Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante
February 16th, 2014
Phage display è una tecnica potente per catturare proteine o porzioni di proteine che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.
L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire le interazioni proteiche con le molecole di esca immobilizzate. Ciò si ottiene acquisendo e immobilizzando prima l'esca. Il secondo passo consiste nell'introdurre la libreria di fagi da selezionare all'esca in condizioni che favoriscano il legame.
Successivamente, i fagi non legati vengono rimossi mediante lavaggio rigoroso. Mentre i fagi legati vengono utilizzati per infettare i batteri prima di essere recuperati. Il passaggio finale consiste nell'amplificare il fago legato per la successiva iterazione della selezione dell'affinità.
In definitiva, quando il titolo dei fagi si stabilizza, singole placche vengono selezionate e sequenziate per mostrare quali proteine hanno la più alta affinità per il ritardo immobilizzato nelle condizioni di legame sperimentale. Questo processo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle interazioni proteina-proteina. Questa procedura inizia con il posizionamento di una proteina ricombinante purificata sul fondo delle piastre per microtitolazione, come descritto nel protocollo di testo.
Il passo successivo consiste nell'inoculare 50 millilitri di terreno Luria burani con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina in un pallone di erlenmeyer da 250 millilitri con una singola colonia che è stata precedentemente coltivata come descritto nel protocollo di testo, incubare a 37 gradi Celsius, 200 RPM in un agitatore orizzontale e utilizzare uno spettrofotometro per monitorare la densità cellulare fino ad ottenere una densità ottica a 600 nanometri da 0,5 a 0,6. Quindi versare le cellule in una provetta Falcon da 50 millilitri o simile e mantenerle a quattro gradi Celsius fino a quando le cellule di utilizzo rimarranno vitali per circa una settimana il primo giorno. Preparati per la selezione dell'affinità come descritto nel protocollo di testo la mattina del secondo giorno.
Mettere nove fiasche vuote da 250 millilitri nelle pinze di un agitatore di incubazione, inoculare 500 millilitri di lal burani con 500 microlitri da una delle colture notturne di cellule BLT 5 4 0 3 infette da fagi iniziate la sera prima dopo aver posizionato il pallone nell'incubatore, accendere lo spettrofotometro e impostarlo per leggere l'assorbanza a 600 nanometri. Nel frattempo, rimuovere la piastra di microtitolazione a quattro gradi Celsius e rimuovere la pellicola di plastica. Rimuovere eventuali proteine non legate dalla piastra lavando 10 volte con 200 microlitri per pozzetto di soluzione salina tamponata X tris o TBS pH 7,5 e sbattendo la piastra a testa in giù sul tovagliolo di carta tra un lavaggio e l'altro.
Bloccare con 200 microlitri per pozzetto di reagente bloccante al 5% in TBS per un'ora. Con la piastra avvolta nella pellicola trasparente, lavare via la soluzione bloccante 10 volte con 200 microlitri di un X-T-B-S-T sbattendo la piastra a testa in giù su quattro strati di carta. Asciugamano tra un lavaggio e l'altro.
Da qui, utilizzare i puntali della barriera filtrante per evitare la contaminazione incrociata dei fagi. Pipettare 100 microlitri della libreria dei fagi con le proteine. Richiudere la piastra con pellicola trasparente e incubare a temperatura ambiente per un'ora.
Al termine di un'ora, rimuovere l'involucro di plastica dalla piastra e lavare immediatamente scuotendo il fago nei rifiuti a rischio biologico. Quindi utilizzare un pipettatore multiplo per aggiungere rapidamente 200 microlitri di un X-T-B-S-T a ciascuno. Bene, imposta un timer per un minuto.
Dopo un minuto, scuotere il tampone nei rifiuti a rischio biologico, capovolgere il piatto su un tovagliolo di carta e riposizionarlo sul banco. Ripetere le fasi di lavaggio 10 volte dopo il 10° lavaggio. Prelevare 200 microlitri di BLT 5 4 0 3 cellule dalla provetta da 50 millilitri a quattro gradi Celsius e trasferirle sul fondo di ciascuno dei nove pozzetti da cui è stato rimosso l'ultimo lavaggio.
Avvolgi le piastre nella pellicola trasparente e mettila a 37 gradi Celsius per 20 minuti per far sì che il fago ancora attaccato all'esca infetti i batteri alla fine dei 20 minuti. Scartare i piatti. Quindi, rimuovere 10 microlitri di batteri dal BSA a 25 gradi Celsius replicando un pozzetto e trasferire ai 990 microlitri di terreno contrassegnato uno.
Ripetere questo processo altre due volte per quel pozzetto, risultando in tre triplicati da uno a 100 dilu del fago da quel pozzetto, questa è la replicazione di BSA campionata tre volte. Queste diluizioni saranno utilizzate per stimare il titolo medio più o meno l'errore standard della media per quella replicazione di BSA, fare lo stesso per la replicazione due e tre di BSA per i tre pozzetti replicati della proteina esca avvelenata e per la proteina esca mettere da parte queste 27 provette EOR. Se i batteri nel pallone hanno una densità ottica compresa tra 0,6 e 1,0, decantare 50 millilitri di cellule dal pallone di felce in ciascuno dei 9 palloni da 250 millilitri.
Prendi i restanti 170 microlitri di batteri infetti da fagi BLT 5 4 0 3 nel pozzetto di replicazione BSA e aggiungili ai 50 millilitri di cellule contrassegnate come BSA rep. Uno. Fallo per tutti e nove i pozzetti prima di agitare i palloni nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, eseguire le diluizioni dalle 27 diluizioni iniziali prelevando 100 microlitri di LB con batteri dalla provetta Einor uno e aggiungendolo ai 900 microlitri di LB nella provetta Einor.
Quattro per la diluizione da 10 a meno terzo, scartare la punta della barriera del filtro con una nuova prima di prelevare 100 microlitri di LB con batteri dal tubo quattro e aggiungerlo ai 900 microlitri di LB in tubo eph. Sette per la diluizione da 10 a meno quarto, continuare la diluizione per tutti i triplicati di tutte le repliche di tutte le proteine e i trattamenti. Dovrebbero esserci 135 provette in totale una volta che le cellule hanno mentito.
Portare la coltura a 0,5 molari di cloruro di sodio aggiungendo cinque millilitri da uno stock di cloruro di sodio a cinque molari e trasferendo il campione in una centrifuga etichettata a 8.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi decantare il surnatante contenente il virus in una provetta di falco pulita e sterile da 50 millilitri. Aggiungere alcune gocce di cloroformio al surnatante decantato nel tubo Falcon.
Il surnatante può essere conservato a quattro gradi Celsius per il successivo ciclo di selezione dell'affinità il terzo giorno, pipettare 250 microlitri di celle VLT 5 4 0 3 da quattro gradi Celsius in ciascuna delle provette numerate in silicato bo precedentemente preparate. Quindi pipettare 100 microlitri dalla diluizione in provetta uno in 250 microlitri di cellule in provetta di silicato di fresa. Uno. Scaldare brevemente i primi cinque pollici della pipetta sulla fiamma e immergerla nell'aros superiore fuso.
Tirare su tre millilitri e versare rapidamente nella provetta sopra le cellule e il fago. Mescolare sbattendo con un dito mentre si tiene il tubo con l'altra mano, quindi versare il contenuto sul piatto. Inclinare la piastra e utilizzare la provetta per inseguire bolle e punti asciutti fino a quando l'intera piastra non è coperta dall'agros superiore.
Mettilo da parte in posizione verticale sulla panca a raffreddare. Scartare il tubo di silicato di boros. Espellere la punta della barriera del filtro e prenderne una nuova e continuare fino a quando tutta la diluizione non è stata placcata.
Recupera le piastre preparate dall'incubatrice man mano che sono esaurite, ma non più di sei alla volta o si raffreddano e l'agros superiore si solidifica troppo rapidamente, esamina la placca formata sulle piastre e scarta quelle con lisi confluente. Determinare quali delle diluizioni seriali rimanenti hanno prodotto un numero di placche sufficiente per consentire un accurato Cali Registrare il numero di placche da queste piastre e procedere al calcolo del titolo come descritto nel protocollo di testo al termine della selezione dell'affinità. Al quarto turno, selezionare 18 singole colonie di placca ben definite utilizzando una punta di pipetta gialla sterile.
Bagnare l'interno della punta con tris cloridrato pH 8,5 in una provetta einor. Quindi carota queste placche dalle piastre di tittering spingendo la punta attraverso una placca ben isolata direttamente nella piastra di Petri di plastica sottostante e aspirando il nucleo, espellere il nucleo in 100 microlitri di tris cloridrato pH 8,5 nell'apposito tubo prima di vorticare. In breve, scaldare 20 microlitri da questo volume a 65 gradi Celsius per 10 minuti e procedere con la PCR e il sequenziamento come descritto nel protocollo di testo mostrato qui sono i risultati tipici del titolo campionando più volte, i conteggi finali stimati non sono così suscettibili agli errori di pipettaggio e una stima più accurata del titolo effettivo e della variazione intorno a questo.
Si stima che si ottenga un titolo fagico crescente preferenzialmente per l'esca non avvelenata all'aumentare del numero di cicli di selezione dell'affinità. Fornisce anche la certezza che la tecnica stia funzionando. La ritenzione di una percentuale crescente di inserto contenente fagi in pozzetti per esche non avvelenati all'aumentare del numero di selezioni di affinità è anche di buon auspicio dopo cicli avanzati di selezione di affinità.
Un aumento del numero di fagi recuperati in modo indipendente che hanno l'inserto rispetto al primo ciclo e la sedimentazione di questi ampliconi su alcune bande di dimensioni identiche è una buona indicazione che particolari cloni vengono selezionati nella selezione di affinità Seguendo questa procedura. Altri metodi come l'ibride ease two possono essere eseguiti per convalidare le interazioni scoperte dal phage display.
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Panoramica
Questo articolo descrive la tecnica di display dei fagi utilizzata per identificare le interazioni proteiche con molecole esca immobilizzate. Il protocollo consente una selezione per affinità efficiente e l'identificazione degli interagenti.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Interazioni proteiche
- Tecnologia di display dei fagi
- Seleziona per affinità
Sfondo
- Il display dei fagi è un metodo per studiare le interazioni proteiche.
- Comporta l'uso di una libreria di cDNA.
- Le molecole esca immobilizzate sono essenziali per il processo.
- La tecnica consente l'identificazione di interagenti specifici.
Obiettivo dello studio
- Scoprire le interazioni proteiche con molecole esca immobilizzate.
- Fornire un protocollo dettagliato per il display dei fagi.
- Migliorare l'efficienza della selezione per affinità.
Metodi utilizzati
- Acquisizione e immobilizzazione delle molecole esca.
- Introduzione della libreria di fagi all'esca.
- Lavaggio rigoroso per rimuovere i fagi non legati.
- Infezione di batteri con fagi legati per il recupero.
Risultati principali
- Identificazione con successo degli interagenti proteici.
- Amplificazione efficiente dei fagi legati.
- Dimostrazione dell'efficacia del protocollo.
- Possibili applicazioni in vari studi biologici.
Conclusioni
- Il display dei fagi è uno strumento prezioso per studiare le interazioni proteiche.
- Il protocollo descritto migliora il processo di identificazione.
- Ulteriori ricerche possono espandere le sue applicazioni in biologia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Phage display enables high-confidence identification of protein-protein interactions through iterative affinity selection and titer monitoring, supporting target validation in early discovery. By requiring independent clone recovery and amplicon consistency, the method reduces false positives and increases predictive confidence in bait interactors. This workflow informs lead identification by prioritizing targets with reproducible binding evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins that consistently bind immobilized bait under stringent conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through replicate screening and titer progression tracking to distinguish specific from nonspecific binding.
- Predictive Value: Increasing phage titer and insert retention across rounds provide quantitative evidence for target engagement strength and specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated phage libraries for downstream screening by enriching for high-affinity binders through controlled washing and amplification steps.
- Reproducibility: Monitoring phage titer after each selection round provides a quantifiable metric to assess selection efficacy and control consistency across replicates.
- Scalability: The protocol accommodates multiple baits in parallel using microtiter plates, enabling medium-throughput interaction profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirmed interactors from phage display can be forwarded to orthogonal validation (e.g., co-IP, yeast two-hybrid) to support preclinical target assessment.
- Mechanistic De-risking: Isolation of independent plaques and sequencing of amplicons helps confirm that observed binding reflects specific protein-protein interactions rather than artifacts.
- Risk-Adjusted Advancement: The settling of amplicons on identically sized bands after multiple rounds signals clonal enrichment, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead identification, providing biochemical evidence to inform downstream validation efforts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about protein interactions by selecting for phage encoding proteins that bind bait under defined conditions.
- Screening: Generates enriched phage pools suitable for further characterization through iterative binding and amplification.
- Analytics: Titer measurements and amplicon analysis enable quantitative assessment of selection progress and clone enrichment.
- Translational Research: Identified interactors serve as candidates for functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The standardized workflow can be applied across multiple baits and targets, supporting platform reuse in interaction discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by requiring reproducible recovery of independent clones presenting the same protein.
- Operational Value: Employs standardized washing, blocking, and infection steps to minimize variability and cross-contamination.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by filtering out nonspecific binders early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on binding consistency and enrichment metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including phage handling, bacterial culture, and nucleic acid manipulation.
- Depends on access to incubators, shakers, spectrophotometers, and centrifugation equipment for titer determination.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., TBS, blocking agents) and strict adherence to washing protocols to control background.
- Involves adaptation considerations when using non-protein baits, as blocking and washing conditions may require optimization.
- Practical limitations include the time required for multiple affinity selection rounds and the need for careful plaque picking to avoid confluent lysis.
