Microiniezione cella singola per l'analisi cellulare comunicazione
February 26th, 2017
Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.
Ciao, mi chiamo Anael. Lavoro presso la Fondazione Oswaldo Cruz presso il Laboratorio di Comunicazione Cellulare. Studiamo qui i recettori P2 e la gap injection nel contesto del sistema immunitario e del fegato.
Oggi vi presenterò la microiniezione di cellule. Le iniezioni di gap svolgono alcuni ruoli fisiologici come la trasmissione delle sinapsi, le contrazioni cardiache e altri. Per questa tecnica, possiamo studiare se le iniezioni di gap sono funzionali o meno.
Ok, vediamo i componenti di base della configurazione della microiniezione. Qui abbiamo il microscopio a fluorescenza invertita dove vedremo le cellule. Questa è una telecamera CCD per registrare i risultati.
Abbiamo qui il generatore di corrente che introdurremo il colorante nella cella. Successivamente abbiamo il supporto a cui è collegato il microelettrodo. E il micro-manipolatore che è collegato al supporto e consente il movimento del microelettrodo nei tre assi, Z, Y e X. Prima di iniziare l'esperimento, dobbiamo fare il microelettrodo.
Usiamo questo capillare in vetro borosilicato e questa apparecchiatura chiamata polare. Fissiamo qui il capillare borosilicato. Questo filamento di tungsteno lo riscalderemo per fare due microelettrodi.
Ora il filamento di tungsteno si riscalda e l'onda qui la tireremo verso il basso per creare i due microelettrodi. Facile. Il nostro primo passo è riempire il microelettrodo con il colorante. Un consiglio qui è che devi riempire solo la punta con pochi microlitri per fare l'esperimento.
Non è necessario riempire tutto. Nota con maggiori dettagli. Riempi solo la punta.
Iniziamo un esperimento. Abbiamo qui le cellule nella capsula di Petri, in una soluzione di sodio. Il filo d'argento collegato al generatore di corrente.
Ora dobbiamo collegare i microelettrodi nello stadio di testa. Qui nello stadio di testa abbiamo un altro filo d'argento collegato anche al generatore di corrente. Una volta collegato il microelettrodo, possiamo metterlo all'interno della vasca.
Si noti che la punta della pipetta tocca con cautela la vasca. Questa procedura viene eseguita con molta attenzione per evitare lo schianto della punta sul fondo della capsula di Petri. Una volta all'interno della vasca, possiamo andare al microscopio per cercare l'ombra della micropipetta.
Si consiglia di iniziare a guardare nella lente di ingrandimento. Quando troviamo l'ombra della pipetta, possiamo spostare il microelettrodo verso la cella utilizzando il micromanipolatore. Una volta che è molto vicino alla cella, possiamo fare un test per verificare se il microelettrodo non è ostruito.
Come vedremo dopo. Qui vediamo la micropipetta e stiamo regolando la micropipetta molto vicino alla cellula. Possiamo vedere il movimento delle cellule a destra e a sinistra.
Quindi passiamo al filtro, filtro a fluorescenza. Possiamo applicare l'impulso iperpolarizzante per verificare se la punta della pipetta non è ostruita. Poiché la micropipetta si trova all'interno della cellula, possiamo applicare un impulso iperpolarizzante per caricare la cella con il colorante.
Usiamo qui il colorante giallo libero sciolto. Dopo aver caricato la cella con il colorante, se le celle vicine sono collegate da iniezioni di gap, aspettiamo alcuni minuti e vedremo le cellule vicine schiarirsi per la diffusione del colorante da queste iniezioni di gap. Nel nostro esperimento possiamo vedere cinque celle, contrassegnate da stelle, che mostrano fluorescenza.
Qui c'è un buon esempio di un esperimento di microiniezione in cellule epiteliali del timo, in A e B.In le figure C e D, mostrano una microiniezione in una cellula inerte timomica di giallo libero sciolto e un altro colorante, non permeabile all'iniezione gap mostrato nell'inserto. La linea cellulare epiteliale timoica di figura E e F microiniettata con giallo libero sciolto e nell'inserto giallo libero sciolto e un blocco di iniezione gap. I risultati mostrano che il giallo libero sciolto non si è diffuso alle cellule vicine.
Successivamente vediamo una microiniezione in cellule epiteliali timiche, in presenza di desametasone e la quantificazione in B.Il desametasone ha aumentato il grado di accoppiamento, come mostrato nella figura B.Su 100 iniezioni, il numero di tre o quattro cellule collegate era più frequente in presenza di questo farmaco. Spero di poter aiutare i principianti a fare questa importante tecnica per lo studio della comunicazione cellulare. Grazie e ciao.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo descrive la tecnica di microiniezione unicellulare di Lucifer Yellow per visualizzare la comunicazione cellulare attraverso le giunzioni comunicanti nelle cellule vive. Fornisce consigli pratici per i ricercatori per valutare l'accoppiamento cellulare dovuto a giunzioni comunicanti funzionali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Communicazione cellulare
- Neuroscienza
- Immunologia
Background
- Le giunzioni comunicanti svolgono ruoli critici nei processi fisiologici.
- Sono coinvolte nella trasmissione sinaptica e nelle contrazioni cardiache.
- Comprendere la loro funzionalità è essenziale per vari studi biologici.
- Lucifer Yellow è un colorante fluorescente utilizzato per la visualizzazione.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare la tecnica di microiniezione per studiare le giunzioni comunicanti.
- Valutare il grado di accoppiamento cellulare nelle cellule vive.
- Fornire approfondimenti sulla funzionalità delle giunzioni comunicanti.
Metodi utilizzati
- Microiniezione unicellulare di Lucifer Yellow.
- Visualizzazione della comunicazione cellulare.
- Valutazione delle giunzioni comunicanti funzionali.
- Adattabilità della tecnica per altri coloranti fluorescenti.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo della comunicazione cellulare attraverso le giunzioni comunicanti.
- Valutazione dell'accoppiamento cellulare dimostrata.
- Tecnica applicabile a vari coloranti fluorescenti sotto i 1.000 Dalton.
- Approfondimenti sui ruoli fisiologici delle giunzioni comunicanti forniti.
Conclusioni
- La tecnica di microiniezione è efficace per studiare le giunzioni comunicanti.
- Lucifer Yellow si rivela uno strumento utile per la visualizzazione.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della comunicazione cellulare nei sistemi viventi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
