Microiniezione cella singola per l'analisi cellulare comunicazione

Ciao, mi chiamo Anael. Lavoro presso la Fondazione Oswaldo Cruz presso il Laboratorio di Comunicazione Cellulare. Studiamo qui i recettori P2 e la gap injection nel contesto del sistema immunitario e del fegato.

Oggi vi presenterò la microiniezione di cellule. Le iniezioni di gap svolgono alcuni ruoli fisiologici come la trasmissione delle sinapsi, le contrazioni cardiache e altri. Per questa tecnica, possiamo studiare se le iniezioni di gap sono funzionali o meno.

Ok, vediamo i componenti di base della configurazione della microiniezione. Qui abbiamo il microscopio a fluorescenza invertita dove vedremo le cellule. Questa è una telecamera CCD per registrare i risultati.

Abbiamo qui il generatore di corrente che introdurremo il colorante nella cella. Successivamente abbiamo il supporto a cui è collegato il microelettrodo. E il micro-manipolatore che è collegato al supporto e consente il movimento del microelettrodo nei tre assi, Z, Y e X. Prima di iniziare l'esperimento, dobbiamo fare il microelettrodo.

Usiamo questo capillare in vetro borosilicato e questa apparecchiatura chiamata polare. Fissiamo qui il capillare borosilicato. Questo filamento di tungsteno lo riscalderemo per fare due microelettrodi.

Ora il filamento di tungsteno si riscalda e l'onda qui la tireremo verso il basso per creare i due microelettrodi. Facile. Il nostro primo passo è riempire il microelettrodo con il colorante. Un consiglio qui è che devi riempire solo la punta con pochi microlitri per fare l'esperimento.

Non è necessario riempire tutto. Nota con maggiori dettagli. Riempi solo la punta.

Iniziamo un esperimento. Abbiamo qui le cellule nella capsula di Petri, in una soluzione di sodio. Il filo d'argento collegato al generatore di corrente.

Ora dobbiamo collegare i microelettrodi nello stadio di testa. Qui nello stadio di testa abbiamo un altro filo d'argento collegato anche al generatore di corrente. Una volta collegato il microelettrodo, possiamo metterlo all'interno della vasca.

Si noti che la punta della pipetta tocca con cautela la vasca. Questa procedura viene eseguita con molta attenzione per evitare lo schianto della punta sul fondo della capsula di Petri. Una volta all'interno della vasca, possiamo andare al microscopio per cercare l'ombra della micropipetta.

Si consiglia di iniziare a guardare nella lente di ingrandimento. Quando troviamo l'ombra della pipetta, possiamo spostare il microelettrodo verso la cella utilizzando il micromanipolatore. Una volta che è molto vicino alla cella, possiamo fare un test per verificare se il microelettrodo non è ostruito.

Come vedremo dopo. Qui vediamo la micropipetta e stiamo regolando la micropipetta molto vicino alla cellula. Possiamo vedere il movimento delle cellule a destra e a sinistra.

Quindi passiamo al filtro, filtro a fluorescenza. Possiamo applicare l'impulso iperpolarizzante per verificare se la punta della pipetta non è ostruita. Poiché la micropipetta si trova all'interno della cellula, possiamo applicare un impulso iperpolarizzante per caricare la cella con il colorante.

Usiamo qui il colorante giallo libero sciolto. Dopo aver caricato la cella con il colorante, se le celle vicine sono collegate da iniezioni di gap, aspettiamo alcuni minuti e vedremo le cellule vicine schiarirsi per la diffusione del colorante da queste iniezioni di gap. Nel nostro esperimento possiamo vedere cinque celle, contrassegnate da stelle, che mostrano fluorescenza.

Qui c'è un buon esempio di un esperimento di microiniezione in cellule epiteliali del timo, in A e B.In le figure C e D, mostrano una microiniezione in una cellula inerte timomica di giallo libero sciolto e un altro colorante, non permeabile all'iniezione gap mostrato nell'inserto. La linea cellulare epiteliale timoica di figura E e F microiniettata con giallo libero sciolto e nell'inserto giallo libero sciolto e un blocco di iniezione gap. I risultati mostrano che il giallo libero sciolto non si è diffuso alle cellule vicine.

Successivamente vediamo una microiniezione in cellule epiteliali timiche, in presenza di desametasone e la quantificazione in B.Il desametasone ha aumentato il grado di accoppiamento, come mostrato nella figura B.Su 100 iniezioni, il numero di tre o quattro cellule collegate era più frequente in presenza di questo farmaco. Spero di poter aiutare i principianti a fare questa importante tecnica per lo studio della comunicazione cellulare. Grazie e ciao.