L'analisi del trascrittoma di singole cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni da singole cellule per l'analisi del trascrittoma. Ciò si ottiene trovando prima una cellula adatta all'isolamento. La micropipetta viene quindi posizionata accanto alla cellula da isolare.

L'aspirazione successiva viene applicata alla siringa fino a quando la cellula non viene tirata nella punta della micropipetta. La fase finale della procedura consiste nel rompere la punta della micropipetta nella provetta di raccolta e svuotare il contenuto rimanente della micropipetta nella provetta. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano differenze nelle popolazioni di mRNA tra le cellule attraverso l'analisi di microarray di materiale amplificato utilizzando il metodo di amplificazione dell'arna, anch'esso descritto nel protocollo o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni e le differenze tra le singole cellule, può essere applicato anche a compartimenti subcellulari come dendriti o classi di dendriti e fornire informazioni importanti sulla funzione dei dendriti. A dimostrare la procedura sarà Jennifer Singh, un postdoc nel mio laboratorio Prima dell'inizio di questo protocollo, i neuroni primari del giorno embrionale 18, ratto Hippo Campi sono stati placcati su vetrini coprioggetti da 12 millimetri in un piatto da 35 millimetri e mantenuti come descritto nel protocollo scritto. Per preparare le pipette per il prelievo, utilizzare un micro estrattore per pipette per estrarre le pipette di vetro dell'autoclave a un diametro appropriato per l'elettrofisiologia.

Utilizzando il programma preimpostato del produttore, la dimensione del foro non è critica poiché la punta verrà rotta prima della raccolta delle celle. Conservare con cura le pipette in un ambiente privo di polvere, come un barattolo per micropipette, dove i puntali rimarranno intatti quando saranno pronti per il prelievo delle cellule. Preparare il numero desiderato di provette da 1,7 millilitri aggiungendo due microlitri di PBS per lo stoccaggio del materiale raccolto.

Rimuovere 1 piatto da 35 millimetri di vetrini coprioggetti dall'incubatore in una cappa per coltura tissutale. Trasferisci rapidamente un vetrino coprioggetto da questo piatto al coperchio di un nuovo piatto da 35 millimetri contenente HBSS. È fondamentale restituire i vetrini coprioggetto che non vengono manipolati all'incubatrice poiché le cellule diventano malsane.

Se lasciato fuori per lunghi periodi di tempo. Per la raccolta delle cellule è necessario un microscopio a luce invertita con un obiettivo 40x dotato di un micromanipolatore. Utilizzare un portapipetta con un tubo flessibile che si allontani dal supporto, fissare il tubo su una superficie stabile per evitare movimenti indesiderati della pipetta durante la raccolta.

All'estremità del tubo, inserire un ago in modo che una siringa da un millilitro con una connessione di blocco dell'esca possa essere attaccata e sostituita tra un utente e l'altro. Preparare la micropipetta rompendo la punta in modo controllato, tenendo tesa una salvietta Kim tra le dita di una mano e sfiorando molto delicatamente la punta della pipetta sulla carta una o due volte. L'apertura dovrebbe essere compresa tra il 75 e il 100% della dimensione della cellula target.

Fissare la micropipetta nel supporto per micropipette e fissare il supporto per micropipette all'inserto sui micromanipolatori. Infine, imposta l'obiettivo 40x. Posiziona il piatto sul tavolino del microscopio e trova una regione di cellule adatta al raccolto.

Nel caso di colture neuronali primarie, la cellula dovrebbe essere relativamente isolata dalle sue vicine. Per evitare la raccolta delle cellule circostanti e/o dei processi, posizionare la cellula da raccogliere al centro del campo visivo. Utilizzare il micromanipolatore per far avanzare la micropipetta verso la soluzione nel piatto nel percorso della luce.

Abbassare il puntale della pipetta nella soluzione. Guardando attraverso l'oculare, la pipetta dovrebbe apparire come un'ombra nel campo visivo. Da questo punto in poi, applicare una pressione positiva soffiando leggermente attraverso la siringa ben al di sopra del piano delle cellule.

Regolare la posizione della punta della pipetta fino a quando non si trova all'interno del campo visivo e mettere a fuoco la punta della pipetta utilizzando le manopole di messa a fuoco della direzione. A questo punto, valutare se la dimensione del foro della pipetta è troppo grande o troppo piccola. Se la dimensione del foro non è corretta, sostituirla con un'altra micropipetta fino a trovare la dimensione corretta del foro Per evitare la rottura della pipetta nella regione di raccolta.

Utilizzare la messa a fuoco del percorso per far avanzare il piano focale prima di far avanzare la punta della pipetta verso le cellule utilizzando i manipolatori microm. Man mano che le cellule si avvicinano, utilizzare la messa a fuoco fine fino a quando sia le cellule che la punta della pipetta sono a fuoco. Smettere di applicare una pressione positiva prima che le celle del querelante vengano raggiunte per evitare di farle saltare via dal vetrino coprioggetto.

Posizionare la punta della pipetta con i micromanipolatori in modo che tocchi il soma cellulare da raccogliere. Utilizzando la siringa, aspirare delicatamente con la bocca fino a quando la cellula non entra nel puntale della pipetta. Se la cellula non entra nella pipetta, avvicinare delicatamente il puntale alla cellula e verso il basso finché non si solleva dal vetrino coprioggetto.

Utilizzare il micromanipolatore per spostare immediatamente la pipetta verso l'alto e fuori dalla soluzione. Rimuovere la pipetta dal supporto. Tenere in una mano la provetta da 1,7 millilitri preparata e rompere delicatamente la punta della pipetta sul lato della provetta verso il basso.

Puntando al segno di 0,1 millilitri con la punta rotta centrata all'interno del tubo, inserire un ago collegato a una siringa da un millilitro nell'apertura superiore della pipetta. Premere rapidamente lo stantuffo, costringendo la soluzione nella pipetta a spruzzare nel tubo. Fare attenzione a non toccare la punta con i liquidi sui lati del tubo.

Poiché l'azione capillare riporta il liquido nella pipetta, la cellula deve rimanere nella punta della pipetta e questo deve essere sufficiente per espellere correttamente la cellula. Centrifugare rapidamente il contenuto della provetta utilizzando una micro-fuge da tavolo e congelarla su ghiaccio secco o posizionarla sul ghiaccio per un'ulteriore lavorazione o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione. Qui è mostrato un esempio di un raccolto riuscito di un neurone isolato.

Per iniziare, è stata selezionata una regione di celle a densità relativamente bassa. La punta della pipetta è stata quindi fatta avanzare verso la cella desiderata. Qui il campo visivo viene mostrato dopo che la cellula è stata raccolta.

Si noti che i processi circostanti rimangono sul vetrino di presentazione. Al contrario, questa figura mostra due immagini di puntali per pipette, che sono di dimensioni inadeguate per una raccolta efficace. Questo suggerimento porterà a un raccolto incompleto, mentre il suggerimento mostrato qui risulterà nel raccolto dell'ambiente circostante.

Dopo il raccolto e l'analisi di amplificazione dell'RNA A, si consiglia di utilizzare un bioanalizzatore per esaminare la distribuzione e la quantità di RNA amplificato. Un'amplificazione riuscita da materiale a singola cellula produrrà quantità totali nei microgrammi bassi e avrà una distribuzione regolare e ampia Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente durante l'esecuzione di questa procedura, è importante utilizzare la tecnica senza RNA.