Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire le interazioni proteiche con molecole esca immobilizzate. Questo viene raggiunto innanzitutto acquisendo e immobilizzando l'esca. Il secondo passaggio consiste nell'introdurre alla molecola esca la libreria di fagi da sottoporre a screening, in condizioni che favoriscano il legame.

Successivamente, i fagi non legati vengono rimossi mediante lavaggi rigorosi. Mentre i fagi legati vengono utilizzati per infettare i batteri prima del recupero. L'ultimo passaggio consiste nell'amplificare i fagi legati per la successiva iterazione della selezione per affinità.

Infine, quando il titolo del fago raggiunge un plateau, vengono selezionati singoli chiarimenti e sottoposti a sequenziamento per identificare quali proteine presentano la maggiore affinità per il bersaglio immobilizzato nelle condizioni sperimentali di legame. Questo processo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni proteina-proteina. La procedura inizia con la purificazione della proteina ricombinante, che viene posta sul fondo di piastre microtitolazione come descritto nel protocollo testuale.

Il passaggio successivo consiste nell'inoculare 50 millilitri di mezzo Luria burani contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina in un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri con una singola colonia precedentemente coltivata come descritto nel protocollo testuale, incubare a 37 gradi Celsius, 200 giri al minuto, in uno shaker orizzontale e utilizzare uno spettrofotometro per monitorare la densità cellulare fino al raggiungimento di una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,5 e 0,6. Successivamente, versare le cellule in una provetta Falcon da 50 millilitri o equivalente e mantenere a quattro gradi Celsius fino all'uso; le cellule di solito rimangono vitali per circa una settimana. Il primo giorno prepararsi per la selezione per affinità come descritto nel protocollo testuale nella mattinata del secondo giorno.

Posizionare nove beute Erlenmeyer da 250 millilitri vuote e sterilizzate in autoclave nelle pinze di un agitatore incubatore; inoculare 500 millilitri di brodo LAL Burani con 500 microlitri di una delle colture notturne di cellule BLT5403 infettate con fago, avviate la sera precedente. Dopo aver posizionato la beuta nell'incubatore, accendere lo spettrofotometro e impostarlo per leggere l'assorbanza a 600 nanometri. Nel frattempo, rimuovere la piastra microtitolata da 4 gradi Celsius e togliere la pellicola di plastica. Rimuovere qualsiasi proteina non legata dalla piastra lavando 10 volte con 200 microlitri per pozzetto di soluzione salina tamponata al tris 1X (TBS) a pH 7,5, battendo la piastra capovolta su un foglio di carta assorbente tra un lavaggio e l'altro.

Bloccare con 200 microlitri per pozzetto di reagente bloccante al 5% in TBS per un'ora. Con la piastra avvolta nella pellicola trasparente, rimuovere la soluzione bloccante eseguendo 10 lavaggi con 200 microlitri di TBS-T 1X, sbattendo la piastra a testa in giù su quattro strati di carta da filtro tra un lavaggio e l'altro.

Da questo punto in poi, utilizzare punte con barriera filtrante per evitare la contaminazione incrociata da fagi. Pipettare 100 microlitri della libreria di fagi insieme alle proteine. Richiudere la piastra con pellicola trasparente e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo un'ora, rimuovere la pellicola di plastica dalla piastra e lavare immediatamente agitando per eliminare il fago nel rifiuto biologico. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere rapidamente 200 microlitri di X-T-B-S-T in ciascun pozzetto. Impostare un timer per un minuto.

Dopo un minuto, versare il tampone nel contenitore per rifiuti biologici, battere la piastra capovolta su un fazzoletto di carta e riposizionarla sul bancone. Ripetere i passaggi di lavaggio per 10 volte dopo il decimo lavaggio. Prelevare 200 microlitri di cellule BLT 5 4 0 3 dal tubo falcon da 50 millilitri a quattro gradi Celsius e trasferirli sul fondo di ciascuna delle nove pozzette da cui è stato rimosso l'ultimo lavaggio.

Avvolgere le piastre con pellicola trasparente e posizionarle a 37 gradi Celsius per 20 minuti, in modo che ogni fago ancora attaccato all'esca possa infettare i batteri. Trascorsi 20 minuti, svolgere le piastre. Successivamente, prelevare 10 microlitri di batteri dalla replica del pozzetto BSA a 25 gradi Celsius e trasferirli nei 990 microlitri di mezzo contrassegnati con uno.

Ripetere questo processo altre due volte per quella pozzetta, ottenendo tre replicati di un diluizione da uno a 100 del fago da quella pozzetta; si tratta della replicazione di BSA uno campionata tre volte. Queste diluizioni saranno utilizzate per stimare la titolazione media più o meno l'errore standard della media per quella replicazione di BSA. Eseguire lo stesso procedimento per la replicazione due e tre di BSA, per le tre pozzette replicate della proteina esca avvelenata e per il set della proteina esca. Mettere da parte queste 27 provette EOR. Se i batteri nel matraccio hanno una densità ottica compresa tra 0,6 e 1,0, versare 50 millilitri di cellule dal matraccio in ciascuno dei 9 matracci Erlenmeyer da 250 millilitri.

Prendere i rimanenti 170 microlitri di batteri BLT 5 4 0 3 infettati da fagi nella pozzetta di replica BSA uno e aggiungerli ai 50 millilitri di cellule contrassegnati come BSA rep.Uno. Eseguire questa operazione per tutte e nove le pozzette prima di agitare i flaconi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, eseguire diluizioni a partire dalle 27 diluizioni iniziali prelevando 100 microlitri di LB con batteri dal tubo Einor uno e aggiungendoli ai 900 microlitri di LB nel tubo einor.

Quattro per la diluizione 10 alla meno tre, scartare la punta con barriera filtro e prenderne una nuova prima di prelevare 100 microlitri di LB con batteri dal tubo einor quattro e aggiungerli ai 900 microlitri di LB nel tubo eph. Sette per la diluizione 10 alla meno quattro, proseguire con la diluizione per tutti i triplificati di tutte le replicazioni di tutte le proteine e trattamenti. Dovrebbero esserci 135 tubi in totale una volta che le cellule si sono lisate.

Portare la coltura a cloruro di sodio 0,5 molare aggiungendo cinque millilitri da una soluzione madre di cloruro di sodio 5 molare e trasferendo il campione in un flacone per centrifuga etichettato; centrifugare a 8.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare quindi il soprannatante contenente il virus in un tubo falcon sterile e pulito da 50 millilitri. Aggiungere alcune gocce di cloroformio al soprannatante decantato nel tubo falcon.

Il surnatante può essere conservato a quattro gradi Celsius per il successivo ciclo di selezione per affinità al terzo giorno; pipettare 250 microlitri di cellule VLT 5 4 0 3 da quattro gradi Celsius in ciascuno dei tubi di prova in borosilicato precedentemente preparati e numerati. Quindi pipettare 100 microlitri dalla diluizione nel tubo einor uno nei 250 microlitri di cellule nel tubo di prova in borosilicato uno. Riscaldare brevemente i primi cinque pollici della pipetta sulla fiamma ed immergerla nella paraffina fusa.

Estrarre tre millilitri e versarli rapidamente nel tubo da saggio sopra le cellule e il fago. Mescolare agitando con un dito mentre si tiene il tubo con l'altra mano, quindi versare il contenuto sulla piastra. Inclinare la piastra e utilizzare il tubo da saggio per eliminare bolle d'aria e zone asciutte finché l'intera piastra non è ricoperta dall'agarosio superiore.

Posizionarlo in posizione verticale sul banco per farlo raffreddare. Smaltire il tubo in borosilicato. Espellere la punta con barriera filtrante e prelevarne una nuova, quindi procedere finché non sono state piastrate tutte le diluizioni.

Rimuovere le piastre preparate dall'incubatrice man mano che vengono esaurite, ma non più di sei alla volta, poiché si raffredderebbero troppo rapidamente e l'agar sopra si solidificherebbe in fretta; esaminare le placche formate sulle piastre e scartare quelle con lisi confluenti. Determinare quali delle diluizioni seriali rimanenti hanno prodotto un numero sufficientemente basso di placche da permettere un conteggio accurato. Registrare il numero di placche provenienti da queste piastre e procedere al calcolo del titolo come descritto nel protocollo testuale alla fine della selezione per affinità. Nel quarto giro, selezionare 18 colonie di placche ben definite utilizzando la punta sterile gialla di una pipetta.

Inumidire l'interno della punta con cloridrato di tris a pH 8,5 in un tubo einor. Quindi estrarre i core di queste placche dalle piastre di titolazione inserendo la punta attraverso una placca ben isolata fino alla piastra di Petri in plastica sottostante, aspirando il core ed espellendolo in 100 microlitri di cloridrato di tris a pH 8,5 nel tubo appropriato, prima di vorticare. Riscaldare brevemente 20 microlitri di questo volume a 65 gradi Celsius per 10 minuti e procedere quindi con la PCR e il sequenziamento come descritto nel protocollo testuale riportato qui; questi sono risultati tipici di titolo ottenuti mediante campionamenti ripetuti, i cui conteggi finali stimati sono meno soggetti a errori di pipettaggio e forniscono una stima più accurata del titolo reale e della variabilità associata.

Le stime da pozzetto a pozzetto mostrano un aumento del titolo di fagi in modo preferenziale per l'esca non avvelenata all'aumentare del numero di cicli di selezione per affinità. Questo fornisce inoltre la conferma che la tecnica sta funzionando correttamente. La ritenzione di una percentuale crescente di fagi contenenti l'inserto nei pozzetti con esca non avvelenata, all'aumentare del numero di selezioni per affinità, è anch'essa un risultato positivo dopo cicli avanzati di selezione per affinità.

Un aumento del numero di fagi recuperati in modo indipendente che presentano un inserto, rispetto al primo ciclo, e la comparsa di questi ampliconi in poche bande di identica dimensione costituiscono un buon indicatore del fatto che determinati cloni stiano venendo selezionati durante la selezione per affinità seguendo questa procedura. Altri metodi, come il test del doppio ibrido, possono essere eseguiti per validare le interazioni scoperte mediante esposizione fagica.