Name: I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Impara a preparare campioni di prova fluorescenti per ottimizzare la microscopia STORM e acquisire immagini super-risoluzione a 30-50 nm. Questo metodo migliora significativamente la qualità dei dati grezzi per ricerche avanzate in biologia cellulare.

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Riconosciamo il finanziamento del programma di Chimica e Metrologia biologica di Ufficio nazionale di misurazione del Regno Unito. Ringraziamo Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi e Eric Rees per consigli tecnici e suggerimenti. Ringraziamo Miklos Erdelyi, Eric Rees e Max Ryadnov per gli utili commenti e discussioni su questo manoscritto.

Nota: Durante questo protocollo, consigli e suggerimenti sono trovati seguendo alcuni passaggi. La notazione &quot;* 1&quot; indica che nota 1 è rilevante per questo specifico passo, e così via. 1. Fluorescente Dextran Rivestimento di vetro <ol><li> Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina soluzione 0,01% a ciascun pozzetto di una coprioggetti 8-camera e incubare per 10 min. Rimuovere con una pipetta per garantire che non è liquido rimanente. </li><li> Ricostituire destrano-Alexa 647 * 1 secondo le istruzioni del produttore per creare una soluzione madre 2 mg / ml. Da questo, diluire 0,25 ml in 25 ml di acqua deionizzata per creare una soluzione di 20 mg / ml. </li><li> Per creare un rivestimento ad alta densità di destrano-Alexa 647 soluzione diluita 20 microlitri della soluzione 20 mg / ml in un totale di 200 ml di acqua deionizzata. Per una soluzione a media densità diluire 2 ml in 200 ml di acqua deionizzata (1:10.000 diluizione della soluzione stock originale). Per un bassosoluzione densità diluire 0,2 ml in 200 ml di acqua deionizzata (1:100.000 diluizione dal magazzino soluzione originale). </li><li> Aggiungere 200 ml di diluito destrano-Alexa 647 soluzioni per ogni pozzetto e incubare per 10 min. Tempi di incubazione più lunghi possono essere usati che possono provocare un rivestimento denso destrano. Rimuovere e lavare con H 2 O tre volte * 2 </li></ol> Nota 1: Altri coniugati destrano-dye possono essere utilizzati. Destrano coniugato può anche essere coniugato a coloranti se combinazioni desiderati non sono disponibili in commercio. Nota 2: Le stesse camere di destrano possono essere reimaged per un periodo di settimane sebbene l&#39;uniformità della fluorescenza può diminuire. Si raccomanda di conservazione a 4 ° C in assenza di buffer. 2. Fluorescente actina filamenti in vetro <ol><li> Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina soluzione 0,01% in ciascun pozzetto della camera e incubare per 10 min * 3. Remuoversi con una pipetta per assicurarsi che nessun liquido rimanente. </li><li> Aggiungere 90 ml di tampone actina generale (ricostituita secondo le istruzioni del produttore) per ciascuna camera. Aggiungere 10 ml di 10 mM preformati soluzione filamento di actina e 1 ml phalloidin-Alexa 647 (0,2 unità, una volta disciolti in 1,5 ml di metanolo come da istruzioni del produttore) e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Incubare per 30 min * 4. </li></ol> Nota 3: aumentare il volume della soluzione filamento all&#39;interno dei risultati da camera in meno vincolanti filamenti di vetro rivestita di poli-L-lisina. Nota 4: tempi di incubazione fino a 48 ore a 4 ° C sono stati testati con buoni risultati. Qualità dell&#39;immagine si deteriora actina filamento volta una camera è stata esposta al buffer di commutazione in modo che non è consigliabile utilizzare lo stesso campione per più di un giorno. 3. Microsfere perline fluorescenti come Fiducial Marker <ol><li&gt; Diluire 1 ml di TetraSpeck perline in 200 microlitri di PBS e mescolare. </li><li> Aggiungere le perline diluiti in una camera di imaging e attendere 15 min * 5. Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte con PBS prima di imaging. </li></ol> Nota 5 - il tempo di diluizione e di incubazione può essere aggiustata per ottenere diverse densità di perline. Questo protocollo si traduce tipicamente tra 3-10 perle per 20,5 micron x 20,5 micron campo di vista. 4. Epidermal Growth Factor colorazione cellulare <ol><li> Cellule HeLa in coltura camere di imaging a circa il 80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e soluzione di penicillina-streptomicina 1%. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare con PBS. Poi aggiungere 500 ml di soluzione di formaldeide al 4% (4 ml soluzione di formaldeide al 10%, 1 ml di PBS 10X, 5 ml di acqua) per 10 min. Rimuovere la formaldeide e lavare 3 volte con PBS. Non permettere alle cellule di rimanere dry e utilizzare sempre PBS tamponata soluzioni per evitare lo stress ipotonico. </li></ol> ATTENZIONE - formaldeide è estremamente tossico. Assicurarsi che i guanti adeguati, occhiali di protezione e camici vengono indossati. Controllare le linee guida locali per lo smaltimento di formaldeide. <ol start="3"><li> Ricostituire EGF-Alexa 647 secondo le istruzioni del produttore per creare una soluzione stock 50 mg / ml. Aggiungere 2 ml di questa soluzione a 200 ml di soluzione di BSA allo 0,1% (in PBS). Rimuovere la PBS dalle cellule, aggiungere la soluzione EGF e incubare per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere una soluzione di bloccaggio di 0,1% di BSA (in PBS) per 15 min. Rimuovi questo e lavare altre 3 volte con PBS prima di imaging. </li></ol> 5. Commutazione Buffer Preparazione <ol><li> Effettuare una soluzione di riserva enzima (A) con 10 ml di catalasi (20 mg / ml), 20 ml di 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfina cloridrato (4 mm), 2,5 ml di glicerina (50%), 125 mldi 1 M KCl (25 mM), 100 ml di 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg di glucosio ossidasi (1 mg / ml) e superiore fino a 5 ml di volume con diH20. Questo è sufficiente per rendere 100 x aliquote di 50 microlitri, che possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzate per massimo 1 anno. </li><li> ) Fare una soluzione di riserva di glucosio (B) con 4 g di glucosio (100 mg / ml), 4 ml di glicerina (10%) e 36 ml diH20. Questo è sufficiente per rendere 100 x 400 microlitri aliquote, che possono essere conservati a - 20 ° C ed utilizzate per massimo 1 anno. </li><li> Fare un agente riducente soluzione madre (C) con 113,6 mg di MEA-HCl (1M) e 1 ml di diH 2 a 0. Utilizzare fresco o fare 10 x 100 microlitri aliquote, che possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzate per fino a 1 mese (non ricongelare aliquote). </li><li> Poco prima di imaging, mescolare l&#39;enzima (A), glucosio (B) e agente riducente (C) soluzioni madre insieme nel rapporto di 50 microlitri, 400 ml, 100 ml e portare a 1 ml con PBS * 6. Questo tampone ora scavenging ossigeno e hanno un ambiente riducente (MEA-100 mMHCl) * 7. Il pH finale dovrebbe essere nel range 6,0-8,5 (regolazione non è normalmente necessario) * 8. </li></ol> Nota 6 - questo tampone è adatto per l&#39;uso con coloranti a base carbocyanine-come Cy5 e Alexa 647. Nota 7 - le concentrazioni enzimatiche finali sono 50 pg / ml (5 unità / ml) di glucosio ossidasi e 1 mg / ml (40-60 unità / ml) di catalasi. L&#39;attività enzimatica (unità) è data da fornitori e può variare. I calcoli per la catalasi presuppongono che 1 mg / ml concentrazione finale dopo il punto 5.4 conterrà 50 unità di enzima. Varie composizioni del buffer compresi analoghe componenti che assorbono l&#39;ossigeno può essere trovato 21,30,40. Per un riepilogo delle combinazioni tampone e tintura vedi riferimenti 28,29. Glicerina e TCEP sono necessari per la conservazione a lungo termine a -20 ° C. Nota 8 - se filamenti di actina immagini aggiungono 2 mM MgCl 2 e 0,2 mM ATP per contribuire a stabilizzare tha filamenti. 6. Microscopio Acquisizione di STORM dati (con Alexa 647 colorante) <ol><li> Accendere il microscopio STORM / PALM, preferibilmente almeno 3 ore prima di imaging per consentire un equilibrio termico da raggiungere. Imaging prima di questo ha una maggiore probabilità di deriva. </li><li> Inserire la camera di imaging nel supporto del campione palco microscopio. Assicurarsi che il campione sia saldamente nel supporto ed è piatta. </li><li> Rimuovere la PBS dalla camera di imaging e poi riempire verso l&#39;alto con il buffer di commutazione. Posizionare con cura il vetrino sopra la parte superiore della camera, facendo attenzione che non ci siano bolle a tutti e che l&#39;intera camera è coperto. Top con buffer aggiuntivo o PBS se eventuali bolle sono visti diversamente tampone prestazioni possono diminuire. </li></ol> ATTENZIONE - per minimizzare le possibilità di deriva laterale e assiale del campione in relazione alla lente obiettivo si raccomanda che il campione e il buffer sono lasciati equilibrarea temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima di imaging. <ol start="4"><li> Individuare una fluorescente struttura di interesse per essere ripreso. Selezionare l&#39;angolo desiderato di illuminazione, in questo caso, un angolo TIRF o fortemente inclinate è raccomandata in quanto migliora il rapporto segnale-rumore minimizzando luce fuori fuoco, particolarmente di beneficio per campioni di cellule. Prendere una immagine a diffrazione limitata di riferimento della struttura prima di imaging tempesta. </li><li> Aumentare il laser di eccitazione (con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione appropriata di circa 640 nm) ad una elevata potenza, pari a circa 2 kW / cm 2, mentre l&#39;imaging con impostazioni della fotocamera di esposizione 10 msec e un tempo di ciclo di circa 50 Hz (fotogrammi al secondo) . Una volta che i fluorofori hanno transitato in un modello lampeggiante sparso (probabilmente meno di 10 secondi per la maggior parte dei campioni) raccogliere 10.000 fotogrammi * 9. </li></ol> Nota 9 - 10.000 fotogrammi è adatto per i campioni qui descrittima può essere necessario aumentare il numero di frame di 50.000 o più per gli altri campioni. 7. Ricostruire Super-Resolution immagini dai dati grezzi (utilizzando temporale) <ol><li> Aprire il file rainSTORM.m dall&#39;interno di MATLAB ed eseguire (Figura 1A). </li><li> Nella finestra temporale (Figura 1B), selezionare il file immagine da analizzare utilizzando il pulsante Sfoglia. Questo dovrebbe essere un file. TIF (ImageJ può essere utilizzato per convertire altri tipi di file in un formato TIF). Modificare la larghezza in pixel per abbinare i dati grezzi del sistema microscopio utilizzato per acquisire i dati * 10. Lasciare gli altri valori di default. </li></ol> Nota 10 - Un tipico EMCCD fotocamera ha una dimensione di pixel di 16 micron così su un sistema con una lente obiettivo 100X la dimensione pixel dell&#39;immagine sarà 160 nm. Nei sistemi commerciali la dimensione dei pixel è solitamente visualizzato all&#39;interno del software. Dimensioni dei pixel variano tra 100 nm e 160 nm per la maggior parte dei microscopi di localizzazione.<ol start="3"><li> Premere il pulsante &#39;Process Images &quot;e attendere che appaia un&#39;immagine preliminare. La durata del trattamento dipenderà dalla dimensione del file, specifica computer e il numero di lampeggi candidati all&#39;interno dei dati grezzi * 11. </li></ol> Nota 11 - 10000 sequenze di fotogrammi di actina e dati FEG ha preso 23 sec e 25 sec per elaborare rispettivamente utilizzando un PC con una CPU Intel Xeon E5420. Utilizzando lo stesso computer senza uno strumentario elaborazione parallela in MATLAB, o con un computer senza core aerei, tempi erano 66 sec e 81 sec rispettivamente. <ol start="4"><li> Per generare un&#39;immagine super-risoluzione premere aggiornato il tasto &#39;Open Revisore&#39; e apparirà una seconda finestra (Figura 1C). Premere il pulsante &#39;Regolare il contrasto&#39;, al fine di modificare la visualizzazione dell&#39;immagine, se lo desideri (Figura 1D). In alcuni casi, dove l&#39;immagine è molto scura il valore massimo deve essere ridotta. </li><li> Utilizzare il revdel visualizzatore finestra (Figura 1C) per generare le metriche utili qualità delle immagini e perfezionare ulteriormente l&#39;immagine di super-risoluzione. Impostare i primi tre parametri di controllo di qualità a valori di 4.000, 0,1 e 0,8-2,0 rispettivamente * 12. Aggiornare i conteggi per un valore di fotoni, che dovrebbe essere sia basata su una misurazione di calibrazione fotone o l&#39;utilizzo fotone-curva valori della curva di calibrazione specificati dal produttore della fotocamera per una particolare impostazione di guadagno EM. Questo è fondamentale per ottenere precisione accurata e misure di risoluzione * 13. </li></ol> Nota 12 - Conti segnale respinge lampeggia in base a criteri di luminosità. Più alto è il valore più luminosa batter deve essere quello accettato come localizzazione nell&#39;immagine finale. Ciò può essere modificata a seconda dell&#39;uscita fotone del tempo colorante e l&#39;esposizione e la sensibilità della telecamera. Tolleranza rifiuta lampeggia se vi è un significativo errore quadratico tra il segnale e il attrezzata gaussiana cioè dpicchi ouble. PSF Sigma Gamma rifiuta lampeggia se la larghezza attrezzata del PSF si trova fuori di questo intervallo, cioè una gamma più ristretta può essere usata per respingere out-of-focus segnali e grandi macchie aggregate di costante fluorescenza. Utilizzando una gamma più ampia può causare artefatti mislocalization appaiono nell&#39;immagine finale. In pratica, si consiglia di eseguire il controllo iniziale della qualità utilizzando il parametro cutoff precisione di localizzazione. Nota 13 - per maggiori informazioni su metriche di risoluzione vedi riferimenti 23,27. In breve conoscendo il numero di fotoni prodotti da ogni ammiccamento è possibile calcolare la precisione di localizzazione di ciascuna localizzazione e di conseguenza il grado di DERIVE significare stime di precisione per l&#39;intera immagine. Utilizzando un Andor Ixon DU-897E con un&#39;impostazione di guadagno di 200 Conti per valore Photon è 9.04. <ol start="6"><li> Modificare il taglio di precisione di localizzazione (Figura 1C) per ottimizzare il compromesso tra precis localizzazione mediion contro il numero localizzazione nell&#39;immagine finale. Valori di 30-50 nm sono raccomandati in funzione della qualità dei dati e il campione. Entrambi gli istogrammi ei file info.txt possono essere utilizzati per informare questa decisione (figure 1F e 1G). </li><li> Il fattore di scala ricostruzione (Figura 1C) di default è 5, che genererà super-risoluzione pixel di 32 nm, assumendo che la larghezza in pixel nelle immagini originali è di 160 nm. Se le immagini crude hanno una dimensione in pixel di 100 nm questo produrrà immagini super-risoluzione con pixel di 20 nm. Aumentare il fattore di scala per la produzione di piccoli super-risoluzione pixel nell&#39;immagine finale * 14. </li></ol> Nota 14 - Risoluzione della microscopia localizzazione dipende dalla lisciatura desiderata per la visualizzazione (cioè la dimensione del pixel di una semplice ricostruzione istogramma) e la precisione di localizzazione. In pratica, la dimensione dei pixel ricostruzione dovrebbe generalmente essere inferiore alla localizzazioneprecisione (vedere la metrica media precisione Stima nel file di testo informativo - i punti 6.11 e 6.12). In questo caso la perdita di risoluzione a causa di ricostruzione dimensioni dei pixel sarà piccolo 23,27. Ad esempio, le stime medie di precisione nella fila e la direzione della colonna di figura 4E sono 16.1 nm e 16.2 nm. Dimensioni pixel di 16 nm è stato usato per visualizzare dati (fattore di scala ricostruzione di 10 con una larghezza di pixel originale 160 nm). <ol start="8"><li> Modificare l&#39;intervallo di fotogrammi limite (Figura 1C) per limitare la ricostruzione di sottoinsiemi di dati grezzi, per esempio [2001-inf] escluderebbe i primi 2.000 frame di dati grezzi. </li><li> Premere il pulsante &#39;Run Revisore&#39; (Figura 1C) per generare un&#39;immagine super-risoluzione aggiornato (Figura 1E). </li><li> Premere il pulsante &#39;Mostra istogrammi &quot;(Figura 1C), al fine di visualizzare i parametri di qualità dell&#39;immagine (Figura 1F) * 15. </li></ol&gt; Nota 15 - Il grafico in alto a destra raffigurante il numero di localizzazioni accettate contro numero di telaio telecamera e l&#39;istogramma Thompson localizzazione Precisazioni in basso a destra (Figura 1F) può essere utilizzato per informare l&#39;opzione di revisione taglio di precisione di localizzazione. Ad esempio, utilizzando un cutoff 50 nm escluderebbe tutte le localizzazioni con precisione peggio venga incluso l&#39;immagine finale super-risoluzione. <ol start="11"><li> Premere il pulsante &#39;Salva immagine&#39; nella recensione (Figura 1C) per salvare tutti questi dati * 16. </li></ol> Nota 16 - Tra 3 e 5 file possono essere salvati in base alle opzioni selezionate (immagine somma, STORMdataImage, STORMprocessed, informazioni e hists), vedi Figura 1G. L&#39;immagine elaborata STORM viene visualizzata con le mappe contrasto e colori modificati. Il STORMdataImage è un&#39;immagine in scala di grigi, in cui il livello di grigio di ogni pixel è uguale insensibileer di localizzazioni che sono stati individuati all&#39;interno di esso. <ol start="12"><li> Dopo aver esaminato i dati (ad esempio Info.txt di file e istogrammi), il ritorno al punto 7.6 e ripetere i passi successivi con diversi parametri membro, se lo desideri. Premendo &#39;Salva immagine&#39; al passo 7.11 sovrascrive i dati precedentemente salvati. </li></ol> 8. Box di monitoraggio e correzione Drift (utilizzando temporale) <ol><li> Seguire i passaggi 7,1-7,9 per generare un&#39;immagine in modo normale. </li><li> Premere il pulsante &#39;Box inseguimento&#39; nella recensione (Figura 1C) e fare clic e trascinare una casella su marcatore fiduciale o struttura di interesse sull&#39;immagine recensito. </li><li> Attendere fino a quando appare una nuova immagine, che visualizzerà le &quot;posizioni Boxed&quot; (vedi figure 6B, 6C e 6F per gli esempi). Salva l&#39;immagine, se lo desideri. </li><li> Se l&#39;oggetto di interesse è un marker fiduciali poi deriva la correzione può essere effettuata cliccando sul pulsante &#39;Set Anchor&#39; seguito dal &#39;SubPulsante tratto Drift &#39;. Infine, fare nuovamente clic su &#39;Esegui Revisore&#39; per generare una nuova immagine STORM, che adesso avrà tutte le localizzazioni corrette secondo le posizioni dei marker fiduciali. Le posizioni tallone vengono eliminati dall&#39;immagine finale recensito. </li><li> Se ci sono altri markers fiduciali all&#39;interno dell&#39;immagine finale deriva corretta, questi possono essere rimossi premendo &#39;Box inseguimento&#39;, &#39;Elimina Boxed&#39; e poi tante volte «Run utente &#39;come desiderato. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Mostriamo con alcuni campioni semplici e il software di elaborazione temporale liberamente disponibile, è possibile ottimizzare STORM super-risoluzione delle immagini. Questi strumenti e metodi forniranno utili punti di partenza per i nuovi utenti e modi per gli utenti esperti per aumentare la fiducia nei loro microscopi ed il loro uso per studiare le strutture biologiche e cellulari con un dettaglio senza precedenti. Utilizzando una combinazione di campioni con strutture note o ben comprese e un algoritmo che può produrre un numero di parametri utili qualità dell&#39;immagine, quali stime precisione medi, il numero di localizzazione e istogrammi mostra è possibile migliorare la qualità dell&#39;immagine e di avere maggiore fiducia nel processo di imaging STORM. Non esiste una strategia unica per acquisire i dati in quanto vi sono una serie di diverse configurazioni microscopio commerciali e auto-costruito che può essere utilizzato. Inoltre, ci sono molti di preparazione del campione e di immagine fasi di acquisizione che può influenza l&#39;immagine finale quindi con strumenti software e campioni è fondamentale per la comprensione e ottimizzare la qualità delle immagini STORM. Inoltre, questi protocolli possono fornire modi utili e meno ambigue di risoluzione di eventuali problemi che possono sorgere. Ad esempio il campione destrano è un modo molto utile per identificare se c&#39;è qualche disallineamento fascio laser o illuminazione non uniforme del campione. Se ci sono preoccupazioni che il buffer di commutazione non può lavorare un test visivo molto semplice per vedere se c&#39;è qualche &#39;lampeggiante&#39; sarà di aiuto. Filamenti di actina sono un modo utile per misurare risoluzione usando paragoni FWHM nonché evidenziare deriva e mislocalization artefatti. Tuttavia, va notato che come metodi super-risoluzione basata localizzazione-può essere densità fluoroforo sensibili, nonostante gli altri fattori, quali tempi di esposizione, frame rate potenze laser e il modo in cui l&#39;immagine viene elaborata, è impossibile assegnare risoluzione di unparticolare microscopio e supporre che tutte le immagini avranno tale risoluzione. Che cosa è possibile, tuttavia, è quello di misurare i vari aspetti della risoluzione come precisioni di localizzazione, il numero medio di localizzazione e deriva 27. Anche se marker fiduciali non possono essere incorporati in ogni esperimento si può, almeno, essere utilizzato per caratterizzare un sistema di microscopia, il suo ambiente e capire meglio considerazioni operative come ad esempio come è richiesto molto tempo per raggiungere l&#39;equilibrio termico dopo l&#39;avviamento. E correggere la deriva laterale, marcatori fiduciali possono essere utilizzati per caratterizzare e corretta per deriva assiale, anche se questo richiede l&#39;uso di una lente astigmatica e un meccanismo di feedback per correggere la posizione del campione mentre le immagini vengono acquisite 43. Sistemi di super-risoluzione commerciali comprendono normalmente una sorta di controllo di stabilità o concentrarsi-lock meccanismo, che può essere una soluzione più pratica per la correzione fuoco deriva. C&#39;è unare alternative non specifico rivestimento del vetro con destrano, come l&#39;utilizzo di coloranti direttamente o altre molecole coniugati, come anticorpi secondari. Una limitazione di questi approcci è che il numero di molecole legate al vetro non è noto. Strutture filamentose alternativi che sono stati utilizzati includono microtubuli 28 e DNA 21. Tuttavia, la combinazione di dimensioni molto piccole e convenienti reagenti commercialmente disponibili rendono actina un&#39;alternativa interessante, tanto più che la distanza di separazione dei filamenti divergenti o ramificati può anche essere una misura utile di prestazioni del sistema 27. C&#39;è spazio per un ulteriore sviluppo dei campioni di prova, nonostante i recenti progressi in questo settore 28,29,46,47. In particolare, l&#39;imaging multi-colore presenta una serie di sfide in tutti i 3 aspetti principali della rappresentazione, l&#39;etichettatura del campione, acquisizione di immagini (hardware) e software (elaborazione delle immagini e l&#39;allineamento). Ci sono stati ununa serie di pubblicazioni che affrontano questi aspetti 4-6 ed è quindi chiaro che i campioni e le metodologie di prova appropriati sono fondamentali per generare e affidabile interpretare questi tipi di immagini. Infatti, recentemente è stato dimostrato che dSTORM potrebbe essere utilizzato per prendere due immagini a colori di, e risolvere, la natura altamente simmetrico del complesso del poro nucleare e gli autori suggerito che questo sarebbe un modo ideale per valutare le prestazioni di correzioni aberrazione cromatica 45. Un altro approccio interessante è l&#39;uso di origami DNA per creare un nanoruler, che crea la possibilità di fluorofori posizionamento a specifiche distanze sub-diffrazione a parte 46. Questo fornisce un modo di valutare la risoluzione e fare misurazioni della distanza. Tuttavia, l&#39;obiettivo finale è quello di applicare queste tecniche di super-risoluzione per campioni non idealizzate, come le cellule, che sono complesse strutture tridimensionali. In questo caso, una combinazione di più comprensione approfondita di tegli tecnica combinata con strumenti software che aiutano l&#39;utente nella acquisizione dei dati, l&#39;elaborazione in modi appropriati, e di fornire metriche di immagine è probabile che sia la risposta definitiva. 28,29,47,48

Recentemente una serie di tecniche di microscopia ottica sono state sviluppate, generalmente indicato come la microscopia super-risoluzione o nanoscopia, che può bypassare il limite di diffrazione e di generare immagini con una risoluzione di 100 nm o superiore a 1,2. Dal momento che l&#39;annuncio della super-risoluzione di microscopia come il metodo Nature Methods dell&#39;anno nel 2008, c&#39;è stato un grande sviluppo di microscopi a base di localizzazione. Per esempio, ci sono applicazioni multi-colore 3-6, 7-12, implementazioni 3D e applicazioni cellulari anche dal vivo 5,13-17. Inoltre, poiché tali sistemi vengono commercializzati e ora stanno facendo loro uscita laboratori ottici nelle mani di biologia cellulare è probabile che un ulteriore aumento del loro uso e l&#39;applicazione di domande biomediche. Un ramo di questa famiglia è i metodi basati localizzazione-che lavorano costruendo una molecola per molecola immagine. Iol fine di fare ciò, la maggior parte delle molecole fluorescenti all&#39;interno del campione deve essere spento in modo che solo poche molecole spazialmente separati sono attivi contemporaneamente. Queste molecole sono poi rapidamente accesi e spenti e molte immagini sono prese in modo che una parte significativa della popolazione è ripreso da riflettere la struttura sottostante con precisione sub-diffrazione. Un certo numero di approcci sono stati pubblicati tra cui GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 e RESOLFT 22. Algoritmi che misurano la posizione di una singola molecola di rilevamento possono essere usati per individuare la posizione reale della molecola con precisioni migliori di 20 nm usando Lato Gaussian 23, ad esempio rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 e palm3d temporale 27. Quando imaging cellulare o altri campioni biologici, che hanno una densità elevata molecola, è pertanto necessario adottare diverse migliaia di fotogrammi diquesto lampeggiante, spazialmente separati, segnale per l&#39;immagine di una parte significativa delle molecole marcate. Stocastico la microscopia ottica ricostruzione (STORM) e altamente correlati dSTORM e metodi GSDIM sono metodi super-risoluzione in base alla localizzazione, che hanno dimostrato di lavorare con coloranti organici disponibili in commercio 21. Da allora sono stati dimostrato di essere applicabile ad un numero di differenti coloranti 28-30, che rende la metodologia particolarmente attraente a causa della specificità e della convenienza relativa di approcci immunomarcatura consolidate per eseguire microscopia a fluorescenza. Di conseguenza, vi è un facile accesso a una serie di coniugati anticorpo-colorante e dye-biomolecola, che hanno il potenziale di essere utilizzato in base localizzazione-super-risoluzione di immagini. Mentre i principi generali di STORM e approcci simili sono relativamente semplici, ed a prima vista la preparazione dell&#39;hardware e del campione sembrano relativamente straightforward, ci sono una serie di passi nel processo che sono fondamentali per il raggiungimento di alta qualità, immagini super-risoluzione prive di artefatti. Come con tutte le tecniche di microscopia il processo può essere pensato in 3 fasi principali: in primo luogo, la preparazione del campione, secondo, acquisizione immagini e, terzo, trattamento immagini e / o analisi e interpretazione delle immagini. Il potere risolutivo supplementare e il metodo di generazione di immagini super-risoluzione utilizzando un approccio basato localizzazione-introduce alcuni nuovi problemi e considerazioni 31-33. Partendo con la preparazione del campione, durante l&#39;esecuzione immunomarcatura, particolarmente immunofluorescenza indiretta in cui viene usata la combinazione anticorpo primario e secondario, va notato che il colorante fluorescente può essere fino a 20 nm dalla molecola di interesse. Nel caso di microtubuli, questo si traduce in diametri di 35-50 nm rispetto al diametro microtubuli atteso di 25 nm 28,30. Inoltre, la densità di etichettatura dovrebbe meet i criteri di Nyquist per generare un&#39;immagine di alta qualità 14. Ad esempio per una risoluzione di immagine anticipato di 20 nm lungo una struttura filamentosa ci dovrebbe essere una molecola colorante almeno ogni 10 nm 27. Mentre molti coloranti sono stati pubblicati a lavorare per approcci basati localizzazione, le prestazioni complessive del colorante è un mix di almeno quattro criteri fondamentali, vale a dire fotoni rivelati per la commutazione evento (la luminosità di ogni ammiccamento - luminoso è meglio), l&#39;equilibrio su -off duty cycle (rapporto di contrasto di coloranti in off contro sullo stato - più fuori è generalmente migliore), la frazione di sopravvivenza (un tasso di sbiancamento basso è meglio) e il numero di cicli di commutazione (il numero di lampeggi per fluoroforo - altro è meglio per alta risoluzione, anche se 1 lampeggio ogni fluoroforo può essere un vantaggio per scopi di conteggio molecola). La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che queste proprietà per qualsiasi colorante può variare in differenti condizioni di buffer econ la potenza del laser 28,29. Inoltre, oltre a queste considerazioni STORM unici, la qualità dell&#39;immagine può essere migliorata ottimizzando preparazione del campione nello stesso modo come le tecniche più tradizionali microscopia a fluorescenza ad esempio minimizzando autofluorescenza mediante trasformazione di metodiche di fissazione e l&#39;uso di reagenti di raffreddamento. Inoltre, minimizzando fluorofori non specificatamente legato è importante, che può essere fatto regolando le concentrazioni di etichette, tempi di incubazione e blocco e lavaggio passaggi. La seconda fase di acquisizione delle immagini è anche critico. Le impostazioni ottimali sul microscopio dipenderanno dalla tintura, condizioni di buffer, densità etichettatura, e tipo di campione, ad esempio monostrati su vetro, cellule o campioni di tessuto. Le considerazioni principali sono il tempo di esposizione della fotocamera, il numero di telaio, angolo di illuminazione (TIRF, Hilo, Epi) e la potenza del laser. L&#39;obiettivo è quello di raccogliere quante più brillanti lampeggia spazialmente separati il ​​più rapidamente possibile. Se lo sfondo is molto elevate o lampeggia non sono molto luminoso, in altre parole il rapporto segnale-rumore è scarsa, l&#39;algoritmo di ricostruzione non sarà in grado di localizzare la posizione con la massima precisione. Così come massimizzare la precisione di localizzazione, ossia la precisione con ogni posizione molecola può essere misurata, la qualità dell&#39;immagine dipende anche da un elevato numero di localizzazioni. Se un numero insufficiente di molecole di interesse sono ripreso, sia a causa della scarsa efficienza di etichettatura, eccessiva fotoscolorimento o un numero di telaio inadeguato, allora l&#39;immagine super-risoluzione risultante sarà puntata e discontinuo, come non sono stati rispettati i criteri di Nyquist 14,27 . E, infine, la terza fase, l&#39;elaborazione delle immagini, è particolarmente importante rispetto alle tecniche di microscopia a fluorescenza. Vi è una gamma di liberamente e disponibili in commercio algoritmi, che è sia un vantaggio, in termini di scelta, e uno svantaggio, in quanto può essere fonte di confusione per sapere which è più opportuno utilizzare. Se per esempio i dati grezzi ha ben distanziati lampeggia spazialmente distinte poi un algoritmo di raccordo singola molecola può essere estremamente preciso ed efficiente, per esempio gli algoritmi di montaggio sparse disponibili in tempesta 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 e software QuickPALM 26 . Se i dati grezzi contiene un sacco di segnali sovrapposti poi algoritmi che possono essere più opportuno includere DAOSTORM 34, 3B 35 e deconSTORM 36. Inoltre, questi algoritmi contengono soglie per vari criteri come il numero di segnali, o fotoni per batter, nonché varie opzioni diverse di visualizzazione delle immagini come ad esempio la visualizzazione con funzioni gaussiana smussati o come istogrammi con griglie di pixel, in cui la dimensione dei pixel super-risoluzione può essere selezionato dall&#39;utente. Tutte queste opzioni modificare l&#39;aspetto dell&#39;immagine finale e avere implicazioni per l&#39;interpretazione e analisi delle immagini. <p class="jove_content"&gt; Quindi, vi presentiamo tre campioni di prova che forniranno il nuovo utente con un punto di partenza per esperimenti dye-based di localizzazione-super-risoluzione, che per motivi di chiarezza ci riferiremo come tempesta, e gli utenti più esperti la possibilità di ottimizzare ulteriormente i loro esperimenti. In primo luogo, è possibile rivestire la superficie di vetro con uno strato fluorescente di destrano coniugato con colorante. Questo fornisce un modo rapido e semplice per stabilire che il microscopio, tintura e tampone stanno lavorando per generare lampeggiante segnale fluorescente. Il metodo può essere esteso confrontando parametri medi precisione la localizzazione e numero generati da temporale per ottimizzare le condizioni di buffer, le impostazioni di acquisizione delle immagini e testare diversi coloranti. In secondo luogo, vi presentiamo un semplice protocollo per la preparazione di filamenti di actina su vetro, che può essere facilmente etichettato utilizzando coniugati phalloidin-dye. Questi forniscono strutture ideali per prendere misure di risoluzione 27 e in genere la larghezza a metà massimo (FWHM)di un filamento è data una stima empirica della delibera 37. Va notato che la risoluzione varia tra i campioni e tra le immagini all&#39;interno dello stesso campione perché la risoluzione in super-risoluzione microscopia base a localizzazione è funzione della luminosità fluoroforo, il rumore di fondo e la densità localizzazione 27 e questi non sono necessariamente costanti in tutto il campione. Filamenti di actina sono utilizzati per dimostrare i potenziali manufatti come mislocalizations e deriva e come possono essere identificati con le caratteristiche del software all&#39;interno di temporale. Inoltre, si descrive l&#39;utilizzo di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare e corretta deriva. E in terzo luogo, la colorazione delle cellule con il fattore di crescita epidermico (EGF) coniugati-dye è descritto. EGF fornisce un utile indicatore di performance immagine super-risoluzione, in quanto una percentuale del recettore sulla superficie cellulare subisce endocitosi tramite vescicole, che sono strutture sub-diffrazione dimensioni di circa 50-150 nm di diametro 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Imaging chamberglass</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Preparazione del campione</td></tr><tr><td>Microscopio invertito </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Vedi sotto per le alternative</td></tr><tr><td>100 X TIRF Obiettivo Lente</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Vedi sotto per le alternative</td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Vedi sotto per le alternative</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>640 nmToptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - per l'imaging di coloranti Alexa 647 o Cy5</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Software di acquisizione (hardware di controllo)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bit), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB di RAM *Controllo dello strumento ed elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Analisi ed elaborazione delle immagini <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Esempio di microscopi</td><td></td><td></td> STORM/PALM autocostruiti <td>Vedi anche riferimento 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a></td></tr><tr><td>*Microscopi</td><td></td><td></td> commerciali a super-risoluzione STORM/PALM <td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternative ai microscopi autocostruiti</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 1. Materiali & Attrezzatura </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Tampone di actina generale</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Filamenti di actina preformati</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Fallodina-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Microsfere TetraSpeck (0.1 micron)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Celle HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Piatti di plastica</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldeide - Soluzione al 10 % Grado EM</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2. Reagenti</td></tr></tbody></table>

i campioni di prova per ottimizzare storm super-resolution microscopia

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM è una tecnica di microscopia super-risoluzione recentemente sviluppato con fino a 10 volte la risoluzione migliore di tecniche di microscopia a fluorescenza standard. Tuttavia, poiché l&#39;immagine viene acquisita in modo molto diverso rispetto al normale, costruendo una molecola per molecola immagine, ci sono alcune sfide significative per utenti in cerca di ottimizzare il loro acquisizione dell&#39;immagine. Per aiutare questo processo e ottenere un quadro più chiaro di come funziona STORM presentiamo la preparazione di 3 campioni di prova e la metodologia di acquisizione ed elaborazione STORM immagini super-risoluzione con risoluzioni tipiche di 30-50 nm. Combinando i campioni di prova con l&#39;uso del software di elaborazione temporale liberamente disponibile è possibile avere una grande quantità di informazioni sulla qualità dell&#39;immagine e risoluzione. Utilizzando questi parametri è allora possibile ottimizzare la procedura di imaging dall&#39;ottica, alla preparazione del campione, scelta colorante, condizioni di buffer e impostazioni di acquisizione immagine. Abbiamo unamostrano esempi LSO di alcuni problemi comuni che si traducono in scarsa qualità delle immagini, come ad esempio la deriva laterale, dove le mosse del campione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e della densità legate problemi derivanti dal fenomeno &#39;mislocalization&#39;.

Descriviamo la preparazione di tre campioni e come possono essere utilizzati per ottimizzare e valutare le prestazioni dei microscopi tempesta. Utilizzando questi esempi vi mostriamo come acquisire dati grezzi e poi elaborarlo per acquisire immagini super-risoluzione in cellule di circa 30-50 nm risoluzione.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come acquisire immagini super risolutive di alta qualità con STORM. Questo viene realizzato innanzitutto preparando un campione di prova fluorescentemente marcato. Il secondo passaggio consiste nel preparare il buffer di commutazione e quindi riempire la camera di imaging con il buffer.Successivamente, i dati grezzi vengono acquisiti mediante un microscopio storm. L'ultimo passaggio consiste nella ricostruzione di immagini a super risoluzione a partire dai dati grezzi, utilizzando un software di elaborazione rainstorm. Infine, i campioni test vengono impiegati per mostrare come acquisire dati grezzi di alta qualità, che possono quindi essere elaborati per generare immagini a super risoluzione storm in cellule, con risoluzioni comprese tra 30 e 50 nanometri, corrispondenti a un miglioramento di risoluzione da cinque a dieci volte rispetto alle tecniche tradizionali di microscopia a fluorescenza, tra cui turf e confocale.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontrano difficoltà perché non si rendono conto dell'importanza di raccogliere molti legami sparsi di alta qualità. Questo risulta molto più semplice utilizzando il colorante Alexa 6 4 7 nel tampone di commutazione corretto. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è essenziale poiché l'acquisizione di dati grezzi di alta qualità è fondamentale per produrre immagini con risoluzione SPR.Le sequenze video grezze di questa tecnica appaiono completamente diverse rispetto a qualsiasi altra forma di microscopia a fluorescenza. Per iniziare la procedura di rivestimento del vetro con destrina fluorescente, aggiungere 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% in ciascun pozzetto di una piastra coprivetro a otto camere e incubare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere la soluzione di polilisina con una pipetta per assicurarsi che non rimanga alcun liquido diluito.0,25 microlitri di una soluzione madre di destrina a due milligrammi per millilitro. Alexa 6 47 in 25 microlitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione a 20 microgrammi per millilitro, al fine di creare un rivestimento denso di destrina. Soluzione di Alexa 6 47.Diluire 20 microlitri della soluzione da 20 microgrammi per millilitro fino a un volume totale di 200 microlitri con acqua deionizzata. Per una soluzione a densità media, diluire 2 microlitri in 200 microlitri di acqua deionizzata. Per una soluzione a bassa densità, diluire 0,2 microlitri.In 200 microlitri di acqua deionizzata, aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita di dextrina Alexis X 47 in ogni pozzetto e incubare per 10 minuti. È possibile utilizzare tempi di incubazione più lunghi, che potrebbero determinare un rivestimento di dextrina più denso. Infine, rimuovere le soluzioni Dexter Xis X 47 e lavare con acqua per tre volte.Per preparare filamenti di actina fluorescenti su vetrino, aggiungere prima 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% in ciascun pozzetto di una camera a otto alveoli. Coprire il vetrino e incubare per 10 minuti. Rimuovere quindi con una pipetta per assicurarsi che non rimanga alcun liquido.Aggiungere in ogni camera 90 microlitri di tampone generale per l'actina, precedentemente ricostituito secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di soluzione di filamenti di actina preformati a 10 micromolari e un microlitro di foid e Alexa 647 ed eseguire delicatamente alcune aspirazioni e dispersioni con la pipetta per mescolare; incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare le microsfere fluorescenti come marcatori fiduciali. Diluire un microlitro di microsfere Tepec in 200 microlitri di PBS ed omogeneizzare. Aggiungere le microsfere diluite nella camera di imaging e attendere 15 minuti.Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS prima dell'acquisizione delle immagini. Utilizzare cellule coltivate fino a una confluenza di circa l'80%. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare con PBS. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di formaldeide al 4% per 10 minuti.Rimuovere il formaldeide e lavare tre volte con PBS. Non permettere che le cellule si secchino e utilizzare sempre soluzioni tampone PBS. Per evitare lo stress ipotonico, aggiungere due microlitri di una soluzione madre di EGF Alexa 647 a 50 microgrammi per millilitro a 200 microlitri di soluzione di BSA allo 0,1%, quindi aggiungere questa soluzione alle cellule HeLa.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS. Aggiungere una soluzione bloccante contenente BSA allo 0,1% e lasciare per 15 minuti a temperatura ambiente.Dopo di ciò, rimuovere la soluzione di blocco e lavare ulteriormente tre volte con PBS prima dell'acquisizione delle immagini. Immediatamente prima dell'acquisizione, preparare il buffer di commutazione mescolando insieme le soluzioni stock dell'enzima glucosio e dell'agente riducente in un rapporto di 50 microlitri, 400 microlitri e 100 microlitri, quindi aggiungere PBS per portare il volume finale a un millilitro. Rimuovere il PBS dalla camera di acquisizione e quindi riempire fino all'orlo con il buffer di commutazione.Posizionare con attenzione un coprioggetto sulla parte superiore della camera, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria e che l'intera camera sia coperta. Se si notano bolle, aggiungere ulteriore tampone o PBS. In caso contrario, le prestazioni del tampone possono diminuire.La raccolta di dati di collegamento ad alta qualità e sparsi è essenziale per il successo di questa procedura; assicurarsi quindi che i microscopi siano correttamente messi a fuoco e che vengano utilizzate le impostazioni di acquisizione appropriate. Individuare una struttura fluorescente di interesse da immaginiare. Selezionare l'angolo desiderato di illuminazione.In questo caso, si consiglia un angolo di inclinazione elevato o un angolo a prato poiché ciò migliora il rapporto segnale-rumore riducendo al minimo la luce fuori fuoco, il che è particolarmente vantaggioso per i campioni cellulari. Acquisire un'immagine di riferimento della struttura con risoluzione limitata prima dell'acquisizione mediante tecnica STORM. Aumentare il laser di eccitazione a una potenza elevata corrispondente a circa due kilowatt per centimetro quadrato, acquisendo con impostazioni della fotocamera di un'esposizione di 10 millisecondi e un tempo di ciclo di circa 50 hertz o fotogrammi al secondo.Una volta che il pattern di fluorescenza diventa un modello intermittente debole, acquisire 10.000 fotogrammi. Per iniziare questa ricostruzione, aprire il file M RAINSTORM all'interno di MATLAB ed eseguirlo nella finestra rainstorm.Selezionare il file immagine da analizzare utilizzando il pulsante di navigazione. Deve trattarsi di un file TIF. Modificare la larghezza in pixel per farla corrispondere ai dati grezzi del sistema microscopico utilizzato per acquisire i dati.Lasciare gli altri valori ai valori predefiniti. Premere il pulsante elabora immagini e attendere finché non appare un'immagine preliminare. La durata dell'elaborazione dipenderà dalle dimensioni del file, dalle specifiche del computer e dal numero di collegamenti candidati all'interno dei dati grezzi.Per generare un'immagine aggiornata a super risoluzione, premere il pulsante apri revisore e apparirà una seconda finestra. Premere il pulsante regola contrasto per modificare la visualizzazione dell'immagine secondo le proprie preferenze. In alcuni casi in cui l'immagine è molto scura, il valore massimo dovrebbe essere ridotto.Utilizzare la finestra del revisore per generare metriche utili sulla qualità dell'immagine e per affinare ulteriormente l'immagine a super risoluzione. Lasciare i primi tre parametri di controllo qualità ai valori predefiniti di 5.000, 0,1 e da 0,8 a 3,5 rispettivamente. Aggiornare il valore dei conteggi per fotone.Modificare la soglia di precisione di localizzazione per bilanciare l'ottimizzazione della localizzazione media e della precisione rispetto al numero di localizzazioni. Nell'immagine finale, si raccomandano valori compresi tra 30 e 50 nanometri, a seconda della qualità dei dati e del campione. Il fattore di scala predefinito per la ricostruzione è cinque, il che genererà pixel a super risoluzione di 32 nanometri, assumendo che il pixel nelle immagini originali sia di 160 nanometri.Se le immagini grezze hanno una dimensione del pixel di 100 nanometri, questo produrrà immagini a super risoluzione con pixel di 20 nanometri. Aumentare il fattore di scala per ottenere pixel a super risoluzione più piccoli. Nell'immagine finale, premere il pulsante run reviewer per generare un'immagine aggiornata a super risoluzione.Premere il pulsante "visualizza istogrammi" per mostrare le metriche della qualità dell'immagine. Infine, premere il pulsante "salva immagine" nel revisore per salvare tutti questi dati. Iniziare questa procedura generando un'immagine nello stesso modo illustrato in precedenza.Premere il pulsante di tracciamento della casella nel revisore e fare clic tenendo premuto per trascinare una casella sul marcatore fiduciale nell'immagine esaminata. Attendere finché non appare una nuova immagine, che mostrerà le posizioni racchiuse in box. Salvare questa immagine se desiderato, qualora l'oggetto di interesse sia un marcatore fiduciale.Come nel caso illustrato, eseguire la correzione della deriva facendo clic sul pulsante imposta ancoraggio seguito dal pulsante sottrai deriva. Infine, fare clic nuovamente su esegui revisore per generare una nuova immagine storm. Un rivestimento di destrina riuscito dovrebbe produrre un monostrato fluorescente e i dati tipici della destrina sono mostrati in questa figura.Le immagini a limite di diffrazione mostrano diverse concentrazioni di destrina prima dell'acquisizione dell'immagine storm. Le ricostruzioni a super risoluzione hanno una dimensione del pixel di 25 nanometri. Sono state raccolte 10.000 immagini con una dimensione del fotogramma di 128 per 128 pixel e vengono mostrati singoli fotogrammi provenienti da tale sequenza.A concentrazione elevata di destrina. Il monostrato fluorescente dovrebbe apparire relativamente uniforme, come illustrato in queste immagini e in questo segmento video. A concentrazioni più basse, i lampeggi appariranno più radi e in fuoco.Non essendoci un fondo evidente durante questa fase di acquisizione delle immagini a illuminazione laser costante, il numero di lampeggiamenti diminuirà nel tempo, come illustrato dal confronto tra il fotogramma 2000 e il fotogramma 8.000 nel campione ad alta densità. La differenza principale tra le immagini a super risoluzione delle concentrazioni elevate, medie e basse di destrina è il numero decrescente di localizzazioni. Questo grafico mostra la media di tre sequenze di 10.000 fotogrammi per ciascuna concentrazione di destrina, in cui le barre di errore indicano la deviazione standard.Tuttavia, questa relazione proporzionale tra la concentrazione delle molecole fluorescenti, il numero di lampeggiamenti nei dati grezzi e il numero di localizzazioni non è una semplice relazione lineare, come illustrato in questo grafico del numero di localizzazioni accettate per fotogramma. Utilizzando una media mobile di 100 fotogrammi a densità molto elevate di molecole, il software non è in grado di localizzare con successo le molecole durante l'acquisizione di qualsiasi campione. Un problema comune può essere la presenza di un alone fluorescente brillante ma sfocato diffuso nell'immagine, causato dalla diffusione del fluorocromo attraverso il mezzo.Queste molecole fluorescenti staccate possono essere prevenute o rimosse aumentando il numero di passaggi di lavaggio con PBS prima di aggiungere il buffer di commutazione oppure aggiungendo del buffer di commutazione fresco alla camera. L'elaborazione e il confronto dei dati provenienti da ciascuna sequenza di immagini producono immagini a super risoluzione molto diverse. I pannelli C e D sono costruzioni di immagini a super risoluzione corrispondenti ai dati raccolti nei pannelli A e B rispettivamente. Questo grafico riporta il numero di localizzazioni accettate per fotogramma utilizzando una media mobile su 100 fotogrammi.La linea rossa corrisponde alla sequenza di tempesta A e C, dove è presente uno sfondo elevato; la linea blu corrisponde a B e D, dove lo sfondo è basso. Il numero accettato di localizzazioni per le immagini corrispondenti ai dati con sfondo alto e basso è mostrato nel secondo grafico. Queste tre immagini a limite di diffrazione mostrano dati tipici di filamenti di actina preformati adesi alla superficie del vetro prima dell'aggiunta del buffer di commutazione e dell'acquisizione mediante storm.È possibile osservare filamenti di lunghezze variabili. I filamenti molto luminosi sono spesso costituiti da più filamenti intrecciati tra loro. La selezione di singoli filamenti relativamente luminosi, piuttosto che di aree intrecciate, consente di ottenere immagini di migliore qualità durante la fase di acquisizione.Dovrebbero essere visibili lampi luminosi a fuoco lungo tutta la lunghezza del filamento. Durante la fase di acquisizione e successivamente nei dati elaborati, dovrebbe essere osservato un lampeggio sparso. Dovrebbe essere presente un filamento sottile e continuo nelle localizzazioni per ogni fotogramma, che mostrano un declino graduale.Tipicamente, la larghezza a metà altezza massima o FWHM di un filamento viene fornita come stima empirica della risoluzione, tracciando una linea retta attraverso una regione ingrandita del filamento di actina utilizzando la funzione profilo di tracciato in ImageJ e successivamente eseguendo un adattamento gaussiano. L'FWHM viene calcolata pari a 43,2 nanometri. Può verificarsi un problema di mala localizzazione quando numerosi filamenti di actina si ramificano o si incrociano, elaborando sottoinsiemi di fotogrammi e confrontando i primi e gli ultimi 5.000 fotogrammi.Un'immagine diversa viene prodotta nell'immagine a super risoluzione utilizzando i primi 5.000 fotogrammi. Nel centro dell'immagine si osservano molte localizzazioni. Tuttavia, quando si utilizzano gli ultimi 5.000 fotogrammi, risultano evidenti ben poche di queste localizzazioni e rimangono soltanto i filamenti, seppur in forma leggermente continua a causa del ridotto numero di localizzazioni presenti nell'immagine.Se si sospetta una densità di lampeggio eccessivamente elevata, il confronto tra le immagini e i dati di localizzazione per fotogramma può suggerire fortemente che questo problema si verifichi durante il primo insieme di fotogrammi. Il numero medio di localizzazioni per fotogramma è superiore a 10, rispetto all'ultimo insieme di fotogrammi in cui è di circa quattro. Un altro problema potenziale nella microscopia STORM è la deriva, che si verifica quando il campione si muove rispetto all'obiettivo durante la fase di acquisizione dei dati. Sebbene sia molto difficile da rilevare durante la fase di acquisizione dell'immagine, la deriva può essere osservata nelle immagini a super risoluzione di strutture note, come i filamenti di actina.Il primo segnale che potrebbe indicare una deriva laterale è che la struttura risulta più grande del previsto. Ad esempio, una larghezza a metà altezza relativamente grande rispetto ai dati del limite di precisione ottenuti da rainstorm, in questo caso 90 nanometri rispetto a 67 nanometri. Un metodo migliore per rilevare la deriva consiste nel confrontare le localizzazioni in funzione del tempo, ovvero verificare se le localizzazioni nei fotogrammi successivi risultano spostate rispetto a quelle nei fotogrammi iniziali.Questo può essere chiaramente osservato nel caso dei filamenti di actina quando vengono visualizzati con un codice colore. Utilizzando la funzione di tracciamento delle caselle in rainstorm, come mostrato nei pannelli B e C, le localizzazioni sono visualizzate con un colore corrispondente al numero di fotogramma in cui sono state acquisite. Ad esempio, le localizzazioni ottenute all'inizio della sequenza di acquisizione sono in blu, mentre quelle ottenute alla fine della sequenza di acquisizione sono in rosso.I colori spostati indicano che si è verificato un drift, al fine di misurarlo e correggerlo. Per misurare il drift, possono essere utilizzate microsfere fluorescenti con diametro di 100 nanometri come marcatori fiduciali; i numeri da uno a quattro mostrano microsfere ritagliate e ingrandite singolarmente. In un esempio in cui si verifica un drift relativamente grave di circa 100 nanometri nell'arco di tre minuti e 10 secondi durante la fase di acquisizione, la stessa funzione di tracciamento della finestra può essere utilizzata per codificare a colori e confermare l'occorrenza del drift, poiché tutte e quattro le microsfere in questo esempio mostrano uno spostamento pressoché identico. È possibile selezionarne una, in questo caso la microsfera due, da utilizzare come riferimento e sottrarre il drift dalle altre microsfere.Un confronto con il pannello E mostra che la deriva laterale &egrave; stata corretta. Infine, cellule HeLa marcate con fattore di crescita epidermico possono essere utilizzate per fornire un esempio realistico di risoluzione dell'immagine. Nel caso delle cellule, il pannello A mostra un'immagine limitata dalla diffrazione di una parte di una cellula HeLa focalizzata sulla superficie basale della cellula, in cui i riquadri gialli indicano le regioni di interesse ingrandite mostrate nei pannelli B e C, a differenza delle regioni di interesse ingrandite poco definite presenti nell'immagine limitata dalla diffrazione.Le immagini a super risoluzione dovrebbero mostrare una miscela di aggregati e occasionali singoli pixel isolati. Gli aggregati avranno un diametro di circa 100 nanometri e probabilmente corrisponderanno a fossette e vescicole in formazione. Il percorso attraverso cui l'EGF è principalmente downregolato e le localizzazioni di endocitosi per ogni fotogramma dei dati del Pannello D sono presentati nel grafico G. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare alcuni semplici campioni di prova, acquisire dati e ricostruire immagini ad alta risoluzione mediante tecnica STORM.Questi metodi aiuteranno a evitare alcune trappole comuni di adattamento come il drift e contribuiranno a ottimizzare il vostro storm. Vedere gli esperimenti sulla risoluzione.

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Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.

Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Impara a preparare campioni di prova fluorescenti per ottimizzare la microscopia STORM e acquisire immagini super-risoluzione a 30-50 nm. Questo metodo migliora significativamente la qualità dei dati grezzi per ricerche avanzate in biologia cellulare.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

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