Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare su un chip microcanali endoteliali a sezione trasversale circolare con profondità multipla, che imitano la geometria tridimensionale dei microvasi in vivo, e che funzionano sotto un flusso di perfusione continuo controllato. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando litograficamente mediante luce un modello maestro con una rete di microcanali a sezione trasversale semicircolare, utilizzando un fotoresist positivo ri-fondibile. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare il modello maestro per replicare due microcanali in poli-dimetil-silossano, allinearli e sigillarli insieme al fine di creare una rete di microcanali cilindrici.

Successivamente, le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana vengono posizionate all'interno della rete di microcanali prima di coltivare le cellule in condizioni controllate di perfusione continua del mezzo per un periodo compreso tra quattro giorni e due settimane. Alla fine, si sviluppa un monolayer cellulare confluito, indicato dalla marcatura della membrana e dalla marcatura dei nuclei osservata al microscopio, lungo la superficie interna della rete di microcanali, consentendo il calcolo di microvasi funzionali che potrebbero fornire una piattaforma per lo studio di fenomeni vascolari complessi. Tuttavia, i tradizionali saggi su singoli microvasi, come i saggi di migrazione delle cellule anso, i saggi di formazione di anSo2 e i saggi di anello di contrazione miotica, sono limitati nella ricreazione di singoli microvasi rispetto alla geometria tridimensionale e al controllo del flusso continuo.

Il principale vantaggio delle nostre tecniche, il nostro metodo esistente di microfabbricazione, è che consente di realizzare convenzionalmente una rete di canali microfluidici a profondità multipla che imita le complesse geometrie tridimensionali dei microvasi in vivo, caratterizzati da sezioni trasversali arrotondate. Permette inoltre di progettare sistemi biomagnetici microvascolari, che approssimativamente obbediscono a flussi più lenti e mantengono il flusso del fluido a un livello richiesto, in modo che la resistenza complessiva del canale sia bassa e il flusso residuo sia più uniforme in tutta la rete. A dimostrazione della procedura sarà presente uno studente laureato del mio laboratorio. Questa procedura inizia con la fabbricazione di uno stampo master in fotoresist costituito da microcanali con diametri compresi tra 30 micron e 60 micron, come descritto dettagliatamente nel protocollo testuale. In breve, trasferire il fotoresist da riscaldamento dal frigorifero a quattro gradi Celsius al laboratorio pulito 24 ore prima dell'uso, permettendogli di raggiungere la temperatura ambiente.

Iniziare applicando per spin coating lo strato di resist foto positivo a rifusione su un substrato di silicio pre-pulito seguendo la procedura descritta nel protocollo testuale. Successivamente, esporre il resist alla luce UV attraverso una maschera con il disegno desiderato, prima di sviluppare i microcanali strutturati. Infine, dopo la rifusione, creare una rete di microcanali con sezione trasversale semicircolare.

Una volta pronto il modello maestro, preparare la soluzione di polimetil silossano o PDMS in rapporto ponderale di 10 a 1 tra base e agente indurente, mescolandola accuratamente mediante un miscelatore planetario centrifugo. Versare la soluzione di PDMS sul modello maestro in resist sviluppato termicamente. Posizionare il PDMS versato in un desiccator per 15 minuti per la degasificazione.

Se necessario, utilizzare gas azoto per rimuovere eventuali bolle residue. Cuocere il PDMS in un forno a una temperatura di 60 gradi Celsius per tre ore per consentirne la reticolazione. Successivamente, rimuovere lo strato di PDMS reticolato dallo stampo maestro.

Utilizzare un punzone affilato per creare i fori di ingresso e di uscita praticando dei fori nella rete del canale. Pulire la superficie del PDMS utilizzando gas azoto. Trattare due strati di PDMS con plasma di ossigeno per 30 secondi all'interno di un pulitore al plasma a una pressione operativa di 45 milato e una portata di ossigeno di 3,5 piedi cubi al minuto.

Quindi allineare manualmente le superfici del PDMS sotto un microscopio ottico. Utilizzare una goccia d'acqua se necessario per un migliore controllo dell'allineamento. Infine, cuocere il dispositivo in un forno a 60 gradi Celsius per 30 minuti per ottenere un'adesione permanente.

Cellule endoteliali primarie di vena ombelicale umana o VE in mezzo di coltura con L-glutammina integrato con 10% di siero fetale bovino. Trattare il dispositivo con plasma di ossigeno per cinque minuti con una pressione operativa di 45 millitorr e una portata di ossigeno di 3,5 piedi cubi al minuto. Successivamente, caricare il dispositivo con acqua deionizzata e trattare con luce UV per otto ore in una cappa biosicura laminare per sterilizzazione.

Un giorno prima che le cellule siano pronte, lavare il dispositivo con soluzione salina fosfato una volta o PBS, quindi rivestirlo con fibronectina. Incubare in frigorifero a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza, raccoglierle lavando prima le cellule con soluzione salina tamponata con HEPES, quindi trattando le cellule con tripsina EDTA dopo l'aggiunta della tripsina.

Incubare le cellule da due a sei minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della tripsinizzazione, neutralizzare la tripsina EDTA con la soluzione neutralizzante per la tripsina. Contare le cellule, quindi centrifugarle prima della risospensione.

Sospendere nel mezzo di coltura con dextrina all'8%: la dextrina viene utilizzata per aumentare la viscosità del mezzo, favorendo un migliore appiattimento e attacco delle cellule dopo il rivestimento con FI enc ENC. Lavare il dispositivo con un XPBS, quindi caricare il dispositivo con il mezzo di coltura prima di incubare a una temperatura di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, le cellule in mezzo di coltura con dextrina all'8% a una concentrazione di tre-quattro milioni di cellule per millilitro vengono caricate nel dispositivo.

Posizionare una goccia di 20 microlitri di cellule in un ingresso del dispositivo e inclinarlo per introdurre le cellule nel canale microfluidico. Dopo 15-20 minuti, le cellule inizieranno ad aderire alle pareti laterali dei canali. Ruotare il dispositivo ogni 15 minuti per ottenere una distribuzione delle cellule più uniforme.

Se necessario, si può effettuare un caricamento aggiuntivo. Dopo cinque-sei ore di coltura statica, le cellule aderenti inizieranno a espandersi completamente. Impostare una perfusione a lungo termine utilizzando un sistema di pompa per siringa controllato a distanza con un flusso costante di 10 microlitri all'ora; la perfusione può essere regolata a un flusso maggiore e può durare per un periodo compreso tra quattro giorni e due settimane.

Quando le cellule raggiungono la confluenza all'interno del dispositivo, lavare innanzitutto il dispositivo con un XPBS per rimuovere completamente il mezzo. Successivamente, caricare il dispositivo con un colorante rosso diluito, seguito da un'incubazione del dispositivo al buio per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare con mezzo di coltura per arrestare la colorazione.

Un'incubazione prolungata con il colorante può causare tossicità cellulare e distacco delle cellule. Quindi, caricare il dispositivo con il colorante blu diluito in un XPBS e incubare al buio per cinque minuti a temperatura ambiente, prima di lavare accuratamente il dispositivo con un XPBS. Esaminare la colorazione cellulare al microscopio ottico invertito.

Se la colorazione è buona, caricare i microcanali con il mezzo fissante, quindi immergere il dispositivo nel mezzo fissante e coprirlo completamente con pellicola di alluminio. Conservare il dispositivo in frigorifero a una temperatura di quattro gradi Celsius per evitare che si secchi e si sbianchi. Il dispositivo fissato è ora pronto per l'analisi mediante microscopia confocale, che può essere eseguita con un microscopio confocale a scansione laser, microscopia elettronica a scansione e microscopia ottica. Sono stati utilizzati per caratterizzare il photoresist durante il reflow e il canale PDMS replicato prima e dopo il processo di reflow.

Le caratteristiche geometriche della rete di microcanali in PDMS sono state caratterizzate e sono mostrate qui. Sezioni trasversali circolari degli stampi in PDMS mostrano le dimensioni dei canali a ogni livello di ramificazione. I risultati dimostrano che la tecnica di riporto del photoresist può creare reti di canali ramificate con profondità multiple in modo più agevole mediante tecniche di riporto del photoresist e consentono la progettazione di sistemi biomimetici microvascolari, che seguono approssimativamente la legge di Murray; mostrati qui sono immagini al microscopio ottenute utilizzando un colorante fluorescente per la membrana cellulare in rosso e un colorante per il nucleo cellulare in blu.

Le viste trasversali circolari hanno rivelato che l'endotelio riveste la superficie interna di una rete di microcanali cilindrici in diverse regioni di biforcazione. A causa delle geometrie complesse della microvascolarizzazione in vivo, il monitoraggio in tempo reale di questi piccoli vasi è difficoltoso. Il chip sviluppato in PDMS offre buone proprietà ottiche e consente un'immagine di alta qualità e in tempo reale dei microcanali endoteliali, come mostrato in questo filmato confocale del rivestimento cellulare lungo la rete di canali circolari.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare il reflow per questa modalità massiva. Creare una rete di microcanali in PDMS con sezione trasversale circolare, caricare le cellule endoteliali nei dispositivi e impostare un'infusione prolungata di mezzo. In sintesi, i microcanali endoteliali in serie sviluppati su chip forniscono un approccio rapido e riproducibile per creare reti di microcanali con sezione trasversale circolare e diverse profondità, che imitano la geometria dei microvasi in vivo.

Questa procedura illustra l'uso di capacità uniche nell'ambito della microfabbricazione avanzata e delle tecnologie microfluidiche per creare un modello microvascolare con controllo di perfusione continua a lungo termine, nonché con elevata qualità e capacità di imaging in tempo reale, grazie all'utilizzo crescente di canali microfluidici per applicazioni di biologia cellulare, ingegneria tissutale e bioingegneria. I microcanali serializzati endoteliali su un chip rappresentano un saggio potenziale per la ricerca microvascolare.