2.2: Passaggio delle cellule

Il passaggio, o subcoltura, delle cellule, è una procedura comune in cui le cellule di una data coltura vengono divise, o "divise", in nuove colture e alimentate con terreni freschi per facilitare un'ulteriore espansione. Sebbene il concetto in sé sia relativamente semplice, in questo video discuteremo alcuni dei passaggi più importanti per il successo della manutenzione e dell'espansione delle linee cellulari.

I metaboliti tossici si accumulano nel tempo nei terreni di coltura cellulare. Quando si espandono le cellule, è particolarmente importante cambiare regolarmente i terreni per mantenere la salute delle cellule e monitorare l'espansione delle cellule per evitare la crescita eccessiva delle cellule.

Generalmente, due tipi principali di cellule vengono sottocoltivate: linee cellulari immortalizzate e linee di cellule staminali

{{}}Le linee cellulari immortalizzate sono cellule derivate da organismi pluricellulari che hanno sperimentato qualche tipo di mutazione che influenza la regolazione del loro ciclo cellulare, permettendo loro di proliferare indefinitamente. Forse la linea cellulare immortalizzata più famosa è la linea cellulare HeLa, che è stata derivata da una lesione di cancro cervicale trovata in una biopsia prelevata dalla signora Henrietta Lacks nel 1951.

A differenza delle linee cellulari immortalizzate dal cancro, le linee cellulari staminali sono generate isolando cellule autorinnovanti e multipotenti da una varietà di tessuti sia adulti che embrionali. Nelle giuste condizioni queste cellule, come le cellule staminali embrionali umane che vedete qui, possono essere mantenute in coltura a tempo indeterminato.

Le cellule vengono coltivate in modo ottimale in sospensione, come le cellule immortalizzate isolate dal sangue, oppure crescono meglio quando aderiscono a una superficie, come nel caso di molte cellule derivate dai tessuti.

La crescita di queste cellule aderenti deve essere attentamente monitorata per garantire la salute delle cellule. A seconda del tipo di cellula, la maggior parte delle cellule aderenti deve essere fatta passare quando sono confluenti al 70-90%, cioè quando coprono il 70-90% della superficie del contenitore di coltura.

Tenete presente che le linee cellulari conservano molte caratteristiche della coltura cellulare originale, ma con ogni passaggio successivo possono anche iniziare ad acquisire caratteristiche uniche per la coltura espansa. Pertanto, prendi in considerazione la possibilità di limitare il numero di volte in cui continui a passare una singola coltura cellulare.

Quando si passano le cellule, è importante utilizzare una tecnica sterile e i reagenti e le attrezzature appropriate.

È essenziale utilizzare i terreni appropriati per la crescita e l'espansione ottimali della linea cellulare. Ogni linea cellulare richiederà un cocktail specifico di integratori per la crescita, tuttavia, la maggior parte delle linee cellulari richiede almeno l'integrazione con quanto segue: siero, come il siero fetale bovino, che deve essere trattato termicamente per inattivare il complemento bovino e che fornisce fattori di crescita vitali per le cellule, antibiotici, come la penicillina e la streptomicina, che aiutano a limitare la crescita contaminante nella coltura, e altri fattori di crescita, come il fattore di crescita dei fibroblasti, per aiutare a prolungare la crescita e l'espansione delle linee cellulari. Conservare il terreno di coltura cellulare integrato, o "completo", a 4 C quando non lo si utilizza.

Innanzitutto, prendi nota del colore dei terreni di coltura tissutale. I terreni di coltura cellulare freschi sono ricchi di sostanze nutritive e appaiono di un colore arancione chiaro, in parte dovuto all'aggiunta dell'indicatore di pH, il rosso fenolo.

Quando le cellule iniziano a consumare i nutrienti nel terreno, i rifiuti e l'acido iniziano ad accumularsi nella coltura cellulare, abbassando il pH. Per questo motivo, molti terreni di coltura tissutale contengono rosso fenolo, che trasforma il terreno da arancione a giallo quando le cellule diventano acide nella coltura. Cambia il supporto prima che diventi di questo colore!

Quando il rosso fenolo trasforma il terreno in un colore rosato, indicando che il pH è diventato troppo basico per una crescita cellulare sana, potrebbe essere il momento di cambiare il serbatoio di CO2 e il terreno.

La maggior parte delle linee cellulari aderenti si attacca naturalmente alla plastica non rivestita. Pertanto, le piastre di coltura cellulare in plastica, come le piastre di Petri o le piastre a 6 pozzetti, sono spesso utilizzate per la subcoltura delle cellule.

Vengono utilizzati anche palloni di plastica per colture cellulari. Il pallone per colture cellulari T25, ad esempio, viene spesso utilizzato per espandere le popolazioni di piccole linee cellulari o per avviare la crescita di una linea cellulare in lenta espansione. I flaconi di coltura T75 sono comunemente utilizzati per linee cellulari che proliferano più rapidamente o per generare un numero maggiore di cellule rispetto a quello che può entrare in un pallone T25.

Quando si rimuovono le cellule aderenti, le proteine che legano le cellule alla plastica devono prima essere tagliate. A questo scopo, viene spesso utilizzato l'enzima digestivo tripsina. È importante cronometrare attentamente l'esposizione alla tripsina, poiché un trattamento troppo lungo può causare danni ad altre proteine della superficie cellulare.

I terreni di coltura cellulare possono contenere neutralizzanti della tripsina. Pertanto, la soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, viene spesso utilizzata per lavare le cellule prima della tripsinizzazione.

L'EDTA, un chelante del calcio, viene talvolta utilizzato anche per migliorare la funzione proteolitica della tripsina.

Per l'espansione della colonia cellulare, le cellule appena passate vengono quindi coltivate in un incubatore per colture cellulari nelle condizioni appropriate a quella linea cellulare, tipicamente a circa 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.

Prima di iniziare, è importante capire con quale frequenza le cellule devono essere monitorate, il che dipenderà dalla velocità con cui le cellule proliferano.

Ora che il tuo supporto è di un colore arancione felice, osserva le altre condizioni della cultura, ad esempio se la cultura è torbida o meno? Probabilmente indicando la contaminazione: la dimensione e la densità delle colonie cellulari e la qualità complessiva delle cellule.

Se le cellule hanno raggiunto circa il 90% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura tissutale e lavare le cellule con PBS privo di calcio e magnesio.

Ora aggiungi la tripsina alle cellule e poi incubale a 37 C. Dopo circa 5 minuti, confermare che le cellule si sono staccate, quindi interrompere la proteolisi aggiungendo nuovi terreni di coltura tissutale.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica per la centrifugazione. Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere le celle in un terreno fresco. Conta quante cellule hai raccolto e poi semina le cellule in base alla densità appropriata per l'espansione immediata o successiva.

Ora che sai come far passare le cellule, diamo un'occhiata ad alcune diverse applicazioni del metodo.

Come accennato in precedenza, le cellule staminali embrionali umane sono un tipo di cellula che deve essere fatta passare. Sono tipicamente co-coltivati con fibroblasti embrionali di topo, o MEF, che forniscono fattori che aiutano le cellule staminali a mantenere il loro stato pluripotente.

Le colonie di cellule staminali coltivate su cellule alimentatrici devono essere "raccolte" una volta raggiunto il giusto stadio di sviluppo. Possono essere selezionati mediante micropipetta o raschiando delicatamente con uno strumento per la raccolta del vetro e quindi impiattati in una nuova coltura per l'espansione.

Alcune linee cellulari sono sensibili alla digestione enzimatica o sono così strettamente aderenti che non possono essere risospese con il solo trattamento con tripsina. È possibile utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere delicatamente le cellule dal fondo della piastra di coltura. Se le cellule sono particolarmente aderenti, provare a muovere una pipetta sierologica con un movimento deciso di raschiatura mentre si risciacqua il fondo del contenitore delle cellule con terreno o un'altra soluzione appropriata. Fai attenzione con questo metodo, poiché le cellule delicate possono essere danneggiate da questo metodo meccanico di dissociazione.

Per aumentare l'espansione delle cellule in modo più rapido e riproducibile rispetto ai matracci monostrato, è possibile utilizzare i flaconi multistrato, che possono espandere le colture cellulari di 3-5 volte rispetto ai palloni monostrato.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al passaggio delle cellule. In questo video abbiamo esaminato cos'è una linea cellulare, come sottocoltivarne una e alcune diverse applicazioni del passaggio delle cellule. Grazie per aver guardato e ricordati di mantenere freschi i tuoi contenuti multimediali!