Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'affinità di legame di un'interazione con un ligando proteico senza purificare la proteina da un lisato cellulare. Ciò si ottiene esprimendo prima la proteina fusa GFP di interesse in qualsiasi linea cellulare aderente. Dopo la preparazione del lisato cellulare e delle diluizioni del ligando, le miscele di ligandi del lisato cellulare vengono preparate e caricate nei capillari.

Successivamente, viene misurata la termoresi della proteina fusa GFP in presenza di concentrazioni variabili di ligando. La fase finale è l'analisi dei dati delle misure di termoferesi su microscala o MST. In definitiva, la termoresi su microscala viene utilizzata per determinare le affinità di legame delle interazioni tra le proteine fuse con GFP e vari ligandi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la titolazione, la calorimetria o la mono energia al plasma superficiale, è che evita la purificazione delle proteine, semplificando e accelerando significativamente la caratterizzazione quantitativa delle interazioni binarie. Questo metodo presenta vantaggi significativi quando si lavora con proteine difficili da esprimere e purificare, come le proteine di membrana e i fattori di trascrizione. Uno dei maggiori vantaggi della termoferesi su microscala è che funziona in una varietà di tamponi e tollera la presenza di detergenti e le mie cellule nel sistema A dimostrare la tecnica sarà Karen Stefka, una biologa del mio laboratorio Per iniziare lavare brevemente le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato o PBS utilizzando 10 millilitri di tampone per pallone T 75.

Tenere le celle in ghiaccio per cinque minuti o fino a quando non iniziano a staccarsi dal pallone. Raschiare le celle con il raschietto per staccarle se necessario. Risospendere le cellule in 10 millilitri di PBS ghiacciato e trasferirle in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 14 millilitri pre-raffreddata.

Pellettare le celle mediante centrifugazione a 400-600 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lisi ghiacciato. Trasferire la sospensione in una provetta einor pre-raffreddata da 1,5 millilitri per l'estrazione delle proteine citosoliche.

Posizionare le celle sul ghiaccio per ridurre al minimo il surriscaldamento locale e limare le celle con impulsi di sonicazione tre volte dieci secondi al 30% di ampiezza. Usando una punta pre-raffreddamento da due a tre millimetri, mantieni la punta sotto la superficie per ridurre al minimo la formazione di schiuma. Omettere questo passaggio quando si utilizza un detersivo contenente tampone e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

Invece, correggere la soluzione di lisato in modo che contenga una concentrazione fisiologica di sale di 100 millimolari di cloruro di sodio, se necessario, da una soluzione madre di cloruro di sodio a cinque molari. Infine, raccogliere i lisati mediante centrifugazione a circa 25.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Selezionare il diodo a emissione di luce o la sorgente di eccitazione a LED con lunghezza d'onda pari a 470 nanometri sullo strumento MST.

Caricare i capillari con estratto cellulare diluito due e 10 volte con tampone MST e inserirli nello strumento MST. Eseguire l'operazione di ricerca dei capillari sul software di controllo dello strumento MST. L'intervallo di fluorescenza ottimale nel lisato diluito va da 400 a 1500 unità di fluorescenza.

Procedere alla determinazione dell'intervallo di concentrazione ottimale del ligando come descritto nel protocollo di testo. Posizionare un rack per provette con il numero necessario di provette da centrifuga a basso legame da 0,5 millilitri su una pipetta per ghiaccio, 25 microlitri di tampone MST sul fondo di ciascuna provetta a 25 microlitri della soluzione madre del legante nella prima provetta ed eseguire una doppia diluizione seriale del legante utilizzando il resto delle provette. Tenere il rack con i campioni di ligando sul ghiaccio.

Calcolare la diluizione del lisato cellulare per ottenere il livello ottimale della proteina bersaglio fluorescente nelle reazioni di legame. La concentrazione finale della proteina dovrebbe essere vicina alla costante di dissociazione di legame prevista o inferiore e dovrebbe essere regolata per ottenere il numero necessario di conteggi di fluorescenza. Nella soluzione finale, procedere alla diluizione del lisato cellulare con il tampone MST.

Posizionare le provette da 0,5 millilitri a basso legame nel rack delle provette di fronte alle provette con i campioni di diluizione seriale del ligando. Aggiungere con cautela 15 microlitri di lisato cellulare sul fondo di ogni provetta. Cercare di non toccare le pareti del tubo per evitare la perdita di campione.

Aggiungere 15 microlitri del campione di ligando con la concentrazione più alta alla provetta corrispondente. Numero uno, con il lisato cellulare. Mescolare bene e sostituire la punta della pipetta.

Ripetere questo passaggio con il resto delle provette ad eccezione dell'ultima, che non dovrebbe contenere legante. Aggiungere 15 microlitri di tampone MST all'ultima provetta e mescolare. Riempire bene circa due terzi del primo capillare con la miscela legante della provetta numero uno.

Inclinarlo per spostare la soluzione verso il centro e posizionare il capillare sul vassoio capillare in posizione. Numero uno, ripeti questo passaggio con il resto dei capillari. Le estremità capillari possono essere tappate con cera per esperimenti più lunghi.

Posizionare il vassoio all'interno dello strumento MST e chiudere lo sportello dello strumento. Successivamente, selezionare la sorgente di eccitazione LED con lunghezza d'onda pari a 470 nanometri. Sullo strumento MST, eseguire il comando di ricerca dei capillari per consentire allo strumento di trovare le posizioni esatte dei capillari e misurare la fluorescenza dei campioni in base all'intensità del segnale fluorescente.

Regolare la potenza del LED per portarlo nell'intervallo da 400 a 1500 unità. Fare clic sul pulsante di avvio per eseguire l'esperimento Thermo Resis. Per l'esperimento è possibile scegliere più di una potenza laser a infrarossi.

Per trovare il gradiente di temperatura ottimale per il particolare sistema, sono necessari dai 10 ai 12 minuti per eseguire una serie di 16 capillari. Raccogli dati da due a tre esecuzioni per lo stesso set di capillari per garantire la riproducibilità delle misurazioni. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi e caricare la cartella del progetto.

Nelle informazioni apparse, selezionare il visualizzatore raccolto in una specifica curva termoretica di potenza del laser IR. C'era la possibilità di aprire contemporaneamente tutte le tracce termoretiche raccolte in varie condizioni e quindi scegliere le curve per l'analisi attivandole e disattivandole. Nella finestra del grafico dei punti di valutazione, selezionare la termoresi o la termoferesi con le linee blu e rosse del salto T.

Definire due regioni delle curve sperimentali che vengono selezionate manualmente per l'analisi dal software. Assicurarsi che le linee blu e rosse siano posizionate correttamente per garantire la massima variazione di Thermo Resis. Per ottenere i punti medi con le deviazioni standard, selezionare Usa media o Distingui esecuzioni per esecuzioni separate.

Per tracciare un adattamento della costante di dissociazione, selezionare Usa media, inserire e fissare il valore di concentrazione della molecola etichettato e adattare la curva. La costante di dissociazione di legame o il valore KD con la sua deviazione standard viene visualizzato in una finestra popup di informazioni separata. Salva i dati di adattamento medio in un file di testo e trasferiscili in Excel.Heck.

2, 9, 3 cellule che esprimono STAT 3G FP sono state utilizzate come sorgente di STAT 3 marcate in fluorescenza. Per il saggio di legame al DNA A, il legame di oligonucleotidi altamente carichi ha portato a cambiamenti significativi nella mobilità di STAT tre. Nel gradiente di temperatura.

Il segnale termoretico è tracciato in funzione della concentrazione di oligonucleotidi. Ogni punto dati rappresenta la media di tre misurazioni. Il software di analisi nano temporale è stato utilizzato per adattare e determinare i valori di KD apparenti.

Le costanti di dissociazione apparenti erano 37,9 più o meno 1,0 micromolari per il legame al motivo gassoso e 23,3 più o meno 0,6 micromolari per il legame con l'oligonucleotide ricco s più 100. Sorprendentemente, le sequenze s plus 100 hanno mostrato un legame leggermente più stretto rispetto al gas. In tre ripetizioni di misurazione, la sostituzione di A con G ha comportato una drastica diminuzione dell'affinità del mutante s più 100.

Mentre il mutante s più 100 due non ha mostrato alcun legame rilevabile, confermando così il legame selettivo della sequenza di STAT tre a s più 100 Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le condizioni ottimali per l'estrazione delle proteine di membrana differiranno per le diverse proteine e di solito richiedono un'ottimizzazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare un'affinità di legame di una proteina con un elegante senza purificare la proteina dalla cellula. Lisato.