Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification
25 febbraio 2012
Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un metodo noto come purificazione di affinità tandem per isolare i partner di legame delle proteine. Ciao, sono dLAN Bailey della sezione di Virologia dell'Imperial College di Londra. Nel nostro laboratorio, lavoriamo sulle interazioni tra virus e ospite per diversi membri della famiglia dei virus.
L'identificazione delle proteine che interagiscono con altre proteine cellulari o virali è un ottimo punto di partenza per studiare l'interazione tra il virus e il suo ospite durante l'infezione. In questo video, spiegherò un approccio che utilizziamo nel nostro laboratorio, il tandem e la purificazione elettronica o tap tagging. Il tag Tap utilizzato in questo studio è un tag N terminale costituito da due unità di proteina G e un peptide legante lo streptococco.
Questi sono separati da una sequenza di scissione della proteasi TEV che consente l'eluizione specifica della proteina esca. In questo esempio, murino, EIF quattro E si trova all'estremità C di questo costrutto di fusione. Il protocollo di tap tagging è una procedura in sei fasi.
Dopo la trasfezione e la generazione di linee cellulari, le cellule sono indotte ad esprimere la proteina tag abate prima di essere messe in un tampone di lisi lieve. Due fasi di purificazione per affinità e due soluzioni specifiche vengono utilizzate per purificare l'esca e qualsiasi potenziale partner interagente per generare linee cellulari. Le cellule HEC 2 93 devono essere trasfettate con il vettore di espressione P met four.
Le cellule proteiche esca marcate con tap vengono quindi selezionate con un centinaio di microgrammi per mil di igromicina B. Poiché il plasmide viene mantenuto episo, non è necessario isolare cloni specifici. 10 flass confluenti di cellule vengono indotte dal trattamento con 10 micromolari di cloruro di cadio per 16 ore prima di essere raschiate via in terreno. Le celle sospese vengono quindi trasferite in provette da 15 M e le celle pellettate mediante centrifugazione.
Queste celle vengono poi lavate tre volte con PBS ghiacciato prima di essere infine pellettate. Le celle di lisi cellulare della seconda fase si trovano in cinque mil di tampone di lisi a freddo mediante pipettaggio ripetuto prima di essere lasciate in ghiaccio per cinque minuti. Per garantire una lisi efficiente, le cellule vengono quindi siringate attraverso un ago smussato di calibro stretto e congelate.
Lo stato risultante viene assegnato in provette da 1,5 mil e le celle unli e i detriti vengono rimossi mediante centrifugazione. Da notare che la dimensione del pellet è notevolmente ridotta dopo questa fase di centrifugazione. I surnatanti del lisato vengono quindi combinati in un tubo Falcon da 15 mil e fatti passare attraverso un filtro da 0,45 micrometri per rimuovere eventuali detriti aggiuntivi.
Per la successiva analisi devono essere prelevate aliquote da 50 microlitri di questo lisato. Questo campione viene definito campione uno. Terzo passo, legarsi al coniglio IgG Aeros.
In questa fase del protocollo, i marcatori della proteina G sono immunoprecipitati dalle IgG aros di coniglio. Per allocare le perline, rimuovere l'estremità della punta della scimmia. Questo aiuta a evitare di danneggiare le perline.
Risospendere delicatamente la soluzione di aro IgG di coniglio agitando il flacone prima di rimuovere gli aros in un tubo da 15 mil. Lavare gli aros tre volte in tampone di lisi refrigerato utilizzando la centrifugazione a bassa velocità per chiarire le perle ad ogni passaggio. Le perle di IgG di coniglio pellettate dovrebbero essere visibili dopo la centrifugazione.
Dopo ogni passaggio, rimuovere con cura il tampone senza disturbare le perline. Al termine del lavaggio finale, aggiungere il lisato filtrato e chiarificato alle perle confezionate e incubare per tre ore o durante la notte. Ha preferito a quattro gradi C utilizzando un miscelatore rotante.
Dopo l'immunoprecipitazione, centrifugare le perle di agros e rimuovere il surnatante per la successiva analisi. Se necessario, è possibile utilizzare una punta di costruzione fine per rimuovere il liquido rimanente da questo tubo. Questo surnatante è il campione di scissione della proteasi TEV a due fasi quattro.
In questa fase, l'esca viene scissa dai tag G della proteina. Questo passaggio consente la scissione specifica della proteina dell'esca in modo efficace e una fase di eluizione dalle IgG dei conigli all'immunoprecipitazione. Preparare la miscela di scissione TEV e aggiungerla alle perle di aros usando la punta di scimmia con l'estremità rimossa, trasferire questa miscela in una provetta da microcentrifuga siliconata e capovolgere per mescolare gli aros in sospensione prima dell'incubazione notturna a quattro gradi C, rimuovere un alico di questa reazione di scissione TEV per l'analisi.
Questo è il terzo esempio. L'incubazione notturna sul miscelatore rotante dovrebbe consentire alla reazione TEV di progredire fino quasi al completamento. Passaggio cinque, legare per immobilizzare le perline di adin strette.
In questa fase, l'esca Cleve e tutti i potenziali partner di legame vengono purificati per affinità dalla soluzione. In primo luogo, centrifugare la reazione di scissione TEV contenente le perle di aros IgG del coniglio. Per pellettare l'aros, rimuovere un OTT del surnatante chiarificato per l'analisi.
Questo è il quarto esempio. Rimuovi con cura tutto il surnatante rimanente, che contiene le proteine dell'esca, in un tubo nuovo. Ancora una volta, usa bene.
Costruisci punte in peppe per rimuovere tutto il possibile surnatante. Conservare le perle di IgG di coniglio per le successive analisi. Questo è il quinto esempio.
Per evitare danni alle perline di strep adin, rimuovere l'estremità da una punta di animale domestico. Risospendere delicatamente le perle e rimuovere un alico in un tubo siliconato. Lavare lo streptococco in perle con tampone S, chiarendo mediante centrifugazione a bassa velocità.
Dopo ogni lavaggio. Dopo ogni lavaggio, rimuovere con cura il tampone. Le perle di adin strept sono molto piccole e possono essere facilmente spostate anche quando si utilizza bene.
Costruisci punte per animali domestici. Dopo che le perle di adin strept sono state lavate. Aggiungere il surnatante della reazione di scissione TEV a queste perle e incubare la reazione per tre ore o per una notte a quattro gradi C, utilizzando un miscelatore rotante.
Dopo l'incubazione la centrifuga ha forzato le perle di acqua e rimosso il sorso. Questo è il sesto esempio. Da notare.
La proteina Beit è ora associata alle perle rimanenti nel tubo. Lava le perle di streptavidina contenenti la proteina dell'esca con il tampone di lisi. Per rimuovere eventuali proteine contaminanti aggiuntive, rimuovere la soluzione di lavaggio rimanente dalle perle e lasciarle in ghiaccio.
Fase sei, eluizione della biotina. In questa fase, la biotina viene aggiunta alle perle di streptavidina. L'interazione tra la biotina e le perle di streptavidina sposta l'esca, che torna in soluzione.
Aggiungere la soluzione di biotina direttamente alle perline e capovolgere per mescolare. Incubare la reazione a quattro gradi C per tre ore o durante la notte utilizzando una centrifuga miscelatrice rotante, la miscela aerodinamica di biotina e raccogliere accuratamente la miscela in una provetta nuova. Questo è il tuo EIT finale indicato come campione sette.
Le restanti perle di havein strept sono il campione otto. A causa della sua bassa concentrazione proteica, questo eluato finale deve essere concentrato prima dell'analisi. Ciò si ottiene utilizzando bassi pesi molecolari, tagliando le colonne di rotazione, riducendo il volume mediante centrifugazione monitorando regolarmente il processo.
Questo campione concentrato può essere diviso e analizzato su gel per pagina SDS mediante kumasi e colorazione d'argento. Se i campioni devono essere analizzati mediante spettrometria di massa, si consiglia di utilizzare gel commerciali prefabbricati. Le singole bande possono quindi essere estratte e le proteine identificate mediante spettrometria di massa.
In questo caso, l'esca era murina, EIF per la proteina E. Il vantaggio del sistema tap è che si ha la capacità di esprimere la proteina di interesse in una particolare linea cellulare e, a seconda della linea cellulare che interessa, si ha anche la possibilità di esprimere la proteina a livelli relativamente bassi. Decidi di farlo e tutte le modifiche post-traduzionali e la localizzazione vengono mantenute, quindi puoi spesso purificare il complesso nativo.
Panoramica
La purificazione dell'affinità in tandem è una tecnica potente per identificare i partner di legame delle proteine. Questo metodo è stato applicato al fattore di inizio della traduzione eIF4E per co-precipitare i fattori della cellula ospite coinvolti nell'inizio della traduzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Studi sulle interazioni proteiche
- Biologia cellulare
Sfondo
- La purificazione in affinità in tandem (TAP) è un metodo utilizzato per isolare complessi proteici.
- Il marcatore TAP è costituito dalla proteina G e da un peptide legante la streptavidina.
- Questa tecnica consente l'eluzione specifica delle proteine esca.
- Comprendere le interazioni proteiche è fondamentale per lo studio della dinamica virus-ospite.
Scopo dello studio
- Isolare e identificare le proteine che interagiscono con il fattore di inizio della traduzione eIF4E.
- Studiare l'interazione tra proteine virali e proteine dell'ospite durante l'infezione.
- Dimostrare l'adattabilità del metodo TAP a diverse proteine.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione di cellule HEC 293 con un vettore di espressione marcato con TAP.
- Lisi cellulare e purificazione utilizzando perle di IgG da coniglio e streptavidina.
- Clivaggio con proteasi TEV per l'eluzione specifica delle proteine bersaglio.
- Multipli passaggi di lavaggio e centrifugazione per garantire la purezza dei campioni.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di eIF4E e dei suoi partner interagenti.
- Dimostrazione dell'efficienza del metodo TAP nell'identificazione di complessi proteici.
- Identificazione di potenziali fattori ospite coinvolti nell'inizio della traduzione.
- Convalida dell'adattabilità del metodo ad altre proteine.
Conclusioni
- La purificazione a doppia affinità è un approccio efficace per lo studio delle interazioni proteiche.
- Il metodo può essere applicato a diverse proteine cellulari e virali.
- Comprendere queste interazioni fornisce informazioni sui meccanismi di patogenesi virale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'identificazione delle interazioni proteina-proteina rappresenta un passo fondamentale nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico nei programmi di scoperta nell'industria biotecnologica e farmaceutica. La purificazione in affinità in tandem (TAP) consente l'isolamento di complessi proteici nativi in condizioni quasi fisiologiche, favorendo un'associazione affidabile con l'obiettivo e la mappatura dei percorsi biologici. Questo approccio riduce i falsi positivi nei test iniziali e migliora l'affidabilità predittiva nelle campagne di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'interrogazione di ipotesi terapeutiche isolando i partner di legame diretti e indiretti di proteine bersaglio come eIF4E.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli identificando membri noti del complesso come eIF4G, 4EBP-1, eIF4A e la proteina legante poli-A.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio distinguendo gli interagenti specifici dal rumore di fondo mediante controlli con solo il marcatore TAP.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, catturando complessi endogeni con modifiche post-traduzionali preservate.
- Valore operativo: Consente la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso passaggi definiti di eluizione (proteasi TEV e biotina) e protocolli di lavaggio rigorosi.
- Scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma in diverse linee cellulari mediante espressione plasmidica episomale, evitando la generazione di linee clonali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la rilevanza per le malattie studiando eIF4E nell'avvio della traduzione dipendente dal cap, un percorso alterato nel cancro e nelle infezioni virali.
- Allineamento Preclinico: Collega le scoperte a una riduzione meccanicistica del rischio identificando interattori secondari che chiariscono il contesto del percorso.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di proseguire o meno chiarendo il meccanismo del bersaglio e l'integrità del complesso prima dell'ottimizzazione del capostipite.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
TAP si inserisce nel percorso di scoperta che va dai saggi di interazione con il bersaglio alla validazione preclinica, in particolare per bersagli in cui l'integrità del complesso nativo è fondamentale per la funzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione di vie metaboliche isolando complessi associati a eIF4E in condizioni di espressione inducibile.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio fornendo risultati quantitativi tramite bande identificabili mediante spettrometria di massa dopo separazione tramite SDS-PAGE.
- Analisi: Permette l’analisi comparativa tra condizioni sperimentali grazie a passaggi di eluizione specifici che riducono il legame non specifico.
- Ricerca traslazionale: Si collega all’allineamento di biomarcatori identificando fattori dell’avvio della traduzione coinvolti nella segnalazione oncogenica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per diverse proteine bersaglio grazie alla progettazione modulare del marcatore TAP e al sistema di espressione episomale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli target, riduzione dell'ambiguità meccanicistica e preservazione di complessi nativi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra linee cellulari e proteine bersaglio.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla caratterizzazione precoce dei complessi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su dati di interattoma validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in tecniche di clonazione molecolare, trasfezione transitoria e purificazione per affinità.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture per centrifugazione, agitatori rotanti, inibitori delle proteasi e spettrometria di massa.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione dei marcatori, i protocolli di induzione e la stringenza dei lavaggi.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse proteine bersaglio, livelli di espressione e localizzazione subcellulare.
- Comprende limitazioni pratiche come il possibile interferenza del marcatore e la necessità di ottimizzare i tempi di induzione e le condizioni di lisi.
