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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Passaggio delle cellule

Passaging Cells

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Passaging Cells

2.1: Using a Hemacytometer to Count Cells

2.3: PCR: The Polymerase Chain Reaction

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10:02 min

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April 30, 2023

Overview

Le linee cellulari sono spesso utilizzate in esperimenti biomedici, in quanto consentono una rapida coltura ed espansione dei tipi di cellule per l’analisi sperimentale. Le linee cellulari vengono coltivate in condizioni simili rispetto alle cellule appena isolate o primarie, ma con alcune importanti differenze di base: (i) le linee cellulari richiedono i propri cocktail specifici di fattori di crescita e (ii) la loro crescita deve essere monitorata più da vicino rispetto alle cellule primarie, poiché le mutazioni che consentono loro di essere coltivate indefinitamente possono anche portare rapidamente alla loro crescita eccessiva. Pertanto, quando una linea cellulare raggiunge il punto di crescita in coltura in cui copre la maggior parte del fondo del contenitore di coltura, o circa un 90% di confluenza,le cellule devono essere risuscise, lavate, utilizzate sperimentalmente, congelate per un uso successivo o nuovamente seminate per un’ulteriore espansione in nuovi contenitori di coltura.

Questo video dimostrerà come utilizzare gli indicatori dei supporti per determinare la salute della coltura cellulare, quali reagenti e attrezzature sono utili per rimuovere in modo sicuro le linee cellulari aderenti dalla coltura e verranno discussi vari metodi per trasferire queste cellule in forte espansione in nuove colture. Sono stati inoltre dimostrati i metodi su come colturare le cellule di alimentazione (importanti per fornire fattori di crescita essenziali alle linee cellulari) e come espandere un gran numero di colture di linee cellulari contemporaneamente.

Procedure

Il passaggio, o subculturazione, delle cellule è una procedura comune in cui le cellule di una determinata coltura vengono divise, o “divise”, in nuove colture e alimentate con mezzi freschi per facilitare un’ulteriore espansione. Mentre il concetto stesso è relativamente semplice, in questo video discuteremo alcuni dei passaggi più importanti per il successo della manutenzione e dell’espansione delle linee cellulari.

I metaboliti tossici si accumulano nei mezzi di coltura cellulare nel tempo. Quando si espandono le cellule, è particolarmente importante cambiare regolarmente i mezzi per mantenere la salute cellulare e monitorare l’espansione cellulare per evitare la crescita eccessiva delle cellule.

Generalmente, due tipi principali di cellule sono sottocolte: linee cellulari immortalizzate e linee di cellule staminali

Le linee cellulari immortalizzate sono cellule derivate da organismi multicellulari che hanno sperimentato un qualche tipo di mutazione che influenza la regolazione del ciclo cellulare, consentendo loro di proliferare indefinitamente. Forse la linea cellulare immortalata più famosa è la linea cellulare HeLa, che è stata derivata da una lesione del cancro cervicale trovata su una biopsia presa dalla signora Henrietta Lacks nel 1951.

A differenza delle linee cellulari immortalate dal cancro, le linee di cellule staminali sono generate isolando cellule auto-rinnovanti e multipotenti da una varietà di tessuti sia da tessuti adulti che embrionali. Nelle giuste condizioni queste cellule, come le cellule staminali embrionali umane che vedete qui, possono essere mantenute in coltura a tempo indeterminato.

Le cellule sono coltivate in modo ottimale in sospensione, come le cellule immortalizzate isolate dal sangue, o crescono meglio se aderiscono a una superficie, come nel caso di molte cellule derivate dai tessuti.

La crescita di queste cellule aderenti deve essere attentamente monitorata per garantire la salute delle cellule. A seconda del tipo di cellula, la maggior parte delle cellule aderenti deve essere attraversata quando sono confluenti al 70-90%, cioè quando coprono il 70-90% della superficie del contenitore di coltura.

Tieni presente che le linee cellulari mantengono molte caratteristiche della coltura cellulare originale, ma con ogni passaggio successivo possono anche iniziare ad acquisire caratteristiche uniche per la coltura espansa. Pertanto, considera di limitare il numero di volte in cui continui a passare una singola coltura cellulare.

Quando si passano le cellule, è importante utilizzare la tecnica sterile e i reagenti e le attrezzature appropriati.

È essenziale utilizzare i mezzi appropriati per la crescita e l’espansione ottimali della linea cellulare. Ogni linea cellulare richiederà un cocktail specifico di integratori per la crescita, tuttavia, la maggior parte delle linee cellulari richiede almeno l’integrazione con quanto segue: Siero, come il siero bovino fetale, che deve essere trattato termicamente per inattivare il complemento bovino e che fornisce fattori di crescita vitali per le cellule, antibiotici, come penicillina e streptomicina, che aiutano a limitare la crescita contaminante nella coltura, e altri fattori di crescita, come il fattore di crescita dei fibroblasti, per aiutare a prolungare la crescita e l’espansione delle linee cellulari. Conservare il supporto di coltura cellulare integrato, o “completo”, a 4 C quando non lo si utilizza.

Innanzitutto, prendi nota del colore dei mezzi di coltura dei tessuti. I mezzi di coltura cellulare freschi sono ricchi di sostanze nutritive e appaiono di un colore arancione chiaro, in parte dovuto all’aggiunta dell’indicatore di pH, il rosso fenolo.

Quando le cellule iniziano a consumare sostanze nutritive nei mezzi, i rifiuti e l’acido iniziano ad accumularsi nella coltura cellulare, abbassando il pH. Per questo motivo, molti mezzi di coltura tissutale contengono rosso fenolo, che trasforma il mezzo da arancione a giallo quando le cellule trasformano la coltura acida. Cambia il supporto prima che diventi di questo colore!

Quando il rosso fenolo trasforma il media in un colore rosato, indicando che il pH è diventato troppo semplice per una crescita cellulare sana, potrebbe essere il momento di cambiare il serbatoio di CO2 e il supporto.

La maggior parte delle linee cellulari aderenti si attaccano naturalmente alla plastica non rivestita. Pertanto le piastre di coltura cellulare in plastica, come le piastre di Petri o 6 piastre di pozzo, sono spesso utilizzate per la sottoculturazione delle cellule.

Vengono utilizzati anche palloni di coltura cellulare in plastica. Il pallone per colture cellulari T25, ad esempio, viene spesso utilizzato per espandere le popolazioni di piccole linee cellulari o per avviare la crescita di una linea cellulare in lenta espansione. I palloni di coltura T75 sono comunemente usati per le linee cellulari che proliferano più rapidamente o per generare un numero maggiore di cellule rispetto a quelle che possono stare in un pallone T25.

Quando si rimuovono le cellule aderenti, le proteine che legano le cellule alla plastica devono prima essere scisse. A tale scopo, l’enzima digestivo tripsina viene spesso utilizzato. È importante cronodare attentamente l’esposizione alla tripsina, poiché il trattamento per troppo tempo può causare danni ad altre proteine della superficie cellulare.

I mezzi di coltura cellulare possono contenere neutralizzatori di tripsina. Pertanto, la soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, viene spesso utilizzata per lavare le cellule prima della tripsinizzazione.

EDTA, un chelatore di calcio, è talvolta utilizzato anche per migliorare la funzione proteolitica della tripsina.

Per l’espansione della colonia cellulare, le cellule appena attraversate vengono quindi coltivate in un incubatore di colture cellulari nelle condizioni appropriate a quella linea cellulare, in genere a circa 37 C, 5% di CO2 e 95% di umidità.

Prima di iniziare, è importante capire con quale frequenza le cellule devono essere monitorate, il che dipenderà dalla velocità con cui le cellule proliferano.

Ora che il tuo supporto è di un colore arancione felice, osserva le altre condizioni di coltura, come ad esempio se la coltura è torbosa o meno – possibilmente indicando contaminazione – la dimensione e la densità delle colonie cellulari e la qualità complessiva delle cellule.

Se le cellule hanno raggiunto circa il 90% di confluenza, rimuovere il mezzo di coltura tissutale e lavare le cellule con PBS privo di calcio e magnesio.

Ora aggiungi la tripsina alle cellule e poi incubale a 37 C. Dopo circa 5 minuti, confermare che le cellule si sono staccate e quindi interrompere la proteolisi aggiungendo mezzi di coltura tissutale freschi.

Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico per la centrifugazione. Quindi, dopo aver ruotato le cellule, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet e risospenare le cellule in mezzi freschi. Conta quante cellule hai raccolto e poi semina le cellule in base alla densità appropriata per l’espansione immediata o successiva.

Ora che sai come passare le cellule, diamo un’occhiata ad alcune diverse applicazioni del metodo.

Come accennato in precedenza, le cellule staminali embrionali umane sono un tipo di cellula che deve essere attraversata. Sono tipicamente cocolti con fibroblasti embrionali di topo, o MEF, che forniscono fattori che aiutano le cellule staminali a mantenere il loro stato pluripotente.

Le colonie di cellule staminali cresciute su cellule di alimentazione devono essere “raccolte” una volta raggiunto il giusto stadio di sviluppo. Possono essere selezionati mediante micropipetta o raschiando delicatamente con uno strumento di raccolta del vetro e quindi placcati in una nuova cultura per l’espansione.

Alcune linee cellulari sono sensibili alla digestione enzimatica o sono così strettamente aderenti che non possono essere riconsocie con il solo trattamento con tripsina. Un raschietto cellulare può essere utilizzato per rimuovere delicatamente le cellule dal fondo della piastra di coltura. Se le cellule sono particolarmente aderenti, provare a spostare una pipetta sierologica con un movimento raschiante deciso mentre si risciacqua il fondo del contenitore cellulare con un supporto o un’altra soluzione appropriata. Fai attenzione con questo metodo, poiché le cellule delicate possono essere danneggiate da questo metodo meccanico di dissociazione.

Per aumentare l’espansione delle cellule in modo più rapido e riproducibile di quanto si possa ottenere nei palloni a strato singolo, è possibile utilizzare palloni multistrato, che possono espandere le colture cellulari di 3-5 volte rispetto ai palloni a strato singolo.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alle cellule che passano. In questo video abbiamo esaminato cos’è una linea cellulare, come sottocultarne una e alcune diverse applicazioni delle cellule di passaggio. Grazie per aver guardato e ricordati di mantenere freschi i tuoi media!

Transcript

Passaging, or subculturing, of cells, is a common procedure wherein cells from a given culture are divided, or “split”, into new cultures and fed with fresh media to facilitate further expansion. While the concept itself is relatively simple, in this video we will discuss some of the more important steps for the successful maintenance and expansion of cell lines.

Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time. When expanding cells, it is particularly important to change the media regularly to maintain cell health and to monitor the cell expansion to avoid cell overgrowth.

Generally, two main types of cells are subcultured: immortalized cell lines and stem cell lines

Immortalized cell lines are cells that are derived from multicellular organisms that have experienced some type of mutation affecting their cell cycle regulation, allowing them to proliferate indefinitely. Perhaps the most famous immortalized cell line is the HeLa cell line, which was derived from a cervical cancer lesion found on a biopsy taken from Ms. Henrietta Lacks in 1951.

In contrast to cell lines immortalized by cancer, stem cell lines are generated by isolating self-renewing and multipotent cells from a variety of tissues both from adult and embryonic tissues. Under the right conditions these cells, like the human embryonic stem cells you see here, can be maintained in culture indefinitely.

Cells are either optimally cultured in suspension, like immortalized cells isolated from blood, or they grow best when adhered to a surface, as is the case for many tissue-derived cells.

The growth of these adherent cells must be closely monitored to ensure cell health. Depending on the cell type, most adherent cells need to be passaged when they are 70-90% confluent, that is, when they cover 70-90% of the culture container surface.

Bear in mind that cell lines retain many characteristics of the original cell culture, but with each successive passage they can also begin to acquire characteristics unique to the expanded culture. Therefore, consider limiting the number of times you continue to passage an individual cell culture.

When passaging cells, it is important to use sterile technique and the appropriate reagents and equipment.

It is essential to use the appropriate media for the optimal growth and expansion of your cell line. Each cell line will require a specific growth supplement cocktail, however, most cell lines at minimum require supplementation with the following: Serum, such as Fetal Bovine Serum, which must be heat-treated to inactivate the bovine complement and which provides vital growth factors for the cells, antibiotics, like penicillin and streptomycin, which help limit contaminating growth in the culture, and other growth factors, like fibroblast growth factor, to help prolong the growth and expansion of the cell lines. Store the supplemented, or “complete”, cell culture media at 4 C when you’re not using it.

First, take note of the color of the tissue culture media. Fresh, cell culture media is rich in nutrients and appears a clear, orange color, partly due to the addition of the pH indicator, phenol red.

As cells begin to use up nutrients in the media, waste and acid begin to build up in the cell culture, lowering the pH. For this reason, many tissue culture medias contain phenol red, which turns the media from orange to yellow when cells turn the culture acidic. Change the media before it turns this color!

When the phenol red turns the media a pinkish color, indicating that the pH has become too basic for healthy cell growth, it may be time to change your CO2 tank as well as your media.

Most adherent cell lines attach naturally to uncoated plastic. Therefore plastic cell culture plates, like petri dishes or 6 well plates, are frequently used for subculturing cells.

Plastic cell culture flasks are also used. The T25 cell culture flask, for example, is often used to expand small cell line populations or to start the growth of a slowly expanding cell line. T75 culture flasks are commonly used for cell lines that proliferate more quickly or to generate larger numbers of cells than can fit in a T25 flask.

When removing adherent cells, the proteins that bind the cells to the plastic must first be cleaved. For this purpose, the digestive enzyme trypsin is frequently used. It is important to carefully time the trypsin exposure, as treatment for too long can result in damage to other cell surface proteins.

Cell culture media can contain trypsin neutralizers. Therefore, phosphate buffered saline, or PBS, is often used to wash the cells before trypsinization.

EDTA, a calcium chelator, is sometimes also used to enhance the proteolytic function of trypsin.

For expansion of the cell colony, the freshly-passaged cells are then grown in a cell culture incubator under the conditions appropriate to that cell line, typically at about 37 C, 5% CO2, and 95% humidity.

Before you begin, it is important to understand how frequently your cells should be monitored, which will depend on how fast your cells proliferate.

Now that your media is a happy orange color, observe the other culture conditions, such as whether or not the culture is cloudy – possibly indicating contamination — the size and density of the cell colonies, and the overall quality of the cells.

If the cells have reached about 90% confluency, remove the tissue culture media and wash the cells with calcium- and magnesium-free PBS.

Now add trypsin to the cells and then incubate them at 37 C. After about 5 minutes, confirm that the cells have detached, and then stop the proteolysis by adding fresh tissue culture media.

Transfer the cell suspension into a conical tube for centrifugation. Then, after spinning down the cells, carefully remove the supernatant without disturbing the pellet and resuspend the cells in fresh media. Count how many cells you’ve collected and then seed the cells according to the density appropriate for immediate or later expansion.

Now that you know how to passage cells, let’s look at some different applications of the method.

As mentioned earlier, human embryonic stem cells are a type of cell that must be passaged. They are typically cocultured with mouse embryonic fibroblasts, or MEFs, which provide factors that help stem cells retain their pluripotent state.

Stem cell colonies grown on feeder cells need to be “picked” once they’ve reached the proper stage of development. They can be selected by micropipette or by gentle scraping with a glass picking tool and then plated in a new culture for expansion.

Some cell lines are sensitive to enzymatic digest or they are so tightly adherent they can’t be resuspended with trypsin treatment alone. A cell scraper can be used to gently remove the cells from the bottom of the culture plate. If the cells are particularly adherent, try moving a serological pipette in a firm scraping motion while rinsing the bottom of the cell container with media or another appropriate solution. Take care with this method, as delicate cells can be damaged by this mechanical method of dissociation.

To more quickly and reproducibly scale up the expansion of your cells than can be achieved in single layer flasks, multilayer flasks, which can expand cell cultures 3-5 fold compared to single layer flasks, can be used.

You’ve just watched JoVE’s introduction to passaging cells. In this video we reviewed what a cell line is, how to subculture one, and some different applications of passaging cells. Thanks for watching and remember to keep your media fresh!

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Passaging Cells Subculturing Cells Cell Culture Cell Lines Media Change Cell Health Cell Expansion Immortalized Cell Lines Stem Cell Lines HeLa Cell Line Cancer Cells Self-renewing Cells Multipotent Cells Embryonic Stem Cells Suspension Culture