Name: La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri la caratterizzazione delle interazioni aptamero-DNA con piccole molecole utilizzando la microscopia a termoforesi. Questo metodo consente di mappare i siti di legame e determinare parametri di affinità in soluzione.

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1. Preparazione del lavoro Aptamero l&#39;Archivio <ol><li> Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento 18) in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron. </li><li> Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween20). </li><li> Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparazione del Ligand diluizione Series <ol><li> Per ogni ligando (adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenina, guanosintrifosfato (GTP), citosintrifosfato (CTP), deossiadenosina trifosfato (dATP), e S-adenosilmetionina (SAM) ; 10 mM magazzino ciascuno), preparare un diluti di serie 16-stepsu in 200 provette micro microlitri. NOTA: centrifugazione delle scorte ligando per 5 minuti a 14000 g può aiutare a rimuovere gli aggregati. Basso volume, si raccomanda provette vincolante basso per evitare l&#39;assorbimento delle molecole alle pareti del tubo. </li><li> Iniziare con una concentrazione massima di almeno 50 volte superiore all&#39;affinità stimata e ridurre la concentrazione del ligando del 50% in ogni fase di diluizione. NOTA: Lo strumento concentrazione finder implementato nel software di controllo simula dati vincolanti e aiuta a trovare l&#39;intervallo di concentrazione giusta per la serie di diluizioni. </li><li> Riempire 20 ml di legante magazzino (10 mm) in tubo 1. Aggiungere 10 ml di tampone di legame aptameri in tubi di reazione micro 2-16. </li><li> Trasferimento 10 ml di tubo da 1 a tubo 2 e miscelare correttamente pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire 10 microlitri al tubo successivo e ripetere questa diluizione per i rimanenti tubi. </li><li> Eliminare l&#39;eccesso di 10 ml dall&#39;ultima provetta. Evitare qualsiasi Beffetti diluitivi Uffer. Il tampone nella provetta 1 e in tubi 2-16 deve essere identica. </li></ol> 3. Preparazione della miscela di reazione finale <ol><li> Preparare le singole reazioni di legame con un volume di 20 microlitri (10 ml di soluzione di lavoro aptamer + 10 ml di rispettiva diluizione ligando) per minimizzare errori di pipettamento. Un volume di soli 4 microlitri è suf fi ciente per il riempimento capillare. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro 200 nM aptameri a 10 microlitri di ogni diluizione ligando e miscelare correttamente pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente e riempire i campioni nei capillari standard, immergendo i capillari nel campione. tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari per alcune interazioni; Tuttavia, 5 min è adeguato per la maggior parte. Selezionare i capillari solo sui lati, NON sulla parte centrale, dove viene effettuata la misurazione ottica. </li><li> Posizionare i capillari si aVassoio capillare e ed avviare il dispositivo MST. </li></ol> 4. Avvio del dispositivo MST NOTA: Il dispositivo fornisce due pacchetti software preinstallati, l &#39; &quot;software per la messa a punto tecnica delle condizioni sperimentali e il controllo&#39; &#39;analisi&quot;&#39; software per l&#39;interpretazione dei dati prodotti. <ol><li> Prima di effettuare il vassoio capillare nel dispositivo MST, avviare il software di controllo e regolare la temperatura complessiva desiderata selezionando &#39;&#39; attivare il controllo manuale della temperatura &quot;del &#39;&#39; controllo della temperatura&quot; menu a discesa. Regolare la temperatura a 25 ° C in questo modo. NOTA: Gli strumenti MST possono essere a temperatura controllati attraverso 22 a 45 ° C. </li><li> Attendere che la temperatura per raggiungere il livello previsto e quindi inserire il vassoio capillare nel dispositivo MST. </li><li> Impostare il canale LED per &#39;&#39; rosso &quot;per le tinture Cy5 e regolare la potenza del LED per ottenere un fl uorescence segnale 300 a 1000 unità di fluorescenza del dispositivo MST con un sensore standard. potere LED 25% è utilizzato in questo studio. NOTA: 6.000 a 18.000 unità di fluorescenza sono raccomandati per il MST con un sensore ad alta sensibilità. </li></ol> 5. capillare Scan <ol><li> Effettuare una scansione capillare per controllare diversi aspetti di qualità del campione, scegliendo la posizione capillare sul software &quot;di controllo&quot; e cliccando su &quot;avviare la scansione cap&quot; prima della misurazione MST. </li><li> Ispezionare la scansione capillare per la fluorescenza valorizzazione / tempra e gli effetti che attaccano (a forma di U o appiattita picchi) nel software. NOTA: Maggiori dettagli sul rilevamento e la gestione della fluorescenza e gli effetti che attaccano possono essere trovati nella discussione. </li></ol> 6. Misura MST NOTA: Prima di iniziare la misura MST, assicurarsi di escludere attaccare effetti, valorizzazione / effetti tempra, oerrori di pipettamento, e garantire che la scansione capillare indica che il segnale fluorescenza è suf fi ciente. Per maggiori dettagli, vedere la discussione. <ol><li> Assegnare le concentrazioni di ligando della serie di diluizione alla rispettiva posizione capillare nel software &#39;&#39; di controllo &quot;consideri la fase di diluizione della miscelazione del aptamer e ligando. (1: 1). </li><li> Inserisci la più alta concentrazione di ligando (5 mm) per capillare # 1, selezionare il tipo di diluizione corretto (qui, 1: 1), cliccare sulla massima concentrazione, e utilizzare la funzione di trascinamento per assegnare automaticamente le restanti concentrazioni in capillari # 2 16. La concentrazione più bassa è 152,6 nM. </li><li> Inserire la concentrazione del aptamer uorescenti fl (qui, 100 nM) nella rispettiva sezione del software di controllo. </li><li> Utilizzare le impostazioni predefinite, che rilevano la fluorescenza fl per 5 secondi, registrare il MST per 30 secondi, e registrare la fluorescenza per altri 5 secondi dopo l&#39;inattivazione del t laser<html> o monitorare la diffusione posteriore delle molecole. </li><li> Regolare la potenza del laser al 20% nella rispettiva sezione del software di controllo. NOTA: per ricevere il miglior rapporto segnale-rumore e per evitare effetti non specifici, si consiglia una potenza laser di 20-40%. In casi specifici, una potenza del laser più elevato può essere richiesto per ottenere una buona separazione delle molecole non legati e legati. </li><li> Salvare l&#39;esperimento dopo aver selezionato la cartella di destinazione e avviare la misura MST premendo il pulsante &#39;&#39; misura di inizio MST &quot;. NOTA: Il file .ntp verrà generato nella cartella di destinazione. Usando questa configurazione, una misurazione dura 10-15 minuti. </li><li> Ripetere la procedura sperimentale almeno due volte per una determinazione più accurata del valore EC 50. NOTA: Al fine di testare la riproducibilità tecnica, gli stessi capillari possono essere acquisiti più volte (ripete tecnici). </li></ol> 7. Analisi dei dati MST nt &quot;&gt; NOTA: Il software di analisi permette l&#39;analisi dei dati sul fl y durante la misurazione Il software di analisi traccia le tracce del tempo MST e dei cambiamenti nel normalizzato fluorescenza (F norma) contro la concentrazione del ligando 37.. <ol><li> Avviare il software di analisi MST (Analisi MO.Affinity) e caricare il file .ntp dalla cartella di destinazione. Selezionare &quot;MST&quot; come tipo di analisi nel menu di selezione dei dati. NOTA: Nel caso di effetti di fluorescenza ligando-dipendente, la fluorescenza iniziale può essere scelto per l&#39;analisi. </li><li> Aggiungere la rispettiva corsa (s) tecnico o biologico per una nuova analisi con il drag-and-drop o premendo il tasto &quot;+&quot; al di sotto del rispettivo periodo sperimentale. </li><li> Premere il pulsante di informazioni al di sotto del rispettivo periodo di sperimentazione per ottenere informazioni sulle proprietà di questo esperimento, tracce MST, scansione capillare, forma capillare, fluorescenza iniziale e tasso di sbiancamento. NOTA: I dati grezzi possono alcosì da ispezionare in fasi successive dell&#39;analisi. </li><li> Visivamente le tracce MST per l&#39;aggregazione e la precipitazione effetti, visibile come urti e picchi. NOTA: Per ulteriori informazioni sul rilevamento e la gestione degli effetti di aggregazione, leggere la discussione. </li><li> Ispezionare visivamente la scansione capillare e la capillare forma di sovrapposizione per gli effetti di adsorbimento, visibile come picchi o appiattite a forma di U. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la fluorescenza iniziale per gli effetti di fluorescenza. Ispezionare visivamente il tasso sbiancante per photobleaching effetti. </li><li> Passare alla modalità dose-risposta e modificare l&#39;impostazione di analisi in modalità &quot;esperto&quot; premendo il tasto corrispondente. Selezionare &quot;T-Jump&quot;, come la strategia di valutazione MST. </li><li> Selezionare il modello di &quot;Hill&quot; per la curva fi tting. saranno automaticamente calcolati i parametri vincolanti. Normalizzare i dati scegliendo il rispettivo tipo di normalizzazione nel menu &quot;confrontare i risultati&quot;. esportare ili dati sia come un file .xls o .pdf. Nota: La tabella sotto il grafico legame riassume i parametri vincolanti calcolati. </li></ol>

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</ol>

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Controlli di qualità: Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l&#39;ottimizzazione graduale della configurazione tecni...

L&#39;interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti 1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati. Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni 9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di 11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) 13-15, eluizione isocratica 16, equilibrio filtrazione 17,18, in linea di sondaggio 19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia 20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) 22,23, singola molecola fluorescenza di imaging 24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) 26 siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l&#39;immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti. MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole 27-29, nonché altri obiettivi come le proteine 30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato &quot;termoforesi,&quot; dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola 34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr<html> effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base 2,7,34,36,37. Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani 6 o di un 3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S T): g &quot;/&gt; c rappresenta caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale. Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L&#39;interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F norma, che viene calcolato come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F calda e fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K D o valori di EC 50) possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C). Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l&#39;interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell&#39;ATP.

<table><tbody><tr>tampone <td></td><td></td><td>legante aptamero</td><td>20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20</td></tr><tr><td>Aptamero ATP marcato in fluorescenza</td><td>IDT, Lovanio, Belgio</td><td></td><td>sequenza: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germania&nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM di soluzioni stock conservate a - 20 gradi C</td></tr><tr><td>Monolite NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania</td><td>MO-G008</td><td>Canale blu/rosso Dispositivo MST con rivelatore standard, Monolith NT115 pico è un dispositivo MST con rivelatore ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillari Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf PCR</td><td>Eppendorf, Germania</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo Monolith. 2.1.33, preinstallato su il dispositivo</td><td>NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la mappatura del sito di legame di un aptamero su atp utilizzando microscale termoforesi

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

La caratterizzazione delle interazioni molecolari in termini di parametri di legame di base come l'affinità di legame, la stechiometria e la termodinamica è un passo essenziale nella scienza di base e applicata. La termoforesi su microscala (MST) è un metodo biofisico sensibile per ottenere queste importanti informazioni. Basandosi su un effetto fisico chiamato termoforesi, che descrive il movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura, questa tecnologia consente la determinazione rapida e precisa dei parametri di legame in soluzione e consente la libera scelta delle condizioni del tampone (dal tampone ai lisati/sieri). La MST utilizza il fatto che una molecola non legata mostra un movimento termoforetico diverso rispetto a una molecola che è in complesso con un partner di legame. Il movimento termoforetico è alterato nel momento dell'interazione molecolare a causa di cambiamenti nelle dimensioni, nella carica e nell'idratazione del guscio. Confrontando i profili di movimento di diversi rapporti molecolari dei due partner di legame, è possibile determinare informazioni quantitative come l'affinità di legame (da pM a mM). Anche le interazioni difficili tra molecole di piccole dimensioni, come aptameri e piccoli composti, possono essere studiate mediante MST. Utilizzando l'interazione del modello ben studiata tra l'aptamero di DNA DH25.42 e l'ATP, questo manoscritto fornisce un protocollo per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola. Questo studio dimostra che l'MST è altamente sensibile e permette la mappatura del sito di legame dell'aptamero del DNA da 7,9 kDa all'adenina dell'ATP.

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 18 ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l&#39;interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori 38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull&#39;estremità 5&#39; . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da ATP in v...

MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.

La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è caratterizzare le interazioni tra aptameri di DNA e piccole molecole, inclusa la mappatura del sito di legame, mediante termoforeti microscalari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sui parametri di legame di base delle interazioni molecolari. Il principale vantaggio di questa tecnologia è la sua indipendenza rispetto alle dimensioni del partner d'interazione, consentendo di ottenere dati di controllo qualità su interazioni difficili tra aptameri e piccole molecole.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra aptameri e piccole molecole, può essere applicato anche ad altre interazioni molecolari, come quelle tra farmaco e bersaglio o tra antigene e anticorpo. Per iniziare la procedura, preparare una soluzione madre di aptameri DNA DH25.42 marcato con Cy5 a 100 micromolare in acqua distillata. Successivamente, diluire la soluzione madre di aptamero a 200 nanomolare con il buffer di legame.Incubare la soluzione lavorativa dell'aptamero per due minuti a 90 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente su ghiaccio. Successivamente, etichettare e predisporre delle provette microcentrifuga da 200 microlitri a basso legame per una diluizione seriale in 16 passaggi del ligando da testare.Aggiungere con una pipetta 20 microlitri di una soluzione madre di ligando a 10 millimolari e tampone di legame nel tubo 1. Aggiungere con una pipetta 10 microlitri di tampone di legame nei tubi da 2 a 16. Successivamente, trasferire 10 microlitri della soluzione madre di ligando dal tubo 1 al tubo 2 e mescolare accuratamente con la pipetta.Trasferire 10 microlitri della miscela diluita nel tubo 3 e mescolare accuratamente. Proseguire il diluizione seriale in questo modo, correggendo gli effetti della diluizione del tampone se necessario, e scartare l'eccesso di 10 microlitri dal tubo 16 al termine. Aggiungere 10 microlitri della soluzione operativa dell'aptamero a ciascuna diluizione e mescolare accuratamente con la pipetta.Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare ciascuna miscela in una capillare standard pulita, avendo cura di toccare la capillare solo alle estremità. Posizionare le capillari nel portacampioni in ordine decrescente di concentrazione.Avviare il dispositivo MST e aprire il software di controllo dello strumento. Abilitare il controllo manuale della temperatura e impostare la temperatura dello strumento a 25 gradi Celsius. Una volta che lo strumento ha raggiunto la temperatura corretta, inserire il vassoio dei capillari.Impostare il canale LED su rosso per l'aptamero marcato con Cy5. Regolare la potenza del LED per ottenere un segnale di fluorescenza di 500 unità. Quindi eseguire una scansione capillare per ottenere le posizioni dei capillari e verificare la qualità del campione.Se i picchi risultanti hanno una forma a U o sono appiattiti, preparare nuovi campioni in capillari codificati per ridurre al minimo gli effetti di adesione. Nel software dello strumento MST, inserire la concentrazione del ligando e il tipo di diluizione per il primo capillare. Fare clic e trascinare per compilare le concentrazioni e le diluizioni dei capillari rimanenti.Inserire la concentrazione dell'aptamero nella miscela finale. Assicurarsi che il metodo dell'esperimento sia impostato per rilevare la fluorescenza per cinque secondi, registrare la MST per 30 secondi e quindi registrare nuovamente la fluorescenza per cinque secondi dopo aver spento il laser. Impostare la potenza del laser al 20%. Impostare il percorso del file e salvare il file dell'esperimento.Quindi avviare la misurazione MST. Eseguire almeno tre misurazioni in questo modo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi MST e caricare il file dell'esperimento.Selezionare MST come tipo di analisi. Il software di analisi consente di confrontare ripetizioni tecniche in cui tutte le misurazioni sono state effettuate sullo stesso insieme di capillari. È inoltre possibile aggiungere all'analisi ripetizioni biologiche provenienti da un diverso insieme di capillari.Fare clic sul pulsante informazioni sotto la prima misurazione. Esaminare i tracciati MST alla ricerca di irregolarità o picchi che indichino effetti di aggregazione o precipitazione. Successivamente, esaminare la scansione della capillare e la sovrapposizione della forma della capillare alla ricerca di picchi appiattiti o a forma di U che indichino effetti di adesione o assorbimento.Poiché gli effetti di aggregazione e di assorbimento sono rapidamente rilevabili nella MST, il metodo consente un'ottimizzazione rapida e veloce dell'allestimento tecnico per garantire una qualità ottimale dei dati. Verificare la presenza di effetti di soppressione o potenziamento della fluorescenza dipendenti dal ligando nell'analisi capillare e nella fluorescenza iniziale. Esaminare la variazione della fluorescenza nel tempo alla ricerca di segni di fotodegradazione o potenziamento fotoindotto.Dopo aver verificato la qualità dei dati, passare alla modalità risposta alla dose. Selezionare l'impostazione di analisi avanzata nella strategia di valutazione T Jump MST. Quindi selezionare il modello di Hill per l'adattamento della curva al fine di calcolare automaticamente i parametri di legame.Nel menu di confronto dei risultati, selezionare un tipo di normalizzazione. Esportare i dati normalizzati come foglio di calcolo o file PDF. In questa procedura, la MST è stata utilizzata per studiare le interazioni di legame di un'aptamer a filamento singolo di DNA con una serie di ligandi a piccole molecole.Le curve MST sono state adattate con l'equazione di Hill e sono stati determinati i valori di concentrazione efficace massima al 50%. In cinque misurazioni ripetute indipendenti di tipo biologico dell'aptamero con ATP, l'interazione tra aptamero e ATP ha mostrato un'ampiezza di legame negativa compresa tra 6 e 13 unità e un valore medio di EC50 di circa 52,3 micromolare. I dati per ciascun ligando sono stati normalizzati alla frazione di molecole legate e successivamente confrontati.I valori di EC50 per ADP, AMP e SAM rispetto ad ATP suggeriscono che il numero di gruppi fosfato ha al massimo un'influenza minore sul comportamento di legame dell'aptamero. La rimozione del gruppo idrossile in posizione C2 del robo ha mostrato anch'essa solo un effetto minore sull'affinità di legame dell'aptamero. L'aptamero non si è legato in assenza di un gruppo di appaiamento o se il gruppo di appaiamento è stato sostituito con guanina.L'aptamero si è legato all'adenina da sola, indicando ulteriormente che il gruppo adeninico è il sito principale di legame per l'aptamero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire informazioni essenziali sui parametri fondamentali di legame in pochi minuti o ore, se eseguita correttamente.

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Protocolli di SELEX comprendono vari cicli di selezione, ognuno dei quali richiedono la rigenerazione di leganti legato, che a loro volta richiedono sequenze primer fisso fiancheggianti le regioni biblioteca casuale. Queste sequenze di innesco fisso può interferire con il processo di selezione (falsi positivi e negativi). Qui vi presentiamo un primer senza protocollo.

Primer-Free Selezione aptamero utilizzando una libreria di DNA casuale

Questo video dimostra la termoforesi su microscala per studiare l'interazione proteina-lipide. Il test rileva l'interazione tra le molecole quantificando il movimento termoforetico delle proteine marcate con fluorescenza in risposta a un gradiente di temperatura. La molecola fluorescente viene miscelata con diverse concentrazioni di molecole lipidiche non fluorescenti e la miscela di molecole nella soluzione viene caricata nei capillari. Un gradiente di temperatura viene applicato ai campioni...

Termoforesi su microscala per studiare le interazioni proteina-lipidi in soluzione

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Viene fornito un protocollo per selezionare aptameri a commutazione di struttura per bersagli di piccole molecole basati su un metodo di selezione di biglie magnetiche di rigore sintonizzabile. Gli aptameri selezionati con proprietà di commutazione della struttura sono utili per i saggi che richiedono un cambiamento conformazionale per segnalare la presenza di un bersaglio, come il saggio di nanoparticelle d'oro descritto.

Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l'applicazione dell'aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.

Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

La termoforesi su microscala ottiene rapidamente costanti di legame a basso costo del materiale. La termoforesi su microscala etichettata o senza etichetta è disponibile in commercio; tuttavia, la termoforesi senza etichette non è in grado di gestire la diversità delle misurazioni di interazione che possono essere eseguite utilizzando etichette fluorescenti. Forniamo un protocollo per le misure di termoforesi etichettate.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

Il presente protocollo descrive l'uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l'associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l'interpretazione dei dati risultanti.

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

Un passo necessario nello sviluppo dell'aptamero antitumorale è testare il suo legame con il bersaglio. Dimostriamo un saggio basato sulla citometria a flusso per studiare questo legame, sottolineando l'importanza di includere un aptamero di controllo negativo e cellule tumorali positive o negative per quella particolare proteina.

Un saggio di legame proteico della superficie cellulare basato sulla citometria a flusso per valutare la selettività e la specificità di un aptamero antitumorale

Il presente protocollo dimostra l'uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.

Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

Questo protocollo delinea la progettazione di sonde di ibridazione split che utilizzano l'aptamero fluorescente DAP-10-42 come reporter di segnale e la loro applicazione per il rilevamento dell'acido nucleico e la differenziazione tra bersagli con sostituzioni a singolo nucleotide.

Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

Scopri la caratterizzazione delle interazioni aptamero-DNA con piccole molecole utilizzando la microscopia a termoforesi. Questo metodo consente di mappare i siti di legame e determinare parametri di affinità in soluzione.

La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

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