La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi
7 gennaio 2017
MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare le interazioni tra piccole molecole di aptameri del DNA, inclusa la mappatura del sito di legame, utilizzando la termoforesi su microscala. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui parametri di legame di base delle interazioni molecolari. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che è indipendente dalle dimensioni del partner di interazione, consentendo di ottenere dati di controllo della qualità delle interazioni difficili tra aptameri e piccole molecole.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra piccole molecole di aptameri, può essere applicato anche ad altre interazioni molecolari come il bersaglio del farmaco o le interazioni antigene/anticorpo. Per iniziare la procedura, preparare una soluzione madre da 100 micromolari dell'aptamero DNA DH25.42 marcato con Cy5 in acqua distillata. Quindi, diluire la soluzione madre di aptamero a 200 nanomolari con tampone legante.
Incubare la soluzione di lavoro dell'aptamero per due minuti a 90 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente con ghiaccio. Successivamente, etichettare e predisporre provette per microcentrifuga da 200 microlitri a basso legame per una diluizione seriale in 16 fasi del ligando da testare.
Pipettare 20 microlitri di una soluzione madre da 10 millimolari di ligando e tampone legante nella provetta 1. Pipettare 10 microlitri di tampone legante nelle provette da 2 a 16. Quindi trasferire 10 microlitri di legante dalla provetta 1 alla provetta 2 e mescolare bene con la pipetta.
Trasferire 10 microlitri della miscela diluita nella provetta 3 e mescolare bene. Continuare la diluizione seriale in questo modo, correggendo gli effetti della diluizione del tampone se necessario, e scartare i 10 microlitri in eccesso dal tubo 16 una volta terminato. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di lavoro dell'aptamero a ciascuna diluizione e mescolare bene con la pipetta.
Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare ogni miscela in un capillare standard pulito, assicurandosi di toccare solo il capillare alle estremità. Posizionare i capillari nel portavassoi in ordine decrescente di concentrazione.
Avviare il dispositivo MST e aprire il software di controllo dello strumento. Abilita il controllo manuale della temperatura e imposta la temperatura dello strumento a 25 gradi Celsius. Una volta che lo strumento ha raggiunto la temperatura corretta, inserire il vassoio capillare.
Impostare il canale LED su rosso per l'aptamero etichettato Cy5. Impostare la potenza del LED per ottenere un segnale di fluorescenza di 500 unità. Quindi eseguire una scansione capillare per ottenere le posizioni capillari e verificare la qualità del campione.
Se i picchi risultanti sono a forma di U o appiattiti, preparare nuovi campioni in capillari codificati per ridurre al minimo gli effetti di incollaggio. Nel software dello strumento MST, inserire la concentrazione del ligando e il tipo di diluizione per il primo capillare. Fare clic e trascinare per inserire le concentrazioni e le diluizioni per i capillari rimanenti.
Inserire la concentrazione dell'aptamero nella miscela finale. Assicurarsi che il metodo dell'esperimento sia impostato per rilevare la fluorescenza per cinque secondi, registrare l'MST per 30 secondi e quindi registrare la fluorescenza per cinque secondi dopo aver spento il laser. Imposta la potenza del laser al 20%Imposta il percorso del file e salva il file dell'esperimento.
Quindi avviare la misurazione MST. Ottenere almeno tre misurazioni in questo modo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi MST e caricare il file dell'esperimento.
Selezionare MST per il tipo di analisi. Il software di analisi consente di confrontare ripetizioni tecniche in cui tutte le misure erano dello stesso insieme di capillari. All'analisi possono essere aggiunte anche ripetizioni biologiche da un diverso set di capillari.
Fare clic sul pulsante delle informazioni sotto la prima misurazione. Ispezionare le tracce di MST per verificare la presenza di dossi o picchi che indichino effetti di aggregazione o precipitazione. Quindi ispezionare la scansione capillare e la sovrapposizione della forma capillare per verificare la presenza di picchi appiattiti o a forma di U che indicano effetti di adesione o assorbimento.
Poiché gli aggregati e gli effetti di assorbimento sono rapidamente rilevabili nell'MST, il metodo consente un'ottimizzazione rapida e rapida della configurazione tecnica per garantire una qualità ottimale dei dati. Verificare la presenza di effetti di estinzione o potenziamento della fluorescenza ligando-dipendenti nella scansione capillare e nella fluorescenza iniziale. Ispezionare la variazione di fluorescenza nel tempo per rilevare eventuali segni di sbiancamento o miglioramento della foto.
Una volta verificata la qualità dei dati, passare alla modalità dose-risposta. Selezionare l'impostazione dell'analisi avanzata nella strategia di valutazione MST T Jump. Quindi selezionare il modello di collina per l'adattamento della curva per calcolare automaticamente i parametri di vincolo.
Nel menu dei risultati del confronto selezionare un tipo di normalizzazione. Esporta i dati normalizzati come foglio di calcolo o file PDF. In questa procedura, l'MST è stato utilizzato per studiare le interazioni di legame di un aptamero di DNA a singolo filamento con una selezione di ligandi di piccole molecole.
Le curve MST sono state adattate all'equazione di hill e sono stati determinati i valori di concentrazione efficace semimassimale. In cinque misurazioni biologiche indipendenti dell'aptamero con ATP, l'interazione dell'aptamero ATP ha mostrato un'ampiezza di legame negativa da 6 a 13 unità e un valore medio di EC50 di circa 52,3 micromolari. I dati per ciascun ligando sono stati normalizzati alla frazione di molecole legate e quindi confrontati.
I valori EC50 per ADP, AMP e SAM rispetto all'ATP suggeriscono che il numero di gruppi fosfato ha al massimo un'influenza minore sul comportamento di legame dell'aptamero. Anche la rimozione del gruppo ossidrassale robo C2 ha mostrato solo un effetto minore sull'affinità di legame dell'aptamero. L'aptamero non si è legato in assenza di un gruppo di accoppiamento o se il gruppo di accoppiamento è stato cambiato in guanina.
L'aptamero si è legato alla sola adenina, indicando ulteriormente che il gruppo adenina è il principale sito di legame per l'aptamero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire informazioni essenziali sui parametri di rilegatura di base in pochi minuti o ore se eseguita correttamente.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la caratterizzazione delle interazioni tra aptamer di DNA e piccole molecole mediante termoforesi su microscala (MST). L'MST consente la determinazione quantitativa di parametri di legame come affinità, stechiometria e termodinamica in soluzione, indipendentemente dalle dimensioni dei partner interagenti. Lo studio dimostra l'applicazione dell'MST per mappare il sito di legame di un aptamer di DNA all'ATP e a molecole correlate.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biofisica
- Biologia molecolare
- Biochimica analitica
Background
- Comprendere le interazioni molecolari è fondamentale sia per la ricerca di base che per quella applicata.
- La MST è una tecnica sensibile che misura il movimento molecolare in gradienti di temperatura per valutare gli eventi di legame.
- I metodi tradizionali possono essere limitati dalla dimensione o dalla natura dei partner di legame; la MST supera questi limiti.
- Gli aptameri di DNA sono oligonucleotidi corti e a singolo filamento in grado di legare molecole piccole con elevata specificità.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo per la caratterizzazione delle interazioni tra aptameri e piccole molecole mediante MST.
- Dimostrare la sensibilità e la versatilità della MST nello studio di interazioni molecolari complesse.
- Mappare il sito di legame dell'aptamero DNA DH25.42 all'ATP e a composti correlati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'aptamero DNA marcato con Cy5 e delle soluzioni del ligando.
- Diluizione seriale dei ligandi e mescolamento con la soluzione operativa dell'aptamero.
- Incubazione e caricamento dei campioni in capillari per l'analisi MST.
- Misurazione del movimento termoforetico mediante strumentazione e software per MST.
- Analisi dei dati, inclusa l'interpolazione delle curve con l'equazione di Hill e la normalizzazione dei dati di legame.
Risultati principali
- MST ha quantificato con successo l'affinità di legame tra l'aptamero di DNA e l'ATP, ottenendo una concentrazione efficace media (EC50) di circa 52,3 μM.
- L'ampiezza del legame è variata da 6 a 13 unità tra i replicati biologici.
- L'analisi comparativa con ADP, AMP e SAM ha indicato che il numero di gruppi fosfato ha un effetto minimo sul legame.
- L'aptamero si lega specificamente all'adenina, confermando l'adenina come sito principale di legame.
Conclusioni
- MST è un metodo robusto e sensibile per caratterizzare le interazioni tra aptameri e piccole molecole.
- La tecnica consente un'ottimizzazione rapida e un controllo di qualità delle condizioni sperimentali.
- MST può essere applicata in modo ampio per studiare diversi tipi di interazioni molecolari oltre gli aptameri.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La mappatura quantitativa dei siti di legame tra aptameri e piccole molecole mediante termoforesi su microscala (MST) risponde a un'esigenza fondamentale di validazione precisa del bersaglio e riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. La sensibilità della MST e l'indipendenza dalle dimensioni molecolari consentono una caratterizzazione robusta di interazioni difficili, sostenendo una previsione affidabile in punti critici della pipeline di sviluppo. Questa capacità migliora l'affidabilità dei dati sulle interazioni molecolari per lo screening successivo e l'identificazione di composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la quantificazione diretta dell'affinità e della specificità delle interazioni tra aptameri e bersagli.
- Permette la riduzione dei rischi meccanicistici mappando i siti di legame precisi e chiarificando il riconoscimento molecolare.
- Semplifica la validazione funzionale del bersaglio per entità molecolari nuove o difficili.
- Fornisce un feedback rapido sui parametri di legame per informare le decisioni di triage del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce output quantitativi validati per la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi.
- Prepara sistemi biologici robusti per flussi di lavoro affidabili di screening di composti.
- Consente scalabilità e riutilizzo della piattaforma supportando diverse condizioni di tampone e campione.
- Garantisce dati di alta qualità per la valutazione dei composti mediante rapida rilevazione di artefatti di aggregazione o assorbimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sulle interazioni molecolari a sistemi pertinenti alle malattie quando vengono utilizzati aptameri come strumenti traslazionali.
- Mantiene la continuità dalla scoperta fino alla validazione preclinica fornendo metriche di legame costanti.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio grazie a dati quantitativi e riproducibili sulle interazioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La mappatura del sito di legame basata sulla MST si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino allo sviluppo del saggio e alla ricerca preclinica, consentendo un flusso di dati continuo e un processo decisionale senza interruzioni.
- Biologia della scoperta: Fornisce la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso la quantificazione delle interazioni aptamero-ligando.
- Screening: Offre risultati di saggio riproducibili e quantitativi pronti per analisi successive.
- Analisi: Genera misurazioni di EC50 e dell'ampiezza del legame per confrontare condizioni molecolari e ottimizzare i protocolli.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica quando gli aptameri vengono utilizzati nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce la MST come piattaforma riutilizzabile per diversi studi sulle interazioni molecolari al di là di un singolo progetto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per l'analisi delle interazioni molecolari.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati di legame di alta qualità fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione dei candidati in base a metriche solide sulle interazioni, adeguandosi al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specialistiche nell'allestimento di saggi biofisici e nell'interpretazione dei dati.
- Necessita dell'accesso a strumentazione MST e a software analitici compatibili.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni e il controllo di qualità dei dati.
- Potrebbe richiedere l'adattamento dei protocolli per diversi sistemi di aptameri o ligandi.
- È fondamentale identificare e mitigare rapidamente eventuali artefatti dovuti all'aggregazione o all'assorbimento del campione per ottenere risultati ottimali.
