Name: Lanalisi del trascrittoma di singole cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Impara a isolare singole cellule da colture neuronali primarie di ratto per l'analisi del trascrittoma mediante amplificazione aRNA. Questa tecnica consente di studiare l'espressione genica a livello cellulare individuale.

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Grazie a voi Kevin Miyashiro per la placcatura e il mantenimento di colture cellulari, al Dott. Terri Schochet per la fornitura di colture cellulari per le immagini incluse in questo documento. Inoltre, grazie a Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley, e Tiina Pertiz per l&#39;ingresso sulla procedura ARNA. Il finanziamento per questo lavoro è stato dal National Institute on Aging, l&#39;Istituto Nazionale per la Salute Mentale e Risorse Umane fondi Fact Finder dal Commonwealth della Pennsylvania.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr. Eberwine è un inventore sul brevetto ARNA che ha ottenuto la licenza per le tecnologie LBS in cui il Dr. Eberwine è un azionista.

Note e risoluzione dei problemi <ul><li> Si consiglia di assumere prima e dopo le immagini mostrano che la cellula bersaglio è stato isolato e che la penombra rimanente è stato lasciato intatto. </li><li> Se troppa soluzione sta entrando la pipetta come sei raccolta, è possibile utilizzare 3 vie Luer-Lock raccordi e lo stantuffo della siringa per tenere a pressione positiva nelle tubazioni. Il volume desiderato varia a seconda del tipo di lavorazione, ma fino a 5 microlitri dovrebbe andare bene per la maggior parte delle applicazioni. </li></ul> Consigli generali su tecniche di biologia molecolare <ul><li> Vortex tutti i tubi magazzino e spin giù prima di aggiungere ad una reazione. MAI enzimi vortice. </li><li> Mescolare bene le reazioni prima di aggiungere l&#39;enzima per garantire che il buffer è alla giusta concentrazione. </li><li> Mantenere le scorte di enzimi a -20 ° C se possibile usando un stratacooler. In caso contrario, rimuovere destra prima dell&#39;uso, tenere su ghiaccio, e tornare immediatamente a -20 ° C. </li><li> Sempre fare Master Mix quando si prepara più di una reazione per ridurre gli errori di pipettamento. Calcolare il volume richiesto in base al numero di campioni e aggiungere 10-20%. </li><li> Conservare l&#39;RNA a -80 ° C a ritardare il degrado. L&#39;RNA è più stabile memorizzati nel buffer per apurination ritardare di RNA che si verifica in condizioni di acidità. </li></ul> Schema generale della procedura ARNA Figura 4A illustra il primo round della procedura di Arna. Nella reazione primo filone, la poli-T porzione di T7-oligo (dT) primer seleziona per le specie di mRNA (lungo rettangolo bianco) legandosi alla coda polyA. Alcuni microRNA sono anche polyadenylated e saranno catturati da questa procedura. Ancora più importante, tuttavia, l&#39;RNA più abbondante nella cellula, RNA ribosomiale, no. Questo oligo funge da primer per trascrittasi inversa per sintetizzare un filamento complementare del cDNA (rettangolo grigio lungo) con l&#39;mRNA come modello. La parte del T7 T7-oligo (dT) primer incorpora il promotore T7 RNA polimerasi a telaio con la sequenza antisenso per l&#39;mRNA di partenza. Questo è utilizzato in seguito nella reazione di trascrizione in vitro. Successivamente, l&#39;mRNA in mRNA / DNA ibrido creato nel passaggio precedente è parzialmente idrolizzato dalla RNasi H creando RNA &quot;primer&quot; (piccoli rettangoli bianchi) simile ai frammenti di Okazaki creato nella sintesi del filamento di DNA in ritardo di sviluppo. DNA polimerasi I utilizza frammenti di RNA di sintesi del DNA primi utilizzando il DNA complementare al mRNA come modello. Quando raggiunge il frammento successivo RNA, i suoi 5 &#39;a 3&#39; nucleasica rimuove il ribonucleotidi e li sostituisce con deossiribonucleotidi. La DNA ligasi è aggiunto a legare ogni filoni in cui la sostituzione del filo guida non è completa. DNA polimerasi T4 è aggiunta per riempire nelle zone in cui frammenti di RNA servito come primer iniziale per la DNA polimerasi I creando un blunt-ended a doppio filamento cDNA che viene poi purificato prima di effettuare la reazione IVT. Nella reazione IVT, T7 RNA polimerasi si lega al promotore T7 incorporato nella doppia elica del DNA e sintetizza le molecole di RNA antisenso (lunghi rettangoli neri) con il senso del filo come modello. Questo serve come il passo di amplificazione in cui si producono migliaia di molecole di RNA antisenso da ogni molecola doppio filamento del DNA (Figura 4A). Il secondo turno, come illustrato nella figura 4B, inizia con una reazione di trascrizione inversa che è leggermente diverso da quello del primo turno dato che di partenza è l&#39;RNA antisenso (solido rettangolo nero) e manca la coda polyadenylated che è stato interessato dagli T7-oligo (dT) primer al primo turno. Pertanto, questa reazione è innescata con primer random (piccoli rettangoli grigi) e successivamente denaturato RNA. La reazione secondo filone è poi innescata dalla T7-oligo (dT) primer, che si lega alla poli-Una sequenza all&#39;estremità 3 &#39;dell&#39;RNA senso creati nella reazione precedente trascrizione inversa. Un&#39;altra reazione IVT viene eseguita nello stesso modo come nel primo turno. Il secondo turno è di solito ripetuta almeno una volta per raggiungere tre turni di amplificazione da una singola cellula. Applicazioni Le tecniche che abbiamo presentato in questo articolo può essere tradotto in un gran numero di applicazioni. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule possono essere modificati per essere utilizzati in fette acuta. 14 Anche se tecnicamente più impegnativi, gli stessi principi si applicano in questa preparazione alternativa. Inoltre, se la dimensione della pipetta è leggermente adattato, registrazioni della fisiologia delle cellule può essere fatta prima della raccolta consentendo una ben controllata studio dei meccanismi molecolari alla base uscite fisiologiche. Un&#39;altra piccola modifica è quello di isolare i processi dal soma cellulare. 15 Per questa applicazione, raccogliere corpi cellulari con una pipetta e poi tornare con una pipetta fresca e raccogliere 100-300 dendrit identificatoes o assoni al tubo di raccolta 16. Una volta che le cellule sono state raccolte, i confronti di abbondanze mRNA e composizioni può essere fatta tra diverse e anche all&#39;interno della popolazione stessa cella. Incorporando biotinilato-UTP nel ARNA terzo turno per l&#39;analisi dei microarray permette di determinare questi mRNA abbondanze relative. La composizione della popolazione mRNA originale può essere determinata anche dopo la procedura ARNA utilizzando sequenziamento di nuova generazione. L&#39;ARNA amplificato può essere utilizzato anche per confermare il fenotipo delle cellule studi di conversione in cui vengono transfettate una serie completa degli mRNA da un tipo di cellula in un tipo cellulare diverso al fine di indurre transizione del fenotipo del tipo di cellula quest&#39;ultima in quella dei primi, una procedura sviluppata dal laboratorio e conosciuto come Tiper. 17 Questi studi sono particolarmente utili per lo studio di stati di malattia e fenotipi cellulari e tali studi sono attualmente in corso in laboratorio. RT-PCR o qPCR può essere eseguita sul materiale amplificato per confermare l&#39;espressione di specifici geni delle cellule. Inoltre, le valutazioni di efficienza di trasfezione o trasduzione può essere fatta a livello di singola cellula. Vantaggi e limiti Come affermato in astratto, l&#39;isolamento di singole cellule per l&#39;analisi elimina gli effetti media visto con l&#39;analisi di popolazioni cellulari eterogenee. Questi effetti media travisare abbondanze mRNA all&#39;interno di una singola cellula da un eccesso di rappresentanza trascrizioni abbondante e mediazione e la prevenzione di molte rilevamento a basso abbondanza trascrizioni. Citometria a flusso può essere utilizzato per ordinare le singole cellule, ma questo metodo richiede la conoscenza di marcatori specifici delle cellule e costose attrezzature. 18 microdissezione catturare laser sia con sistemi di acquisizione IR o UV microdissezione laser permettono di singola cellula e perfino catturare subcellulare, ma richiede cellule di interesse per essere situati sulla superficie delle sezioni molto sottili. 19 Simile alla citometria a flusso, microdissezione laser capture richiede costose attrezzature. Uno dei principali vantaggi della tecnica di base collezione elettrodo sopra descritti è che importanti dati elettrofisiologici possono essere ottenute dalla cella di interesse prima del raccolto, permettendo l&#39;analisi funzionale del trascrittoma e da eseguire sulla cella stessa. 20 A lato negativo della nostra tecnica è che richiede esperienza nell&#39;uso di micromanipolatori. Gli investigatori familiarità con micromanipolatori troveranno questa tecnica molto intuitivo, tuttavia, gli individui con nessuna esperienza quali sarà necessario per familiarizzare con i movimenti fini necessari. Inerenti a qualsiasi tecnica di amplificazione è l&#39;amplificazione preferenziale di alcune trascrizioni in base alle dimensioni e alla composizione dei nucleotidi. 4,6,7 reazione a catena della polimerasi (PCR), tecniche di base come reverse-trascrizione reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) e la rapida amplificazione di cDNA estremità (RACE) comportano l&#39;amplificazione esponenziale di trascrizioni, mentre l&#39;ARNA procedura di amplificazione risultati di amplificazione lineare. Così, uno dei principali vantaggi della procedura ARNA risiede nella sua capacità di preservare meglio l&#39;abbondanza relativa di mRNA trascritti da solo linearmente amplificando eventuali errori o distorsioni che si verificano nel processo di amplificazione al contrario di amplificare esponenzialmente detto errori e pregiudizi. La procedura ARNA accoppiata con analisi microarray permette la comparazione delle abbondanze mRNA tra singole cellule di morfologia simili o differenti, trattati o non trattati. Inoltre, il materiale amplificato possono essere presentate per il sequenziamento di nuova generazione. 5,8 Tuttavia, occorre prestare attenzione a queste analisi in quanto, in contrasto con l&#39;uso di primer a caso per la procedura, l&#39;oligo-dT primer procedura sopra descritta amplificazione pregiudizi del 3 &#39;estremità del mRNA e in genere si traduce in un accorciamento leggera successive materiale amplificato con ogni turno. Si deve prestare attenzione nel valutare i risultati dei microarray con metodi standard come alcune false chiamate assenti possono derivare da un po &#39;accorciato materiale amplificato. Inoltre, i risultati mentre sequenziamento sarà davvero fornirà la piena 5 &#39;sequenza della maggior parte degli mRNA originale, il 5&#39; sequenze di alcuni mRNA possono perdere. Per queste ragioni, il numero di giri di amplificazioni dovrebbe essere limitato.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>coprioggetti Spiegelglas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Piatti di coltura Nunc 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Per la preparazione di soluzioni utilizzate per la coltura cellulare e il risciacquo dei coverslip</td></tr><tr><td>Polid-L-lisina PM 70-150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, ultrapura</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM con Earle&amp;rsquo;sali s e glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Per la semina delle cellule</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero equino</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM con Earle&amp;rsquo;sali e L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Integratore privo di siero B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in vetro borosilicato (diametro esterno 1,5 mm, lunghezza 100 mm)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Qualsiasi pipetta in vetro borosilicato funzionerà, purché si raggiunga la dimensione corretta del lume. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Qualsiasi soluzione funzionerà purché i componenti non siano&amp;rsquo;non interferisca con eventuali processi successivi (ad es. nessun Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; o Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>siringa da 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Ago</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>La calibrazione dipende dal diametro delle pipette</td></tr><tr><td>miscela di dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Personalizzato</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per il secondo filamento (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Fornito con tampone per il secondo filamento</td></tr><tr><td>Ligasi del DNA di E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnasi H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Primeri casuali</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptasi inversa</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>nel kit (18080-044) è incluso il buffer per il primo filamento (Y02321) e DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatrice a fiamma/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter dispone di molti altri modelli, molti dei quali sono discussi nel manuale</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Molti altri micromanipolatori possono essere utilizzati, come i modelli più recenti di Eppendorf</td></tr><tr><td>Portapipetta</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Varierà in base al micromanipolatore e al diametro esterno della pipetta</td></tr><tr><td>Kit Bioanalyzer RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi del trascrittoma di singole cellule

Transcriptome Analysis of Single Cells

Molte tecniche di analisi di espressione genica si basano su materiale isolato da popolazioni eterogenee di cellule da omogenati di tessuti o cellule in coltura. 1,2,3 Nel caso del cervello, regioni come l&#39;ippocampo contiene una disposizione complessa di diversi tipi di cellule, ciascuna con profili di mRNA distinte. La capacità di raccogliere le singole cellule consente una più approfondita indagine sulle differenze molecolari tra e all&#39;interno di popolazioni cellulari. Descriviamo un metodo semplice e rapido per la raccolta delle cellule per ulteriori elaborazioni. Pipette spesso usato in elettrofisiologia sono utilizzati per isolare (con aspirazione) una cella di interesse e convenientemente lo depositano in una provetta Eppendorf per l&#39;ulteriore elaborazione con qualsiasi numero di tecniche di biologia molecolare. Il nostro protocollo può essere modificato per la raccolta dei dendriti da colture cellulari o anche singole cellule da fette acuta. Abbiamo anche descrivere il metodo di amplificazione ARNA come applicazione principale a valle di isolamenti singola cellula. Questo metodo è stato sviluppato in precedenza dal nostro laboratorio come alternativa alle altre tecniche di analisi dell&#39;espressione genica come reverse-trascrizione o real-time polymerase chain reaction (PCR). 4,5,6,7,8 Questa tecnica prevede l&#39;amplificazione lineare dei polyadenylated RNA a partire femtogrammi solo del materiale e conseguente quantità microgrammo di RNA antisenso. Il materiale linearmente amplificato fornisce una più accurata stima di amplificazione esponenziale della relativa abbondanza di componenti del trascrittoma delle cellule isolate. La procedura di base consiste in due turni di amplificazione. In breve, un RNA polimerasi di T7 sito promotore è incorporata nel doppio filamento del DNA creati dal verbale mRNA. Una notte nella trascrizione in vitro (IVT) di reazione viene quindi eseguita in cui T7 RNA polimerasi produce molte trascrizioni antisenso dal cDNA a doppio filamento. Il secondo turno si ripete questo processo, ma con alcune differenze tecniche, poiché il materiale di partenza è l&#39;RNA antisenso. E &#39;normale ripetere il secondo turno, con conseguente tre turni di amplificazione. Spesso, il terzo turno in reazione trascrizione in vitro viene eseguita utilizzando nucleosidi trifosfati biotinilato in modo che il RNA antisenso prodotta può essere ibridato e rilevato su un microarray. 7,8

In questo articolo viene descritto un metodo semplice per la raccolta di singole cellule di ratto colture primarie neuronali e analisi del trascrittoma con conseguente amplificazione ARNA. Questo approccio è generalizzabile a qualsiasi tipo di cellula.

L&#39;analisi del trascrittoma di singole cellule

Molte tecniche di analisi dell'espressione genica si basano su materiale isolato da popolazioni eterogenee di cellule provenienti da omogenizzati tissutali o cellule in...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni derivati da singole cellule per l'analisi del trascrittoma. Questo viene ottenuto innanzitutto individuando una cellula adatta all'isolamento. Successivamente, la micropipetta viene posizionata accanto alla cellula da isolare.Successivamente si applica aspirazione alla siringa finché la cellula viene tirata all'interno della punta della micropipetta. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rompere la punta della micropipetta all'interno del tubo di raccolta ed espellere il contenuto rimanente della micropipetta nel tubo. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano differenze nelle popolazioni di mRNA tra le cellule mediante analisi con microarray del materiale amplificato utilizzando il metodo di amplificazione dell'arn, descritto anche nel protocollo, o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni e rivelare le differenze tra singole cellule, può essere applicato anche a compartimenti subcellulari come le dendriti o classi di dendriti, fornendo informazioni importanti sulla funzione dendritica. A dimostrare la procedura sarà Jennifer Singh, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Prima dell'inizio di questo protocollo, neuroni primari provenienti dal giorno embrionale 18 di ippocampo di ratto sono stati seminati su coprivetri da 12 millimetri in una piastra da 35 millimetri e mantenuti come descritto nel protocollo scritto. Per preparare le pipette per il prelievo, utilizzare un tiratore di micropipette per tirare pipette di vetro autoclavate fino a un diametro appropriato per l'elettrofisiologia.Utilizzando il programma preimpostato del produttore, la dimensione del foro non è critica poiché la punta verrà rotta prima del prelievo cellulare. Conservare con cura le pipette in un ambiente privo di polvere, ad esempio in un contenitore per pipette microlitriche, in modo che le punte rimangano integre fino al momento del raccolto cellulare. Preparare il numero desiderato di provette da 1,7 millilitri aggiungendo due microlitri di PBS per la conservazione del materiale raccolto.Rimuovere una piastra da 35 millimetri contenente coprivetrini dall'incubatrice in una cappa a flusso laminare. Trasferire rapidamente un coprivetrino da questa piastra al coperchio di una nuova piastra da 35 millimetri contenente HBSS. È fondamentale reinserire in incubatrice i coprivetrini non soggetti a manipolazione, poiché le cellule possono diventare non vitali.Se lasciati fuori per periodi di tempo prolungati. È necessario un microscopio ottico invertito dotato di un obiettivo 40x e di un micromanipolatore per il prelievo cellulare. Utilizzare un supporto per pipette con un tubo flessibile che si estenda dal supporto; fissare il tubo a una superficie stabile per evitare movimenti indesiderati della pipetta durante il campionamento.All'estremità del tubo, inserire un ago in modo che possa essere collegata e sostituita tra un utente e l'altro una siringa da un millilitro con connessione a bloccaggio a vite. Preparare la micropipetta rompendone la punta in modo controllato, tenendo un fazzoletto di carta Kim teso tra le dita di una mano e sfiorando molto delicatamente la punta della pipetta sulla carta da una a due volte. L'apertura dovrebbe essere approssimativamente dal 75 al 100% della dimensione della cellula bersaglio.Fissare la micropipetta nel supporto della micropipetta e attaccare il supporto alla slitta dei micromanipolatori. Infine, impostare l'obiettivo 40x. Posizionare la piastra sul portapreparati del microscopio e individuare una zona di cellule adatta per il prelievo.Nel caso di colture neuronali primarie, la cellula deve essere relativamente isolata rispetto alle sue vicine. Per evitare il prelievo di cellule circostanti e/o dei loro prolungamenti, posizionare la cellula da prelevare al centro del campo visivo. Utilizzare il micromanipolatore per avanzare la micropipetta verso la soluzione nella piastra, inserendola nel percorso della luce.Abbassare la punta della pipetta nella soluzione. Guardando attraverso l'oculare, la pipetta dovrebbe apparire come un'ombra nel campo visivo. Da questo punto in poi, applicare una pressione positiva soffiando leggermente attraverso la siringa ben al di sopra del piano delle cellule.Regolare la posizione della punta della pipetta finché non si trova nel campo visivo e mettere a fuoco la punta della pipetta utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana. A questo punto, valutare se la dimensione del lume della pipetta è troppo grande o troppo piccola. Se la dimensione del lume non è corretta, sostituire la micropipetta con un'altra finché non si trova quella con la dimensione del lume appropriata per prevenire la rottura della pipetta nella regione di raccolta.Utilizzare la messa a fuoco grossolana per avanzare il piano focale prima di avvicinare la punta della pipetta alle cellule mediante i micromanipolatori. Quando le cellule risultano più vicine, utilizzare la messa a fuoco fine finché sia le cellule che la punta della pipetta non risultano a fuoco. Arrestare l'applicazione della pressione positiva prima di raggiungere le cellule bersaglio per evitare di spingerle via dal vetrino. Posizionare la punta della pipetta con i micromanipolatori in modo che tocchi il soma della cellula da raccogliere. Utilizzando la siringa, applicare un'aspirazione delicata con la bocca finché la cellula non entra nella punta della pipetta. Se la cellula non entra nella punta, spostare delicatamente la punta più vicino alla cellula e verso il basso finché questa non si stacca dal vetrino. Utilizzare il micromanipolatore per spostare immediatamente la pipetta verso l'alto ed fuori dalla soluzione. Rimuovere la pipetta dal supporto. Tenere in una mano il tubo Eppendorf da 1,7 millilitri preparato e rompere delicatamente la punta della pipetta contro la parete del tubo in prossimità del fondo.Puntare al segno di 0,1 millilitro con la punta rotta centrata all'interno del tubo, quindi inserire un ago collegato a una siringa da un millilitro nell'apertura superiore della pipetta. Premere rapidamente lo stantuffo, costringendo la soluzione nella pipetta a fuoriuscire sotto forma di spruzzo nel tubo. Prestare attenzione a non far toccare la punta a qualsiasi liquido presente sui lati del tubo.Poiché l'azione capillare riporterà il liquido all'interno della pipetta, la cellula deve rimanere nella punta estrema della pipetta, il che dovrebbe essere sufficiente per espellere correttamente la cellula. Centrifugare rapidamente il contenuto del tubo utilizzando una microcentrifuga da banco e congelare su ghiaccio secco oppure porre sul ghiaccio per ulteriori lavorazioni o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione. Qui viene mostrato un esempio di raccolta riuscita di un neurone isolato.Per iniziare, è stata selezionata una regione con densità relativamente bassa di cellule. La punta della pipetta è stata quindi avanzata verso la cellula desiderata. Qui viene mostrato il campo visivo dopo che la cellula è stata raccolta.Si noti che i processi circostanti rimangono sul vetrino. Al contrario, questa figura mostra due immagini di punte di pipetta, che hanno dimensioni inadeguate per un prelievo efficace. Questa punta porterà a un prelievo incompleto, mentre la punta mostrata qui risulterà nel prelievo dell'ambiente circostante.Dopo il raccolto e un'analisi di amplificazione dell'RNA, si raccomanda l'utilizzo di un bioanalizzatore per esaminare la distribuzione e la quantità di RNA amplificato. Un'amplicazione riuscita a partire da materiale di singola cellula produrrà quantità totali nell'ordine dei microgrammi bassi e avrà una distribuzione liscia e ampia. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente; durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale utilizzare tecniche prive di RNA.

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