Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un microcanale endoteliale a sezione trasversale circolare multi-profondità su un chip, che imita la geometria 3D dei microvasi in vivo e funziona sotto un flusso di profusione continuo controllato. Ciò si ottiene fabbricando prima fotolitograficamente uno stampo master con una rete di microcanali a sezione trasversale semicircolare utilizzando un fotoresist positivo a rifusione. Il secondo passo consiste nell'utilizzare lo stampo master per replicare due microcanali in polidimetilsoano, allinearli e legarli per creare una rete cilindrica di microcanali.

Successivamente, le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana vengono posizionate all'interno della rete di microcanali prima di coltivare le cellule in condizioni di perfusione continua controllata del mezzo per un periodo di tempo compreso tra quattro giorni e due settimane. In definitiva, un monostrato di cellule a confluenza indicato dalla membrana in piedi e dai nuclei in piedi al microscopio viene sviluppato lungo la superficie interna della rete di microcanali Calcolo di microvasi funzionali in cui potrebbe fornire una piattaforma per lo studio di fenomeni vascolari complessi. Tuttavia, i saggi convenzionali di singoli microvasi come i saggi di migrazione delle cellule anso e quindi due saggi di formazione e i saggi ad anello destro e mobile sono limitati a ricreare singoli microvasi rispetto alla geometria tridimensionale e al controllo continuo del flusso.

Il vantaggio principale delle nostre tecniche, il nostro metodo di microfabbricazione esistente, è che può fabbricare convenzionalmente una rete di canali microfluidici multi-profondità che imita le complesse geometrie 3D dei micro recipienti in vivo che hanno sezioni trasversali arrotondate. Permette anche di progettare sistemi biomagnetici microvascolari, che approssimativamente obbediscono più lentamente e mantengono il flusso del fluido a un livello richiesto in modo che il canale complessivo resistente sia basso e il flusso che abbiamo perso è più uniforme in tutta la rete, dimostrando che la procedura sarà uno studente laureato dal mio laboratorio. Questa procedura inizia con la fabbricazione di uno stampo master fotoresist costituito da micro canali con diametri compresi tra 30 micron e 60 micron come dettagliato nel protocollo di testo, trasferire brevemente il fotoresist di riflusso dal frigorifero a quattro gradi Celsius alla camera bianca 24 ore prima dell'uso e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente.

Iniziare con lo spin coating dello strato di fotoresist a rifusione positiva su un substrato di silicio pre-pulito seguendo la procedura nel protocollo di testo. Quindi esporre il fotoresist alla luce UV attraverso una maschera modellata prima di sviluppare i micro canali modellati. Infine, dopo il riflusso, creare una rete di microcanali a sezione trasversale semicircolare.

Una volta che lo stampo master è pronto, preparare la soluzione di polimetilsoano o PDMS con un rapporto in peso di 10 a una base per l'agente indurente e mescolarla accuratamente utilizzando un miscelatore centrifugo planetario. Colata della soluzione PDMS sullo stampo master fotoresist rifuso. Mettere il PDMS colato in un essiccante per 15 minuti fino a Degas.

Se necessario, utilizzare azoto gassoso per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Cuocere il PDMS in forno a una temperatura di 60 gradi Celsius per tre ore per consentirne la polimerizzazione. Quindi rimuovere lo strato PDMS polimerizzato dallo stampo master.

Utilizzare un perforatore affilato per creare fori di ingresso e uscita praticando fori nella rete di canali. Pulire la superficie del PDMS utilizzando azoto gassoso. Trattare due strati PDMS con plasma di ossigeno per 30 secondi all'interno di un pulitore al plasma a una pressione di esercizio di 45 miglia e una portata di ossigeno di 3,5 piedi cubi al minuto.

Quindi allineare manualmente le superfici del PDMS al microscopio ottico. Utilizzare una goccia d'acqua se necessario per un migliore controllo dell'allineamento. Infine, cuocere il dispositivo in forno a 60 gradi Celsius per 30 minuti per ottenere una coltura di adesione permanente.

Cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana o VE in terreno di coltura con L-glutammina integrata con siero bovino fetale al 10%. Trattare il dispositivo con plasma di ossigeno per cinque minuti con una pressione di esercizio di 45 millit e una portata di ossigeno di 3,5 piedi cubi al minuto. Quindi caricare il dispositivo con acqua deionizzata e trattare con luce UV per otto ore in una cappa di biosicurezza laminare per la sterilizzazione.

Un giorno prima che le cellule siano pronte, lavare il dispositivo con una soluzione salina tamponata con fosfato o PBS e quindi rivestire con fibronectina. Incubare in frigorifero a quattro gradi Celsius per una notte. Una volta che le cellule sono confluenti, raccoglierle prima sciacquando le cellule con una soluzione salina tamponata e poi trattando le cellule con tripsina EDTA dopo l'aggiunta di tripsina.

Incubare le cellule per due-sei minuti a 37 gradi Celsius. Dopo che la tripsina, la izzazione è completa, neutralizzare la tripsina EDTA con una soluzione neutralizzante della tripsina. Contare le cellule, quindi centrifugarle prima di risus.

La sospensione in terreno di coltura con l'8% di destrina la destrina viene utilizzata per aumentare la viscosità del mezzo e favorire un migliore posizionamento e adesione delle cellule dopo il rivestimento FI enc ENC. Lavare il dispositivo con un XPBS, quindi caricare il dispositivo con terreno di coltura prima di incubare a una temperatura di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, le cellule in un terreno di coltura con destrina all'8% a una concentrazione compresa tra tre e 4 milioni di cellule per millilitro vengono caricate nel dispositivo.

Posizionare una goccia di 20 microlitri di cellule in un ingresso del dispositivo e inclinarla per introdurre le cellule nel canale microfluidico. Dopo 15-20 minuti, le cellule inizieranno ad attaccarsi alle pareti laterali dei canali. Ruotare il dispositivo ogni 15 minuti per creare una distribuzione più uniforme delle celle.

Se necessario, è possibile eseguire un carico aggiuntivo. Dopo cinque o sei ore di coltura statica, le cellule attaccate inizieranno a diffondersi completamente. Impostare la perfusione a lungo termine utilizzando un sistema di pompa a siringa telecomandato con un flusso costante di 10 microlitri all'ora, la perfusione può essere regolata per una portata più elevata e può durare per un periodo di tempo compreso tra quattro giorni e due settimane.

Quando le celle raggiungono la confluenza all'interno del dispositivo, per prima cosa lavare il dispositivo con un XPBS per rimuovere completamente il mezzo. Quindi caricare il dispositivo con colorante rosso diluito dopo l'incubazione del dispositivo al buio per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavalo con terreno di coltura per fermare la colorazione.

Una lunga incubazione del colorante può causare tossicità cellulare e disadesione. Quindi caricare il dispositivo con colorante blu diluito con un XPBS, incubare al buio per cinque minuti a temperatura ambiente prima di lavare accuratamente il dispositivo con un XPBS. Esaminare la colorazione delle cellule con un microscopio ottico invertito.

Se la colorazione è buona, caricare i microcanali con il mezzo di fissaggio, quindi immergere il dispositivo nel mezzo di fissaggio e coprirlo completamente con un foglio di alluminio. Conservare il dispositivo in frigorifero a una temperatura di quattro gradi Celsius per evitare che il dispositivo si secchi e si sbianca, il dispositivo fisso è ora pronto per l'imaging confocale, che può essere eseguito con un microscopio confocale a scansione laser, microscopia elettronica a scansione e microscopia ottica. Sono stati utilizzati per caratterizzare il fotoresist di riflusso e il canale PDMS replicato prima e dopo l'avanzamento del riflusso.

Le caratteristiche geometriche della rete di microcanali PDMS sono state caratterizzate e mostrate qui. Le sezioni trasversali circolari degli stampi PDMS mostrano le dimensioni del canale a ciascun livello di diramazione. I risultati mostrano che la tecnica di riflusso con fotoresist può creare reti di canali ramificati multi-profondità con un approccio più conveniente con le tecniche di riflusso con fotoresist e consentire la progettazione dei sistemi biomimetici microvascolari, che obbediscono approssimativamente alla legge di Murray mostrata qui sono immagini al microscopio utilizzando un colorante fluorescente a membrana cellulare in rosso e un colorante nucleare cellulare in blu.

Le viste della sezione trasversale circolare hanno rivelato che il VE allineava la superficie interna di una rete cilindrica di microcanali in diverse regioni ramificate. A causa delle complesse geometrie della microvascolarizzazione in vivo, il monitoraggio in tempo reale di questi piccoli vasi è difficile. Il chip sviluppato basato su P DM S offre buone proprietà ottiche e consente l'imaging di alta qualità e in tempo reale dei microcanali endoteliali, come mostrato in questo filmato confocale del rivestimento cellulare lungo la rete di canali circolari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare il riflusso per questa modalità di massa. Crea una rete di micro canali PDMS a sezione circolare, carica le cellule endocellulari nei dispositivi e imposta la profusione dei terreni a lungo termine. In sintesi, i microcanali endoserializzati sviluppati su un chip forniscono un approccio rapido e riproducibile per creare reti di microcanali multi-profondità a sezione trasversale circolare, che imitano la geometria dei microvasi InVivo.

Questa procedura illustra l'uso di capacità uniche nella microproduzione avanzata e nelle tecnologie micro alimentari per creare un modello microvascolare con un controllo continuo della perfusione a lungo termine, nonché l'alta qualità e la capacità di imaging in tempo reale con la crescente utilità dei canali micro alimentari per applicazioni di biologia cellulare, ingegneria tissutale e bioingegneria. I micro canali serializzati endo su un chip sono un potenziale saggio per la ricerca microvascolare.