L'uso di un high-throughput

Lo scopo generale di questa procedura è creare biofilm di placca dentale multispécie rappresentativi dal punto di vista compositivo. Parallelamente all'analisi, ciò si ottiene innanzitutto preparando un mezzo e un inóculo rappresentativi. L'inóculo viene quindi introdotto nel chip microfluidico dopo un'incubazione notturna, formando un biofilm all'interno del microcanale.

Infine, il biofilm viene lavato e colorato per l'analisi in situ mediante microscopia a scansione laser confocale o microscopia a fluorescenza in epifluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le celle a flusso, è che si tratta di un sistema ad alto rendimento che consente di eseguire più esperimenti in parallelo utilizzando minori quantità di materiali e senza richiedere mezzi di coltura artificiali in laboratorio. Per iniziare, raccogliere campioni di saliva da un gruppo di almeno cinque volontari in provette di plastica da 50 millilitri ciascuna.

Aspirare i campioni di saliva in un singolo becher di plastica posto sul ghiaccio. Evitare l'uso di becher di vetro in questa procedura, poiché i biopolimeri salivari tendono ad aderire alle superfici di vetro. Successivamente, aggiungere di-tio-treitolo al campione fino a raggiungere una concentrazione finale di 2,5 millimolare.

Agitare la miscela per 10 minuti su ghiaccio. Trasferire tutti i contenuti in diversi tubi di plastica. Eseguire una centrifugazione ad alta velocità per 30 minuti in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius per separare i particolati dal campione.

Trasferire il campione di saliva in un contenitore fresco e sterile e scartare la frazione del pellet per preparare un mezzo di crescita privo di batteri a partire dal campione. Per prima cosa, diluire il campione privo di detriti del giorno con tre volumi di acqua deionizzata. Successivamente, utilizzare un filtro a membrana da 0,22 micrometri a bassa ritenzione proteica.

Sterilizzare la saliva mantenendo la frazione filtrata in ghiaccio. Eluere la soluzione sterilizzata e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Raccogliere campioni di saliva da un gruppo di almeno cinque volontari in provette di plastica sterili da 50 millilitri.

Aspirare i campioni di saliva in un becher di plastica pre-sterilizzato a temperatura ambiente o in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere glicerolo sterilizzato fino a ottenere una miscela al 25% di glicerolo e al 75% di saliva.

A differenza del protocollo del mezzo di crescita in cui i contaminanti venivano rimossi mediante un passaggio di filtrazione, in questo caso è importante utilizzare una tecnica sterile per prevenire contaminazioni da batteri o funghi non specifici della cavità orale. Mescolare la soluzione di saliva e glicerolo. Aliquotare accuratamente la miscela di saliva e glicerolo e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento in cui saranno necessari.

Acquistare o fabbricare un chip microfluidico con microcanali simili a quelli mostrati qui prima di inoculare i campioni nel chip microfluidico, sia per il mezzo di crescita negativo per batteri sia per l'inoculo positivo per batteri, sul banco a temperatura ambiente. Vortexare ogni provetta per cinque secondi per mescolare prima di procedere con l'esperimento principale; iniziare aggiungendo 100 microlitri di mezzo di crescita nel serbatoio di uscita del microchip. Utilizzando una pompa controllata da computer, avviare il flusso di mezzo attraverso il microcanale per due minuti.

A temperatura ambiente, ispezionare visivamente ogni canale per assicurare un corretto riempimento del fluido. Incubare il microchip a temperatura ambiente per 20 minuti. Questo consentirà di rivestire le pareti laterali dei microcanali con un'impalcatura di biopolimero alla quale il biofilm si ancorerà durante la crescita.

Quindi aspirare manualmente o rimuovere il mezzo residuo dal serbatoio di uscita e trasferire questa frazione, che ora fungerà da carico equilibrante idrodinamico al serbatoio di ingresso. Dopo il deposito dello scaffold di biopolimero, aggiungere 100 microlitri dell'inoculo batterico positivo al serbatoio di uscita. Posizionare il microchip su una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius e avviare il flusso inverso di mezzo con taglio moderato.

Far viaggiare il campione dal serbatoio di uscita a quello di ingresso esattamente per sei secondi. Successivamente, spegnere la pompa e incubare il chip in condizioni statiche a 37 gradi Celsius per 40 minuti per favorire l'adesione di batteri o funghi alle pareti laterali dei microcanali. In seguito, rimuovere e scartare tutto l'inoculo dal serbatoio di uscita mediante pipetta e riempire nuovamente lo stesso serbatoio aggiungendo un millilitro di mezzo di crescita privo di batteri.

Incubare il microchip a 37 gradi Celsius per circa 20 ore in condizioni di flusso laminare al fine di favorire la crescita del biofilm all'interno del canale durante la coltivazione notturna. Aspirare con pipetta tutte le soluzioni dai serbatoi di ingresso e di uscita. Aggiungere 100 microlitri di PBS nel serbatoio di ingresso e lavare il microcanale per 20 minuti.

In condizioni di flusso laminare diretto dall'ingresso all'uscita, il biofilm è ora pronto per la colorazione vitale. Poco prima della colorazione del biofilm, preparare 100 microlitri della miscela di colorazione per la vitalità, come indicato nel protocollo testuale, per ogni canale da colorare. Proteggere questa soluzione dall'esposizione alla luce fino al momento in cui sarà necessaria per la colorazione del biofilm; aspirare tutto il liquido residuo dall'ingresso e riempire nuovamente lo stesso serbatoio con 100 microlitri della miscela di colorazione per la vitalità.

Quindi spingere la soluzione di colorazione attraverso il microcanale per 45 minuti. A flusso ridotto e a temperatura ambiente, assicurarsi di proteggere il chip dall'esposizione alla luce. Aspirare tutto il liquido rimanente dal serbatoio di ingresso e riempirlo nuovamente con 100 microlitri di PBS.

Sciacquare il microcanale per 20 minuti con un flusso a basso taglio a temperatura ambiente per rimuovere i coloranti non legati in eccesso. Il biofilm colorato è ora pronto per la microscopia a fluorescenza per analizzare la sua architettura tridimensionale. Ricostruzioni digitali ottenute mediante scansioni orizzontali al microscopio confocale possono essere utilizzate per visualizzare la struttura complessiva del film da qualsiasi angolazione obliqua.

Inoltre, l'analisi di colorazione vitale può essere applicata allo stesso set di dati per studiare la dipendenza spaziale della vitalità cellulare all'interno del biofilm in funzione di diversi trattamenti chimici. Una volta acquisite le immagini del biofilm, è possibile estrarre le cellule dai canali non colorati. Utilizzando acqua distillata operante a flusso di taglio elevato, la flora del biofilm può quindi essere identificata dal DNA genomico mediante pirosequenziamento 4 5 4.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'aggiunta di diverse specie o composti, al fine di rispondere a domande differenti, ad esempio cosa accade ai biofilm multispécie in diverse condizioni.