L'uso di un high-throughput In Vitro Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare biofilm di placca dentale multispecie rappresentativi dal punto di vista della composizione. Parallelamente all'analisi, ciò si ottiene creando prima un terreno rappresentativo e un inoculo. L'inoculo viene quindi introdotto nel chip microfluidico dopo un'incubazione notturna, si forma un biofilm all'interno del micro canale.

Infine, il biofilm viene lavato e colorato per la microscopia a scansione laser confocale a due confocali o la microscopia a epifluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le celle a flusso è che si tratta di un sistema ad alta produttività che consente di eseguire più esperimenti in parallelo utilizzando meno materiali e non richiedendo terreni di laboratorio artificiali. Per iniziare, raccogli campioni di saliva da una coorte di cinque o più volontari in singole provette di plastica da 50 millilitri.

Raccogli i campioni di saliva in un unico bicchiere di plastica posto sul ghiaccio. Evita di usare becher di vetro in questa configurazione poiché i biopolimeri di saliva tendono ad aderire alle superfici di vetro. Quindi, aggiungere un foro di tre al campione fino a quando la sua concentrazione finale è di 2,5 millimolari.

Mescolate il composto per 10 minuti con ghiaccio. Tirare tutto il contenuto in diversi tubi di plastica. Eseguire una centrifuga ad alta velocità per 30 minuti in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius per separare il particolato dal campione.

Trasferire la saliva in un contenitore fresco e sterile e scartare la frazione di pellet per preparare un terreno di crescita privo di batteri dal campione. Innanzitutto, diluire il campione privo di detriti giornalieri con tre volumi di acqua deionizzata. Quindi utilizzando un filtro a membrana a basso contenuto proteico da 0,22

Sterilizzare la saliva mantenendo la frazione post filtrata in frigorifero sul ghiaccio. Eloquent la soluzione sterilizzata e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Raccogliere campioni di saliva da una coorte di cinque o più volontari in provette di plastica sterili da 50 millilitri.

Estrarre i campioni di saliva in un becher di plastica pre-sterilizzato a temperatura ambiente o in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere glicerolo sterilizzato fino a raggiungere un 25% di glicerolo. Si raggiunge il 75% di miscela di saliva.

A differenza del protocollo del terreno di crescita in cui i contaminanti venivano rimossi con una fase di filtrazione, la tecnica sterile è importante qui per prevenire la contaminazione da batteri o funghi specifici non orali. Mescolare la soluzione di glicerolo salivare. Aliquotare bene la miscela di saliva e glicerolo e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per iniziare.

Acquistare o fabbricare un chip microfluidico con microcanali simili a quelli mostrati qui prima di inoculare i campioni nel microchip sia per il mezzo di crescita negativo dei batteri che per l'inoculo positivo dei batteri sul banco a temperatura ambiente. Agitare ogni tubo per cinque secondi per mescolare prima di procedere per l'esperimento principale, iniziare aggiungendo 100 microlitri del terreno di coltura nel serbatoio di uscita dei microchip. Utilizzando una pompa di controllo computerizzata, avviare un flusso medio attraverso il microcanale per due minuti.

A temperatura ambiente, ispezionare visivamente ciascun canale per garantire un corretto riempimento del fluido. Incubare il microchip a temperatura ambiente per 20 minuti. Questo rivestirà le pareti laterali del microcanale con un'impalcatura in biopolimero a cui il biofilm si ancorerà durante la crescita.

Quindi aspirare manualmente o il fluido rimanente dal serbatoio di uscita e trasferire questa frazione, che ora fungerà da carico di bilanciamento idrodinamico al serbatoio di ingresso. Dopo la deposizione dell'impalcatura del biopolimero, aggiungere 100 microlitri di inoculo positivo ai batteri nel serbatoio di uscita. Posizionare il microchip su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius e avviare il flusso inverso a taglio medio.

Viaggiando dall'uscita all'ingresso del serbatoio per esattamente sei secondi. Quindi spegnere la pompa e incubare il chip in condizioni statiche a 37 gradi Celsius per 40 minuti per facilitare l'adesione di batteri o funghi alle pareti laterali del microcanale. Quindi, rimuovere ed eliminare tutto l'inoculo dal serbatoio di uscita con una pipetta e riempire nuovamente lo stesso serbatoio aggiungendo un millilitro di terreno di coltura privo di batteri.

Incubare il microchip a 37 gradi Celsius per circa 20 ore a basso flusso per promuovere la crescita del biofilm all'interno del canale durante la crescita notturna. Pipettare tutte le soluzioni sia dai serbatoi di ingresso che da quelli di uscita. Applicare 100 microlitri di PBS sul serbatoio di ingresso e lavare il microcanale per 20 minuti.

In presenza di un basso flusso in avanti dall'ingresso all'uscita, il biofilm è ora pronto per la colorazione di morti vivi. Poco prima della colorazione con biofilm, preparare 100 microlitri della miscela di colorazione di vitalità come indicato nel protocollo di testo per ogni canale da colorare. Proteggere questa soluzione dall'esposizione alla luce fino a quando non è necessario colorare il biofilm, aspirare tutto il liquido rimanente dall'ingresso e riempire lo stesso serbatoio con 100 microlitri della miscela colorante di vitalità.

Quindi spingere la soluzione colorante attraverso il microcanale per 45 minuti. In condizioni di flusso a bassa quota a temperatura ambiente, assicurarsi di proteggere il chip dall'esposizione alla luce. Aspirare tutto il liquido rimanente dal serbatoio di ingresso e riempire con 100 microlitri di PBS.

Lavare il microcanale per 20 minuti a bassa quota a temperatura ambiente per rimuovere i coloranti non legati in eccesso. Il biofilm colorato è ora pronto per la microscopia a fluorescenza per il test dell'architettura tridimensionale dei biofilm. Le ricostruzioni digitali che utilizzano scansioni orizzontali con un microscopio confocale possono essere utilizzate per visualizzare l'intera struttura del film da qualsiasi angolazione obliqua.

Inoltre, l'analisi della colorazione di morti vivi può essere applicata allo stesso set di dati per studiare la dipendenza spaziale della vitalità cellulare all'interno del biofilm in funzione di diversi trattamenti chimici. Una volta che il biofilm è stato visualizzato, è possibile estrarre le cellule dai canali non colorati. Utilizzando acqua distillata che opera ad alto flusso di taglio, la flora del biofilm può quindi essere identificata dal DNA genomico mediante pirosequenziamento 4 5 4

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'aggiunta di specie o composti diversi, possono essere eseguiti per rispondere a domande diverse, come ad esempio cosa succede ai biofilm multispecie in varie condizioni.