La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare le interazioni tra piccole molecole di aptameri del DNA, inclusa la mappatura del sito di legame, utilizzando la termoforesi su microscala. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui parametri di legame di base delle interazioni molecolari. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che è indipendente dalle dimensioni del partner di interazione, consentendo di ottenere dati di controllo della qualità delle interazioni difficili tra aptameri e piccole molecole.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra piccole molecole di aptameri, può essere applicato anche ad altre interazioni molecolari come il bersaglio del farmaco o le interazioni antigene/anticorpo. Per iniziare la procedura, preparare una soluzione madre da 100 micromolari dell'aptamero DNA DH25.42 marcato con Cy5 in acqua distillata. Quindi, diluire la soluzione madre di aptamero a 200 nanomolari con tampone legante.

Incubare la soluzione di lavoro dell'aptamero per due minuti a 90 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente con ghiaccio. Successivamente, etichettare e predisporre provette per microcentrifuga da 200 microlitri a basso legame per una diluizione seriale in 16 fasi del ligando da testare.

Pipettare 20 microlitri di una soluzione madre da 10 millimolari di ligando e tampone legante nella provetta 1. Pipettare 10 microlitri di tampone legante nelle provette da 2 a 16. Quindi trasferire 10 microlitri di legante dalla provetta 1 alla provetta 2 e mescolare bene con la pipetta.

Trasferire 10 microlitri della miscela diluita nella provetta 3 e mescolare bene. Continuare la diluizione seriale in questo modo, correggendo gli effetti della diluizione del tampone se necessario, e scartare i 10 microlitri in eccesso dal tubo 16 una volta terminato. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di lavoro dell'aptamero a ciascuna diluizione e mescolare bene con la pipetta.

Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare ogni miscela in un capillare standard pulito, assicurandosi di toccare solo il capillare alle estremità. Posizionare i capillari nel portavassoi in ordine decrescente di concentrazione.

Avviare il dispositivo MST e aprire il software di controllo dello strumento. Abilita il controllo manuale della temperatura e imposta la temperatura dello strumento a 25 gradi Celsius. Una volta che lo strumento ha raggiunto la temperatura corretta, inserire il vassoio capillare.

Impostare il canale LED su rosso per l'aptamero etichettato Cy5. Impostare la potenza del LED per ottenere un segnale di fluorescenza di 500 unità. Quindi eseguire una scansione capillare per ottenere le posizioni capillari e verificare la qualità del campione.

Se i picchi risultanti sono a forma di U o appiattiti, preparare nuovi campioni in capillari codificati per ridurre al minimo gli effetti di incollaggio. Nel software dello strumento MST, inserire la concentrazione del ligando e il tipo di diluizione per il primo capillare. Fare clic e trascinare per inserire le concentrazioni e le diluizioni per i capillari rimanenti.

Inserire la concentrazione dell'aptamero nella miscela finale. Assicurarsi che il metodo dell'esperimento sia impostato per rilevare la fluorescenza per cinque secondi, registrare l'MST per 30 secondi e quindi registrare la fluorescenza per cinque secondi dopo aver spento il laser. Imposta la potenza del laser al 20%Imposta il percorso del file e salva il file dell'esperimento.

Quindi avviare la misurazione MST. Ottenere almeno tre misurazioni in questo modo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi MST e caricare il file dell'esperimento.

Selezionare MST per il tipo di analisi. Il software di analisi consente di confrontare ripetizioni tecniche in cui tutte le misure erano dello stesso insieme di capillari. All'analisi possono essere aggiunte anche ripetizioni biologiche da un diverso set di capillari.

Fare clic sul pulsante delle informazioni sotto la prima misurazione. Ispezionare le tracce di MST per verificare la presenza di dossi o picchi che indichino effetti di aggregazione o precipitazione. Quindi ispezionare la scansione capillare e la sovrapposizione della forma capillare per verificare la presenza di picchi appiattiti o a forma di U che indicano effetti di adesione o assorbimento.

Poiché gli aggregati e gli effetti di assorbimento sono rapidamente rilevabili nell'MST, il metodo consente un'ottimizzazione rapida e rapida della configurazione tecnica per garantire una qualità ottimale dei dati. Verificare la presenza di effetti di estinzione o potenziamento della fluorescenza ligando-dipendenti nella scansione capillare e nella fluorescenza iniziale. Ispezionare la variazione di fluorescenza nel tempo per rilevare eventuali segni di sbiancamento o miglioramento della foto.

Una volta verificata la qualità dei dati, passare alla modalità dose-risposta. Selezionare l'impostazione dell'analisi avanzata nella strategia di valutazione MST T Jump. Quindi selezionare il modello di collina per l'adattamento della curva per calcolare automaticamente i parametri di vincolo.

Nel menu dei risultati del confronto selezionare un tipo di normalizzazione. Esporta i dati normalizzati come foglio di calcolo o file PDF. In questa procedura, l'MST è stato utilizzato per studiare le interazioni di legame di un aptamero di DNA a singolo filamento con una selezione di ligandi di piccole molecole.

Le curve MST sono state adattate all'equazione di hill e sono stati determinati i valori di concentrazione efficace semimassimale. In cinque misurazioni biologiche indipendenti dell'aptamero con ATP, l'interazione dell'aptamero ATP ha mostrato un'ampiezza di legame negativa da 6 a 13 unità e un valore medio di EC50 di circa 52,3 micromolari. I dati per ciascun ligando sono stati normalizzati alla frazione di molecole legate e quindi confrontati.

I valori EC50 per ADP, AMP e SAM rispetto all'ATP suggeriscono che il numero di gruppi fosfato ha al massimo un'influenza minore sul comportamento di legame dell'aptamero. Anche la rimozione del gruppo ossidrassale robo C2 ha mostrato solo un effetto minore sull'affinità di legame dell'aptamero. L'aptamero non si è legato in assenza di un gruppo di accoppiamento o se il gruppo di accoppiamento è stato cambiato in guanina.

L'aptamero si è legato alla sola adenina, indicando ulteriormente che il gruppo adenina è il principale sito di legame per l'aptamero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire informazioni essenziali sui parametri di rilegatura di base in pochi minuti o ore se eseguita correttamente.