I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come acquisire immagini super risolutive di alta qualità con STORM. Questo viene realizzato innanzitutto preparando un campione di prova fluorescentemente marcato. Il secondo passaggio consiste nel preparare il buffer di commutazione e quindi riempire la camera di imaging con il buffer.

Successivamente, i dati grezzi vengono acquisiti mediante un microscopio storm. L'ultimo passaggio consiste nella ricostruzione di immagini a super risoluzione a partire dai dati grezzi, utilizzando un software di elaborazione rainstorm. Infine, i campioni test vengono impiegati per mostrare come acquisire dati grezzi di alta qualità, che possono quindi essere elaborati per generare immagini a super risoluzione storm in cellule, con risoluzioni comprese tra 30 e 50 nanometri, corrispondenti a un miglioramento di risoluzione da cinque a dieci volte rispetto alle tecniche tradizionali di microscopia a fluorescenza, tra cui turf e confocale.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontrano difficoltà perché non si rendono conto dell'importanza di raccogliere molti legami sparsi di alta qualità. Questo risulta molto più semplice utilizzando il colorante Alexa 6 4 7 nel tampone di commutazione corretto. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è essenziale poiché l'acquisizione di dati grezzi di alta qualità è fondamentale per produrre immagini con risoluzione SPR.

Le sequenze video grezze di questa tecnica appaiono completamente diverse rispetto a qualsiasi altra forma di microscopia a fluorescenza. Per iniziare la procedura di rivestimento del vetro con destrina fluorescente, aggiungere 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% in ciascun pozzetto di una piastra coprivetro a otto camere e incubare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere la soluzione di polilisina con una pipetta per assicurarsi che non rimanga alcun liquido diluito.

0,25 microlitri di una soluzione madre di destrina a due milligrammi per millilitro. Alexa 6 47 in 25 microlitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione a 20 microgrammi per millilitro, al fine di creare un rivestimento denso di destrina. Soluzione di Alexa 6 47.

Diluire 20 microlitri della soluzione da 20 microgrammi per millilitro fino a un volume totale di 200 microlitri con acqua deionizzata. Per una soluzione a densità media, diluire 2 microlitri in 200 microlitri di acqua deionizzata. Per una soluzione a bassa densità, diluire 0,2 microlitri.

In 200 microlitri di acqua deionizzata, aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita di dextrina Alexis X 47 in ogni pozzetto e incubare per 10 minuti. È possibile utilizzare tempi di incubazione più lunghi, che potrebbero determinare un rivestimento di dextrina più denso. Infine, rimuovere le soluzioni Dexter Xis X 47 e lavare con acqua per tre volte.

Per preparare filamenti di actina fluorescenti su vetrino, aggiungere prima 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% in ciascun pozzetto di una camera a otto alveoli. Coprire il vetrino e incubare per 10 minuti. Rimuovere quindi con una pipetta per assicurarsi che non rimanga alcun liquido.

Aggiungere in ogni camera 90 microlitri di tampone generale per l'actina, precedentemente ricostituito secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di soluzione di filamenti di actina preformati a 10 micromolari e un microlitro di foid e Alexa 647 ed eseguire delicatamente alcune aspirazioni e dispersioni con la pipetta per mescolare; incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare le microsfere fluorescenti come marcatori fiduciali. Diluire un microlitro di microsfere Tepec in 200 microlitri di PBS ed omogeneizzare. Aggiungere le microsfere diluite nella camera di imaging e attendere 15 minuti.

Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS prima dell'acquisizione delle immagini. Utilizzare cellule coltivate fino a una confluenza di circa l'80%. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare con PBS. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di formaldeide al 4% per 10 minuti.

Rimuovere il formaldeide e lavare tre volte con PBS. Non permettere che le cellule si secchino e utilizzare sempre soluzioni tampone PBS. Per evitare lo stress ipotonico, aggiungere due microlitri di una soluzione madre di EGF Alexa 647 a 50 microgrammi per millilitro a 200 microlitri di soluzione di BSA allo 0,1%, quindi aggiungere questa soluzione alle cellule HeLa.

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS. Aggiungere una soluzione bloccante contenente BSA allo 0,1% e lasciare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo di ciò, rimuovere la soluzione di blocco e lavare ulteriormente tre volte con PBS prima dell'acquisizione delle immagini. Immediatamente prima dell'acquisizione, preparare il buffer di commutazione mescolando insieme le soluzioni stock dell'enzima glucosio e dell'agente riducente in un rapporto di 50 microlitri, 400 microlitri e 100 microlitri, quindi aggiungere PBS per portare il volume finale a un millilitro. Rimuovere il PBS dalla camera di acquisizione e quindi riempire fino all'orlo con il buffer di commutazione.

Posizionare con attenzione un coprioggetto sulla parte superiore della camera, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria e che l'intera camera sia coperta. Se si notano bolle, aggiungere ulteriore tampone o PBS. In caso contrario, le prestazioni del tampone possono diminuire.

La raccolta di dati di collegamento ad alta qualità e sparsi è essenziale per il successo di questa procedura; assicurarsi quindi che i microscopi siano correttamente messi a fuoco e che vengano utilizzate le impostazioni di acquisizione appropriate. Individuare una struttura fluorescente di interesse da immaginiare. Selezionare l'angolo desiderato di illuminazione.

In questo caso, si consiglia un angolo di inclinazione elevato o un angolo a prato poiché ciò migliora il rapporto segnale-rumore riducendo al minimo la luce fuori fuoco, il che è particolarmente vantaggioso per i campioni cellulari. Acquisire un'immagine di riferimento della struttura con risoluzione limitata prima dell'acquisizione mediante tecnica STORM. Aumentare il laser di eccitazione a una potenza elevata corrispondente a circa due kilowatt per centimetro quadrato, acquisendo con impostazioni della fotocamera di un'esposizione di 10 millisecondi e un tempo di ciclo di circa 50 hertz o fotogrammi al secondo.

Una volta che il pattern di fluorescenza diventa un modello intermittente debole, acquisire 10.000 fotogrammi. Per iniziare questa ricostruzione, aprire il file M RAINSTORM all'interno di MATLAB ed eseguirlo nella finestra rainstorm.

Selezionare il file immagine da analizzare utilizzando il pulsante di navigazione. Deve trattarsi di un file TIF. Modificare la larghezza in pixel per farla corrispondere ai dati grezzi del sistema microscopico utilizzato per acquisire i dati.

Lasciare gli altri valori ai valori predefiniti. Premere il pulsante elabora immagini e attendere finché non appare un'immagine preliminare. La durata dell'elaborazione dipenderà dalle dimensioni del file, dalle specifiche del computer e dal numero di collegamenti candidati all'interno dei dati grezzi.

Per generare un'immagine aggiornata a super risoluzione, premere il pulsante apri revisore e apparirà una seconda finestra. Premere il pulsante regola contrasto per modificare la visualizzazione dell'immagine secondo le proprie preferenze. In alcuni casi in cui l'immagine è molto scura, il valore massimo dovrebbe essere ridotto.

Utilizzare la finestra del revisore per generare metriche utili sulla qualità dell'immagine e per affinare ulteriormente l'immagine a super risoluzione. Lasciare i primi tre parametri di controllo qualità ai valori predefiniti di 5.000, 0,1 e da 0,8 a 3,5 rispettivamente. Aggiornare il valore dei conteggi per fotone.

Modificare la soglia di precisione di localizzazione per bilanciare l'ottimizzazione della localizzazione media e della precisione rispetto al numero di localizzazioni. Nell'immagine finale, si raccomandano valori compresi tra 30 e 50 nanometri, a seconda della qualità dei dati e del campione. Il fattore di scala predefinito per la ricostruzione è cinque, il che genererà pixel a super risoluzione di 32 nanometri, assumendo che il pixel nelle immagini originali sia di 160 nanometri.

Se le immagini grezze hanno una dimensione del pixel di 100 nanometri, questo produrrà immagini a super risoluzione con pixel di 20 nanometri. Aumentare il fattore di scala per ottenere pixel a super risoluzione più piccoli. Nell'immagine finale, premere il pulsante run reviewer per generare un'immagine aggiornata a super risoluzione.

Premere il pulsante "visualizza istogrammi" per mostrare le metriche della qualità dell'immagine. Infine, premere il pulsante "salva immagine" nel revisore per salvare tutti questi dati. Iniziare questa procedura generando un'immagine nello stesso modo illustrato in precedenza.

Premere il pulsante di tracciamento della casella nel revisore e fare clic tenendo premuto per trascinare una casella sul marcatore fiduciale nell'immagine esaminata. Attendere finché non appare una nuova immagine, che mostrerà le posizioni racchiuse in box. Salvare questa immagine se desiderato, qualora l'oggetto di interesse sia un marcatore fiduciale.

Come nel caso illustrato, eseguire la correzione della deriva facendo clic sul pulsante imposta ancoraggio seguito dal pulsante sottrai deriva. Infine, fare clic nuovamente su esegui revisore per generare una nuova immagine storm. Un rivestimento di destrina riuscito dovrebbe produrre un monostrato fluorescente e i dati tipici della destrina sono mostrati in questa figura.

Le immagini a limite di diffrazione mostrano diverse concentrazioni di destrina prima dell'acquisizione dell'immagine storm. Le ricostruzioni a super risoluzione hanno una dimensione del pixel di 25 nanometri. Sono state raccolte 10.000 immagini con una dimensione del fotogramma di 128 per 128 pixel e vengono mostrati singoli fotogrammi provenienti da tale sequenza.

A concentrazione elevata di destrina. Il monostrato fluorescente dovrebbe apparire relativamente uniforme, come illustrato in queste immagini e in questo segmento video. A concentrazioni più basse, i lampeggi appariranno più radi e in fuoco.

Non essendoci un fondo evidente durante questa fase di acquisizione delle immagini a illuminazione laser costante, il numero di lampeggiamenti diminuirà nel tempo, come illustrato dal confronto tra il fotogramma 2000 e il fotogramma 8.000 nel campione ad alta densità. La differenza principale tra le immagini a super risoluzione delle concentrazioni elevate, medie e basse di destrina è il numero decrescente di localizzazioni. Questo grafico mostra la media di tre sequenze di 10.000 fotogrammi per ciascuna concentrazione di destrina, in cui le barre di errore indicano la deviazione standard.

Tuttavia, questa relazione proporzionale tra la concentrazione delle molecole fluorescenti, il numero di lampeggiamenti nei dati grezzi e il numero di localizzazioni non è una semplice relazione lineare, come illustrato in questo grafico del numero di localizzazioni accettate per fotogramma. Utilizzando una media mobile di 100 fotogrammi a densità molto elevate di molecole, il software non è in grado di localizzare con successo le molecole durante l'acquisizione di qualsiasi campione. Un problema comune può essere la presenza di un alone fluorescente brillante ma sfocato diffuso nell'immagine, causato dalla diffusione del fluorocromo attraverso il mezzo.

Queste molecole fluorescenti staccate possono essere prevenute o rimosse aumentando il numero di passaggi di lavaggio con PBS prima di aggiungere il buffer di commutazione oppure aggiungendo del buffer di commutazione fresco alla camera. L'elaborazione e il confronto dei dati provenienti da ciascuna sequenza di immagini producono immagini a super risoluzione molto diverse. I pannelli C e D sono costruzioni di immagini a super risoluzione corrispondenti ai dati raccolti nei pannelli A e B rispettivamente. Questo grafico riporta il numero di localizzazioni accettate per fotogramma utilizzando una media mobile su 100 fotogrammi.

La linea rossa corrisponde alla sequenza di tempesta A e C, dove è presente uno sfondo elevato; la linea blu corrisponde a B e D, dove lo sfondo è basso. Il numero accettato di localizzazioni per le immagini corrispondenti ai dati con sfondo alto e basso è mostrato nel secondo grafico. Queste tre immagini a limite di diffrazione mostrano dati tipici di filamenti di actina preformati adesi alla superficie del vetro prima dell'aggiunta del buffer di commutazione e dell'acquisizione mediante storm.

È possibile osservare filamenti di lunghezze variabili. I filamenti molto luminosi sono spesso costituiti da più filamenti intrecciati tra loro. La selezione di singoli filamenti relativamente luminosi, piuttosto che di aree intrecciate, consente di ottenere immagini di migliore qualità durante la fase di acquisizione.

Dovrebbero essere visibili lampi luminosi a fuoco lungo tutta la lunghezza del filamento. Durante la fase di acquisizione e successivamente nei dati elaborati, dovrebbe essere osservato un lampeggio sparso. Dovrebbe essere presente un filamento sottile e continuo nelle localizzazioni per ogni fotogramma, che mostrano un declino graduale.

Tipicamente, la larghezza a metà altezza massima o FWHM di un filamento viene fornita come stima empirica della risoluzione, tracciando una linea retta attraverso una regione ingrandita del filamento di actina utilizzando la funzione profilo di tracciato in ImageJ e successivamente eseguendo un adattamento gaussiano. L'FWHM viene calcolata pari a 43,2 nanometri. Può verificarsi un problema di mala localizzazione quando numerosi filamenti di actina si ramificano o si incrociano, elaborando sottoinsiemi di fotogrammi e confrontando i primi e gli ultimi 5.000 fotogrammi.

Un'immagine diversa viene prodotta nell'immagine a super risoluzione utilizzando i primi 5.000 fotogrammi. Nel centro dell'immagine si osservano molte localizzazioni. Tuttavia, quando si utilizzano gli ultimi 5.000 fotogrammi, risultano evidenti ben poche di queste localizzazioni e rimangono soltanto i filamenti, seppur in forma leggermente continua a causa del ridotto numero di localizzazioni presenti nell'immagine.

Se si sospetta una densità di lampeggio eccessivamente elevata, il confronto tra le immagini e i dati di localizzazione per fotogramma può suggerire fortemente che questo problema si verifichi durante il primo insieme di fotogrammi. Il numero medio di localizzazioni per fotogramma è superiore a 10, rispetto all'ultimo insieme di fotogrammi in cui è di circa quattro. Un altro problema potenziale nella microscopia STORM è la deriva, che si verifica quando il campione si muove rispetto all'obiettivo durante la fase di acquisizione dei dati. Sebbene sia molto difficile da rilevare durante la fase di acquisizione dell'immagine, la deriva può essere osservata nelle immagini a super risoluzione di strutture note, come i filamenti di actina.

Il primo segnale che potrebbe indicare una deriva laterale è che la struttura risulta più grande del previsto. Ad esempio, una larghezza a metà altezza relativamente grande rispetto ai dati del limite di precisione ottenuti da rainstorm, in questo caso 90 nanometri rispetto a 67 nanometri. Un metodo migliore per rilevare la deriva consiste nel confrontare le localizzazioni in funzione del tempo, ovvero verificare se le localizzazioni nei fotogrammi successivi risultano spostate rispetto a quelle nei fotogrammi iniziali.

Questo può essere chiaramente osservato nel caso dei filamenti di actina quando vengono visualizzati con un codice colore. Utilizzando la funzione di tracciamento delle caselle in rainstorm, come mostrato nei pannelli B e C, le localizzazioni sono visualizzate con un colore corrispondente al numero di fotogramma in cui sono state acquisite. Ad esempio, le localizzazioni ottenute all'inizio della sequenza di acquisizione sono in blu, mentre quelle ottenute alla fine della sequenza di acquisizione sono in rosso.

I colori spostati indicano che si è verificato un drift, al fine di misurarlo e correggerlo. Per misurare il drift, possono essere utilizzate microsfere fluorescenti con diametro di 100 nanometri come marcatori fiduciali; i numeri da uno a quattro mostrano microsfere ritagliate e ingrandite singolarmente. In un esempio in cui si verifica un drift relativamente grave di circa 100 nanometri nell'arco di tre minuti e 10 secondi durante la fase di acquisizione, la stessa funzione di tracciamento della finestra può essere utilizzata per codificare a colori e confermare l'occorrenza del drift, poiché tutte e quattro le microsfere in questo esempio mostrano uno spostamento pressoché identico. È possibile selezionarne una, in questo caso la microsfera due, da utilizzare come riferimento e sottrarre il drift dalle altre microsfere.

Un confronto con il pannello E mostra che la deriva laterale è stata corretta. Infine, cellule HeLa marcate con fattore di crescita epidermico possono essere utilizzate per fornire un esempio realistico di risoluzione dell'immagine. Nel caso delle cellule, il pannello A mostra un'immagine limitata dalla diffrazione di una parte di una cellula HeLa focalizzata sulla superficie basale della cellula, in cui i riquadri gialli indicano le regioni di interesse ingrandite mostrate nei pannelli B e C, a differenza delle regioni di interesse ingrandite poco definite presenti nell'immagine limitata dalla diffrazione.

Le immagini a super risoluzione dovrebbero mostrare una miscela di aggregati e occasionali singoli pixel isolati. Gli aggregati avranno un diametro di circa 100 nanometri e probabilmente corrisponderanno a fossette e vescicole in formazione. Il percorso attraverso cui l'EGF è principalmente downregolato e le localizzazioni di endocitosi per ogni fotogramma dei dati del Pannello D sono presentati nel grafico G. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare alcuni semplici campioni di prova, acquisire dati e ricostruire immagini ad alta risoluzione mediante tecnica STORM.

Questi metodi aiuteranno a evitare alcune trappole comuni di adattamento come il drift e contribuiranno a ottimizzare il vostro storm. Vedere gli esperimenti sulla risoluzione.