Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Questo esperimento di microscopia a fluorescenza valuta la vitalità dei singoli batteri associati alle cellule ospiti e determina la vitalità batterica in diverse posizioni subcellulari. In primo luogo, per identificare i batteri esterni, esporre le cellule infette a un reagente fluorescente specifico per la permeasi batterica, l'ospite infetto, in presenza di coloranti fluorescenti che discriminano i batteri vitali da quelli non vitali in base all'integrità della membrana batterica. Quindi, per indicare dove si trovano i batteri all'interno delle cellule ospiti, incubare le cellule infette con un anticorpo accoppiato in fluorescenza a un marcatore di interesse.

Le immagini immunofluorescenti risultanti possono determinare la percentuale di batteri vitali all'interno e all'esterno delle cellule ospiti e la localizzazione subcellulare dei batteri intracellulari vitali rispetto a quelli non vitali. A differenza dei saggi per il conteggio delle colonie, dei saggi di protezione della gentamicina e della microscopia elettronica, questo metodo consente la valutazione diretta della vitalità dei singoli batteri. Può anche rivelare se i batteri in diversi compartimenti subcellulari hanno differenze nella loro vitalità.

A dimostrare questa procedura sarà Brittany Johnson, una studentessa laureata del mio laboratorio, Atory to cells grown on circular glass cover slips in 24, well plates aggiungere batteri di interesse e incubare per il tempo desiderato. Sciacquare delicatamente le cellule infette una volta. Quindi aggiungi l'anticorpo accoppiato Alexa Fluor 6 4 7 o una lectina batterica specifica per rilevare i batteri esterni e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.

Dopo due risciacqui, aspirare il terreno e aggiungere 0,5 millilitri di soluzione colorante morta viva contenente citonove e iodio propidio. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi risciacquare due volte con mop di cloruro di magnesio. Capovolgere i vetrini coprioggetto a faccia in giù sui vetrini.

Sigillare con smalto trasparente. Acquisisci le immagini entro 30 minuti utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri descritti nel protocollo di testo per etichettare i batteri. Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di DPI in un terreno definito e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.

Ora infetta le cellule aderenti con batteri marcati con DPI. Non fissare le cellule con aldeidi o solventi organici. Sciacquare le celle una volta.

Quindi aggiungere Alexa Fluor 6, 4, 7 accoppiato anticorpo o lectina e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo due risciacqui con tampone mops, aggiungere un anticorpo accoppiato Alexa Fluor 5 5, 5 contro il marcatore subcellulare di interesse e incubare per 20 minuti Dopo due, RIN con tampone mops, lavare le cellule una volta con mop cloruro di magnesio. Quindi aspirare il terreno e aggiungere 0,4 micromolari cyt green incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente al buio, rinare le cellule due volte in mop, cloruro di magnesio.

Quindi lavare le cellule. Ancora una volta in mops cloruro di magnesio per cinque minuti. Capovolgere i vetrini coprioggetto a faccia in giù sui vetrini, sigillare con smalto trasparente, acquisire le immagini dei vetrini entro 30 minuti sul microscopio a fluorescenza.

In questo esperimento, i neutrofili umani sono stati infettati dalla gonorrea. La lectina di soia accoppiata Alexa Fluor 6 4 7 rileva la gonorrea extracellulare. Quindi la vitalità fluorescente verde muore e lo ioduro di propidio fluorescente rosso sono stati aggiunti in presenza di saponina, che sequestra il colesterolo per permeare preferenzialmente le membrane plasmatiche della cellula ospite, ma non permea la membrana della gonorrea nelle cellule infette, il nucleo della cellula eucariotica si colora sia con citonove che con ioduro di propidio.

Queste immagini di neutrofili infetti da gonorrea sono state generate utilizzando i coloranti di vitalità cyt talk screen e dpi. Il colorante ioduro di propidio non è stato utilizzato in quanto emette fluorescenza sia nel canale rosso che in quello ultravioletto al microscopio a fluorescenza. Tutta la gonorrea si colora di dpi, ma solo i batteri con membrane compromesse si colorano di verde bue.

Il batterio intracellulare non vitale ha un anello di colorazione per il CD 63 che circonda i batteri. Questo anello indica che i granuli primari sono arricchiti in questo fagosoma. Il batterio intracellulare vitale manca di colorazione per CD 63, indicando che i granuli primari non sono arricchiti nel suo fagosoma. Preso.

Insieme, i dati mostrano una correlazione tra la vitalità della gonorrea e i residenti in un fagosoma primario negativo al granulo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la vitalità dei batteri nelle cellule ospiti. Inoltre, sarai in grado di determinare la vitalità dei batteri localizzati in diversi compartimenti nelle cellule ospiti utilizzando anticorpi diretti contro questi compartimenti subcellulari.