I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come acquisire immagini ad alta risoluzione delle tempeste in super risoluzione. Ciò si ottiene preparando prima un campione di prova marcato in fluorescenza. Il secondo passaggio consiste nel preparare il buffer di commutazione e quindi riempire la camera di imaging con il buffer.

Successivamente, i dati grezzi vengono acquisiti su un microscopio a tempesta. Il passaggio finale consiste nel ricostruire immagini a super risoluzione da dati grezzi utilizzando un software di elaborazione dei temporali. In definitiva, i campioni di prova vengono utilizzati per mostrare come acquisire dati grezzi di alta qualità, che possono quindi essere elaborati per generare immagini a super risoluzione in celle con risoluzioni comprese tra 30 e 50 nanometri, che rappresentano un miglioramento della risoluzione da cinque a dieci volte rispetto alle tradizionali tecniche di microscopia a fluorescenza, tra cui il tappeto erboso e confocale.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non si rendono conto dell'importanza di raccogliere molti link sparsi di alta qualità. Questo è reso molto più semplice dall'utilizzo del colorante Alexa 6 4 7 nel buffer di commutazione corretto. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è essenziale perché l'acquisizione di dati grezzi di alta qualità è fondamentale per la produzione di immagini con risoluzione SPR.

Le sequenze video grezze di questa tecnica sembrano completamente diverse da qualsiasi altra forma di microscopia a fluorescenza. Per iniziare la procedura per il rivestimento del vetro con destrina fluorescente a 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% in ciascun pozzetto di un vetro di copertura a otto camere e incubare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere la soluzione di polilisina con una pipetta per assicurarsi che non rimanga liquido diluito.

0,25 microlitri di una soluzione madre di due milligrammi per millilitro di destrina. Alexa 6 47 in 25 microlitri di acqua deionizzata per creare una soluzione da 20 microgrammi per millilitro per creare un rivestimento ad alta densità di destrina. Soluzione Alexa 6 47.

Diluire 20 microlitri della soluzione da 20 microgrammi per millilitro in un totale di 200 microlitri di acqua deionizzata. Per una soluzione a media densità, diluire due microlitri in 200 microlitri di acqua deionizzata. Per una soluzione a bassa densità diluire 0,2 microlitri.

In 200 microlitri di acqua deionizzata, aggiungere 200 microlitri delle soluzioni diluite di destrina Alexis X 47 a ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti. È possibile utilizzare tempi di incubazione più lunghi, il che può comportare un rivestimento di destrina più denso. Infine, rimuovere le soluzioni di Dexter Xis X 47 e lavare con acqua tre volte.

Per preparare prima i filamenti di actina fluorescenti su vetro, aggiungere 200 microlitri di soluzione di polilisina allo 0,01% a ciascun pozzetto di una camera a otto. Coprire il vetro e incubare per 10 minuti. Rimuovere con una pipetta per assicurarsi che non rimanga liquido.

Aggiungere in ogni camera 90 microlitri di tampone di actina generale precedentemente ricostituito secondo le istruzioni del produttore. Quindi aggiungere 10 microlitri di 10 micromolari di soluzione di filamento di actina preformata e un microlitro di foide e Alexa 6 47 e pipettare delicatamente su e giù per mescolare, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare microsfere fluorescenti come marcatori fiduciali per diluire un microlitro di perle di tepec in 200 microlitri di PBS e mescolare. Aggiungere le perle diluite nella camera di imaging e attendere 15 minuti.

Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS prima dell'imaging e in questo esperimento vengono utilizzate cellule coltivate a circa l'80% di fluenza. Rimuovere il terreno di coltura e lavare con PBS. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di formaldeide al 4% per 10 minuti.

Rimuovere la formaldeide e lavare tre volte con PBS. Non lasciare che le cellule rimangano asciutte e utilizzare sempre soluzioni tamponate PBS. Per evitare lo stress ipotonico, aggiungere due microlitri di una soluzione madre da 50 microgrammi per millilitro di EGF Alexa, da 6 47 a 200 microlitri di soluzione BSA allo 0,1%, quindi aggiungere questa soluzione alle cellule hela.

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione e lavare tre volte con PBS. Aggiungere una soluzione bloccante allo 0,1% di BSA e lasciare agire per 15 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere la soluzione bloccante e lavare altre tre volte con PBS prima dell'imaging. Appena prima dell'imaging, preparare il tampone di commutazione mescolando insieme le soluzioni madre dell'enzima glucosio e dell'agente riducente In un rapporto di 50 microlitri, 400 microlitri e 100 microlitri, aggiungere PBS per aumentare il volume finale di un millilitro. Rimuovere il PBS dalla camera di imaging e quindi riempirlo fino in cima con il buffer di commutazione.

Posizionare con cura un vetrino coprioggetto sulla parte superiore della camera, assicurandosi che non ci siano bolle e che l'intera camera sia coperta. Se si notano bolle, rabboccare con un buffer aggiuntivo o PBS. In caso contrario, le prestazioni del buffer possono diminuire.

La raccolta di dati di collegamento sparsi e di alta qualità è essenziale per il successo di questa procedura, quindi assicurarsi che i microscopi siano correttamente messi a fuoco e che vengano utilizzate le impostazioni di acquisizione corrette. Individuare una struttura fluorescente di interesse da riprendere. Selezionare l'angolo di illuminazione desiderato.

In questo caso, si consiglia un tappeto erboso o un angolo molto inclinato in quanto ciò migliora il rapporto segnale/rumore riducendo al minimo la luce sfocata, il che è particolarmente vantaggioso per i campioni cellulari. Prendi un riferimento all'immagine a frazione limitata della struttura prima dell'imaging della tempesta. Aumentare il laser di eccitazione a una potenza elevata corrispondente a circa due kilowatt per centimetro quadrato durante l'imaging con impostazioni della fotocamera di esposizione di 10 millisecondi e un tempo di ciclo di circa 50 hertz o fotogrammi al secondo.

Una volta che i quattro della flora sono passati a uno schema di lampeggio rado, raccogli 10.000 fotogrammi. Per iniziare questa ricostruzione. Apri il file RAINSTORM M da MATLAB ed eseguilo nella finestra del temporale.

Selezionare il file immagine da analizzare utilizzando il pulsante Sfoglia. Dovrebbe trattarsi di un file TIF. Modificare la larghezza dei pixel in modo che corrisponda ai dati grezzi del sistema di microscopio utilizzato per acquisire i dati.

Lasciare gli altri valori predefiniti. Premere il pulsante Elabora immagini e attendere che appaia un'immagine preliminare. La durata dell'elaborazione dipenderà dalle dimensioni del file, dalle specifiche del computer e dal numero di collegamenti candidati all'interno dei dati grezzi.

Per generare un'immagine aggiornata in super risoluzione, premi il pulsante Apri revisore e apparirà una seconda finestra. Premere il pulsante di regolazione del contrasto per modificare la visualizzazione dell'immagine come desiderato. In alcuni casi in cui l'immagine è molto scura, il valore massimo dovrebbe essere diminuito.

Utilizza la finestra del revisore per generare utili metriche di qualità dell'immagine e perfezionare ulteriormente l'immagine a super risoluzione. Lasciate i primi tre parametri di controllo qualità sui valori predefiniti rispettivamente di 5.000, 0,1 e 0,8-3,5. Aggiorna i conteggi per valore di fotone.

Modificare il limite di precisione della localizzazione per trovare un compromesso tra l'ottimizzazione della localizzazione media e la precisione rispetto al numero di localizzazione. Nell'immagine finale, si consigliano valori da 30 a 50 nanometri a seconda della qualità dei dati e del campione. Il fattore di scala di ricostruzione predefinito è cinque, che genererà pixel a super risoluzione di 32 nanometri, supponendo che il pixel all'interno delle immagini originali sia di 160 nanometri.

Se le immagini grezze hanno una dimensione dei pixel di 100 nanometri, questo produrrà immagini a super risoluzione con pixel di 20 nanometri. Aumenta il fattore di scala per produrre pixel a super risoluzione più piccoli. Nell'immagine finale, premi il pulsante Esegui revisore per generare un'immagine a super risoluzione aggiornata.

Premere il pulsante Visualizza istogrammi per visualizzare le metriche di qualità dell'immagine. Infine, premi il pulsante Salva immagine nel revisore per salvare tutti questi dati. Iniziare questa procedura generando un'immagine nello stesso modo illustrato in precedenza.

Premi il pulsante di tracciamento della casella nel revisore e fai clic e trascina una casella sul marcatore fiduciale sull'immagine recensita. Attendi fino a quando non viene visualizzata una nuova immagine, che visualizzerà le posizioni in scatola. Salvare questa immagine se lo si desidera, se l'oggetto di interesse è un marcatore fiduciale.

Come in questo caso, eseguire la correzione della deriva facendo clic sul pulsante di ancoraggio impostato seguito dal pulsante di sottrazione della deriva. Infine, fai di nuovo clic su Esegui revisore per generare una nuova immagine della tempesta. Un rivestimento riuscito di destrina dovrebbe produrre un monostrato fluorescente e i dati tipici della destrina sono mostrati in questa figura.

Le immagini a diffrazione limitata mostrano diverse concentrazioni di destrina prima dell'imaging della tempesta. Le ricostruzioni a super risoluzione hanno una dimensione dei pixel di 25 nanometri. Sono state raccolte 10.000 immagini con una dimensione del fotogramma di 1 28 x 1 28 pixel e i singoli fotogrammi sono mostrati da quella sequenza.

Ad alta concentrazione di destrina. Il monostrato fluorescente dovrebbe apparire relativamente uniforme, come illustrato in queste immagini e in questo segmento video. A concentrazioni più basse, i battiti di ciglia appariranno più radi e a fuoco.

Senza uno sfondo evidente durante questa fase di acquisizione dell'immagine con illuminazione laser costante, il numero di lampeggi diminuirà con il tempo, come illustrato da un confronto tra il fotogramma 2000 e il fotogramma 8.000 nel campione ad alta densità. La principale differenza tra le immagini a super risoluzione delle concentrazioni di destrine alte, medie e basse è la diminuzione del numero di localizzazioni. Questo grafico mostra una media di tre sequenze di 10.000 fotogrammi di ciascuna concentrazione di destrina in cui le barre di errore indicano la deviazione standard.

Tuttavia, questa relazione proporzionale tra la concentrazione delle molecole fluorescenti, il numero di lampeggi nei dati grezzi e il numero di localizzazioni, non è semplicemente lineare, come illustrato in questo grafico del numero di localizzazioni accettate per fotogramma. Utilizzando una media mobile di 100 fotogrammi a densità di molecole molto elevate, il software non è in grado di localizzare con successo le molecole durante l'imaging di qualsiasi campione. Un problema comune può essere la presenza di foschia fluorescente luminosa ma sfocata sull'immagine causata dalla forza del fluoro che si diffonde attraverso il mezzo.

Queste molecole fluorescenti staccate possono essere prevenute o rimosse aumentando il numero di passaggi di lavaggio con PBS prima di aggiungere il tampone di commutazione o aggiungendo un nuovo tampone di commutazione alla camera, elaborando e confrontando i dati di ciascuna sequenza di immagini si ottengono immagini a super risoluzione molto diverse. I pannelli C e D sono costruzioni di immagini a super risoluzione corrispondenti ai dati raccolti rispettivamente nei pannelli A e B. Questo grafico traccia il numero di localizzazioni accettate per fotogramma utilizzando una media mobile di 100 fotogrammi.

La linea rossa corrisponde alle sequenze di tempesta A e C dove c'è uno sfondo alto, la linea blu corrisponde a B e D dove lo sfondo è basso. Il numero di localizzazione accettato per le immagini corrispondenti ai dati di sfondo alti e bassi è mostrato nel secondo grafico. Queste tre immagini a diffrazione limitata mostrano i dati tipici dei filamenti di actina preformati attaccati alla superficie del vetro prima dell'aggiunta del tampone di commutazione e dell'imaging a tempesta.

Si possono vedere lunghezze variabili dei filamenti. I filamenti molto luminosi sono spesso diversi filamenti aggrovigliati insieme. La selezione di singoli filamenti relativamente luminosi piuttosto che di aree aggrovigliate consente di ottenere immagini di migliore qualità durante la fase di acquisizione.

I lampeggi luminosi a fuoco dovrebbero essere visibili lungo la lunghezza del filamento. Durante la fase di acquisizione e successivamente nei dati di processo si dovrebbe notare un lampeggio rado. Dovrebbe esserci un filamento continuo sottile nelle localizzazioni per fotogramma dovrebbe mostrare un graduale declino.

Tipicamente, il pieno con metà massimo o FWHM di un filamento è dato come stima empirica della risoluzione tracciando una linea retta attraverso una regione ingrandita del filamento di actina utilizzando la funzione del profilo grafico nell'immagine J e successivamente eseguendo un adattamento gaussiano. L'FWHM è calcolato come 43,2 nanometri. Un problema di localizzazione errata può verificarsi quando un certo numero di filamenti di actina si ramificano e/o si incrociano l'un l'altro elaborando sottoinsiemi di fotogrammi e confrontando i primi e gli ultimi 5.000 fotogrammi.

Un'immagine diversa viene prodotta nell'immagine a super risoluzione utilizzando i primi 5.000 fotogrammi. Molte localizzazioni sono visibili al centro dell'immagine. Tuttavia, quando si utilizzano gli ultimi 5.000 fotogrammi, pochissime di queste localizzazioni sono evidenti e rimangono solo i filamenti, anche se in qualche modo continui a causa del basso numero di localizzazioni nell'immagine.

Se si sospetta una densità di lampeggio troppo elevata, il confronto delle immagini con i dati di localizzazione per fotogramma può suggerire fortemente che questo problema si sta verificando durante la prima serie di fotogrammi. C'è un numero medio di localizzazioni per fotogramma di oltre 10 rispetto all'ultimo set di fotogrammi in cui è di circa quattro. Un altro potenziale problema nella microscopia a tempesta è la deriva, che si verifica quando il campione si muove rispetto alla lente dell'obiettivo Attraverso la fase di acquisizione dei dati, sebbene molto difficile da rilevare durante la fase di acquisizione dell'immagine, la deriva può essere rilevata nelle immagini a super risoluzione di strutture note come i filamenti di actina.

Il primo segno che potrebbe essersi verificata una deriva laterale è che la struttura è più grande del previsto. Ad esempio, con un pieno relativamente grande con metà del massimo rispetto ai dati del limite di precisione del temporale, in questo caso 90 nanometri rispetto a 67 nanometri. Un modo migliore per rilevare la deriva è confrontando le localizzazioni in funzione del tempo IE, vedendo se le localizzazioni nei frame successivi sono spostate rispetto a quelle nei frame iniziali.

Questo può essere visto chiaramente nel caso dei filamenti di actina quando vengono visualizzati con un codice colore. Utilizzando la funzione di tracciamento della scatola durante i temporali, come mostrato nei pannelli, le localizzazioni B e c vengono visualizzate con un colore corrispondente al numero di fotogramma di quando sono state acquisite. Ad esempio, le localizzazioni dall'inizio della sequenza di acquisizione sono blu, mentre le localizzazioni dalla fine della sequenza di acquisizione sono rosse.

I colori spostati indicano che si è verificata una deriva per misurare e correggere. Per le perle fluorescenti a deriva di 100 nanometri di diametro possono essere utilizzate come marcatori fiduciali, i numeri da uno a quattro mostrano singolarmente le perle ritagliate e ingrandite. In un esempio in cui c'è una deriva relativamente grave di circa 100 nanometri nel corso di tre minuti e 10 secondi durante la fase di acquisizione, la stessa funzione di tracciamento della scatola può essere utilizzata per codificare a colori e confermare che la deriva si è verificata poiché tutte e quattro le perle in questo esempio mostrate vicino alla deriva identica, è possibile selezionarne una in questo caso due perline da utilizzare come riferimento e sottrarre la deriva dalle altre perline.

Un confronto con il pannello E mostra che la deriva laterale è stata corretta. Infine, le cellule del tallone colorate con fattore di crescita epidermico possono essere utilizzate per fornire un esempio realistico di risoluzione dell'immagine. Nelle celle, il pannello A mostra un'immagine a diffrazione limitata di una parte di una cellula di hela focalizzata sulla superficie della cella basale, dove le caselle gialle indicano le regioni di interesse ingrandite mostrate nei pannelli B e C in contrasto con le regioni di interesse indistinte ingrandite nell'immagine a diffrazione limitata.

Le immagini a super risoluzione dovrebbero mostrare un misto di cluster, occasionalmente singoli pixel isolati. Gli ammassi avranno un diametro di circa 100 nanometri e probabilmente corrisponderanno alla formazione di pozzi e vescicole. I dati del percorso attraverso il quale l'EGF è prevalentemente downregolato ed endocitosizzato per fotogramma dal pannello D sono presentati nel grafico G.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare alcuni semplici campioni di prova, acquisire dati e ricostruire tempeste di alta qualità, vedere immagini con risoluzione.

Questi metodi aiuteranno a evitare alcune insidie comuni come la deriva e aiuteranno a ottimizzare la tua tempesta. Vedere gli esperimenti di risoluzione.