e salva l'output.

In tutti gli esperimenti sono mostrate mappe modulari tipiche di A FM giovani e giovani di steli floreali di Marte. L'indenture è emisferica, ma il suo raggio differisce in modo da poter ottenere diverse risoluzioni spaziali. Queste mappe mostrano risultati tipici per indenture su scala meso e nanometrica con un raggio di 50 nanometri con indentazioni di profondità di 50 nanometri.

Il cardiografo rivela eterogeneità su microscala nelle pareti cellulari superficiali delle cellule epidermiche ipocodali. Sono mostrati anche i risultati tipici per indenture a mesoscala con un raggio di 500 nanometri con rientranze di profondità di 500 nanometri per meristema floreale, ipococcola e radice. Questo cardiografo per indenture su microscala con un raggio di 2,5 micron con rientranze di profondità di 500 nanometri ha rivelato un rammollimento dei tessuti durante l'inizio dell'organo che precede qualsiasi crescita visibile.

Tuttavia, questa scansione è stata interrotta a causa dell'intervallo di altezza del campione che supera l'intervallo Z massimo dell'A FM. Il movimento del campione durante l'esperimento dovuto a una fissazione impropria può causare una scansione sfocata, come mostrato qui. Anche le regioni coperte da agros non possono essere misurate correttamente, come illustrato in questo esempio. Una volta padroneggiata, questa tecnica poteva essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente.