Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'affinità di legame tra una proteina e un ligando senza dover purificare la proteina da un lisato cellulare. Questo viene ottenuto esprimendo innanzitutto la proteina d'interesse fusa con GFP in una qualsiasi linea cellulare aderente. Dopo la preparazione del lisato cellulare e delle diluizioni del ligando, si preparano miscele di lisato cellulare e ligando che vengono quindi caricate in capillari.

Successivamente, viene misurata la termoresistenza della proteina fusa con GFP in presenza di concentrazioni variabili di ligando. L'ultimo passaggio consiste nell'analisi dei dati delle misurazioni di termoforesi su microscala o MST. In definitiva, la termoresistenza su microscala viene utilizzata per determinare le affinità di legame delle interazioni tra proteine fuse con GFP e diversi ligandi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metodi esistenti come la titolazione, la calorimetria o la risonanza plasmonica di superficie consiste nel fatto che evita la purificazione delle proteine, semplificando e accelerando in modo significativo la caratterizzazione quantitativa delle interazioni binarie. Questo metodo presenta vantaggi notevoli quando si lavora con proteine difficili da esprimere e purificare, come le proteine di membrana e i fattori di trascrizione. Uno dei maggiori vantaggi della termoforèsi su microscala è che funziona in una varietà di tamponi e tollera la presenza di detergenti e micelle nel sistema. A dimostrare la tecnica sarà Karen Stefka, una biologa del mio laboratorio. Per iniziare, lavare brevemente le cellule con soluzione salina fosfato tamponata fredda di ghiaccio, o PBS, utilizzando 10 millilitri di tampone per ogni fiasca T75.

Mantenere le cellule sul ghiaccio per cinque minuti o fino a quando iniziano a staccarsi dalla fiasca. Raschiare le cellule con lo scraper cellulare per staccarle, se necessario. Ri-sospendere le cellule in 10 millilitri di PBS freddo di ghiaccio e trasferirle in un tubo da centrifuga rotondo da 14 millilitri preraffreddato.

Centrifugare le cellule a 400-600 G e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lisi freddo. Trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 millilitro Einor preraffreddata per l'estrazione delle proteine citosoliche.

Posizionare le cellule sul ghiaccio per minimizzare il surriscaldamento locale e lisare le cellule con tre impulsi di sonificazione della durata di dieci secondi ciascuno, al 30% di ampiezza. Utilizzando una punta pre-raffreddata da due a tre millimetri, mantenere la punta al di sotto della superficie per ridurre al minimo la formazione di schiuma. Omettere questo passaggio quando si utilizza un buffer contenente detergenti e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

Invece, correggere la soluzione di lisato per ottenere una concentrazione fisiologica di sale pari a 100 millimolar di cloruro di sodio, se necessario, partendo da una soluzione madre di cloruro di sodio cinque molar. Infine, raccogliere i lisati mediante centrifugazione a circa 25.000 ×g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Selezionare la sorgente di eccitazione a diodo ad emissione luminosa (LED) con lunghezza d'onda pari a 470 nanometri sullo strumento MST.

Caricare i capillari con l'estratto cellulare diluito due e dieci volte con il buffer MST e posizionarli nello strumento MST. Eseguire l'operazione di ricerca capillari sul software di controllo dello strumento MST. L'intervallo di fluorescenza ottimale nel lisato diluito è compreso tra 400 e 1500 unità di fluorescenza.

Procedere a determinare il range ottimale di concentrazione del ligando come descritto nel protocollo testuale. Posizionare una rack per provette con il numero necessario di provette da centrifuga da 0,5 millilitri a basso legame sul ghiaccio e pipettare 25 microlitri di buffer MST sul fondo di ogni provetta, aggiungendo 25 microlitri della soluzione madre di ligando alla prima provetta ed eseguendo una diluizione seriale a due-fold del ligando utilizzando le restanti provette. Mantenere la rack con i campioni di ligando sul ghiaccio.

Calcolare la diluizione del lisato cellulare per ottenere il livello ottimale della proteina bersaglio fluorescente nelle reazioni di legame. La concentrazione finale di proteina dovrebbe essere vicina alla costante di dissociazione prevista per il legame o inferiore, e deve essere regolata per ottenere il numero necessario di conteggi di fluorescenza. Nella soluzione finale, procedere a diluire il lisato cellulare con MST Buffer.

Posizionare provette da 0,5 millilitro a basso legame nel portaprovette, disposte di fronte alle provette contenenti i campioni di diluizione seriale del ligando. Aggiungere con attenzione 15 microlitri del lisato cellulare sul fondo di ogni provetta. Evitare di toccare le pareti della provetta per prevenire la perdita del campione.

Aggiungere 15 microlitri del campione di ligando con la concentrazione più elevata al tubo corrispondente. Numero uno, con il lisato cellulare. Mescolare bene e cambiare la punta della pipetta.

Ripetere questo passaggio con le restanti provette, tranne l'ultima, che non deve contenere ligando. Aggiungere 15 microlitri di buffer MST all'ultima provetta e mescolare. Riempire circa due terzi della prima capillare con la miscela di legame proveniente dalla provetta numero uno.

Inclinarlo per spostare la soluzione verso il centro e posizionare il capillare sul vassoio dei capillari nella posizione numero uno; ripetere questo passaggio con i restanti capillari. Gli estremi dei capillari possono essere chiusi con cera per esperimenti più lunghi.

Posizionare il vassoio all'interno dello strumento MST e chiudere lo sportello dello strumento. Successivamente, selezionare la sorgente di eccitazione a LED con lunghezza d'onda pari a 470 nanometri. Sullo strumento MST, eseguire il comando di ricerca delle capillari per consentire allo strumento di individuare le posizioni esatte delle capillari e misurare la fluorescenza dei campioni in base all'intensità del segnale fluorescente.

Regolare la potenza del LED in modo da portarla nell'intervallo compreso tra 400 e 1500 unità. Fare clic sul pulsante di avvio per eseguire l'esperimento di Resistenza Termica. Per l'esperimento è possibile scegliere più di una potenza laser a infrarossi.

Per individuare il gradiente di temperatura ottimale per il sistema specifico, sono necessari da 10 a 12 minuti per eseguire un set di 16 capillari. Raccogliere i dati da due a tre ripetizioni dello stesso set di capillari per garantire la riproducibilità delle misurazioni. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi e caricare la cartella del progetto.

Nella finestra visualizzata del visualizzatore di corsie selezionare le curve termoretiche raccolte a una specifica potenza del laser a infrarossi. Era possibile aprire contemporaneamente tutte le tracce termoretiche raccolte in diverse condizioni, quindi scegliere le curve da analizzare attivandole o disattivandole. Nella finestra del grafico dei punti di valutazione, selezionare la termoresi o la termoforesi con le linee blu e rossa del salto di T.

Definire due regioni delle curve sperimentali che vengono selezionate manualmente per l'analisi da parte del software. Assicurarsi che le linee blu e rossa siano posizionate correttamente per ottenere la variazione massima della Resistenza Termica. Per ottenere i punti medi con le deviazioni standard, selezionare l'opzione per utilizzare la media o distinguere le prove per analisi separate.

Per tracciare un'analisi del costante di dissociazione, selezionare l'opzione utilizza media, inserire e fissare il valore della concentrazione della molecola marcata ed eseguire l'adattamento della curva. Il costante di dissociazione di legame, o valore KD, con la sua deviazione standard, appare in una finestra popup separata. Salvare i dati dell'adattamento medio in un file di testo e trasferirli su Excel.Heck.

Cellule 293 che esprimono STAT3-GFP sono state utilizzate come fonte di statina tre fluorescentemente marcata. Per un saggio di legame al DNA, il legame di oligonucleotidi altamente carichi ha determinato significative variazioni nella mobilità della statina tre. Nel gradiente di temperatura.

Il segnale termoretico è riportato in funzione della concentrazione dell'oligonucleotide. Ogni punto dati rappresenta la media di tre misurazioni. Il software di analisi nanotemporale è stato utilizzato per effettuare l'analisi dei dati e determinare i valori apparenti di KD.

Le costanti di dissociazione apparenti erano di 37,9 ± 1,0 micromolare per il legame al motivo gas, e di 23,3 ± 0,6 micromolare per il legame all'oligonucleotide ricco di A/T s plus 100. Sorprendentemente, le sequenze s plus 100 mostravano un legame leggermente più forte rispetto a gas. In tre ripetizioni delle misurazioni, la sostituzione di A con G ha determinato una drastica riduzione dell'affinità nel mutante s plus 100 uno.

Mentre il mutante s più 100 due non ha mostrato alcun legame rilevabile, confermando così il legame selettivo di sequenza di STAT tre a s più 100. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che le condizioni ottimali per l'estrazione delle proteine di membrana varieranno a seconda delle diverse proteine e di solito richiederanno un'ottimizzazione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come determinare l'affinità di legame di una proteina a un elemento senza dover purificare la proteina dal lisato cellulare.