L'analisi del trascrittoma di singole cellule
25 aprile 2011
In questo articolo viene descritto un metodo semplice per la raccolta di singole cellule di ratto colture primarie neuronali e analisi del trascrittoma con conseguente amplificazione ARNA. Questo approccio è generalizzabile a qualsiasi tipo di cellula.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni derivati da singole cellule per l'analisi del trascrittoma. Questo viene ottenuto innanzitutto individuando una cellula adatta all'isolamento. Successivamente, la micropipetta viene posizionata accanto alla cellula da isolare.
Successivamente, si applica aspirazione alla siringa finché la cellula non viene aspirata nella punta della micropipetta. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rompere la punta della micropipetta all'interno del tubo di raccolta ed espellere il contenuto residuo della micropipetta nel tubo. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano differenze nelle popolazioni di mRNA tra le cellule, mediante analisi con microarray del materiale amplificato utilizzando il metodo di amplificazione dell'arn, anch'esso descritto nel protocollo, o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni e rivelare le differenze tra singole cellule, può essere applicato anche a compartimenti subcellulari come le dendriti o classi di dendriti, fornendo informazioni importanti sulla funzione dendritica. A dimostrare la procedura sarà Jennifer Singh, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Prima dell'inizio di questo protocollo, neuroni primari provenienti dal giorno embrionale 18 di ippocampo di ratto sono stati seminati su coprivetri da 12 millimetri in una piastra da 35 millimetri e mantenuti come descritto nel protocollo scritto. Per preparare le pipette per il prelievo, utilizzare un tiratore di micropipette per tirare pipette di vetro autoclavate fino a un diametro appropriato per l'elettrofisiologia.
Utilizzando il programma preimpostato del produttore, la dimensione del foro non è critica poiché la punta verrà rotta prima del prelievo cellulare. Conservare con cura le pipette in un ambiente privo di polvere, ad esempio in un contenitore per pipette microlitriche, in modo che le punte rimangano integre fino al momento del raccolto cellulare. Preparare il numero desiderato di provette da 1,7 millilitri aggiungendo due microlitri di PBS per la conservazione del materiale raccolto.
Rimuovere una piastra da 35 millimetri con coprislip dall'incubatrice in una cappa a flusso laminare. Trasferire rapidamente un coprislip da questa piastra al coperchio di una nuova piastra da 35 millimetri contenente HBSS. È fondamentale riportare in incubatrice i coprislip che non vengono manipolati, poiché le cellule possono diventare non vitali.
Se lasciato fuori per periodi prolungati. Per il prelievo cellulare è necessario un microscopio ottico invertito dotato di un obiettivo 40x e di un micromanipolatore. Utilizzare un supporto per pipette con un tubo flessibile che si estenda dal supporto, fissando il tubo a una superficie stabile per evitare movimenti indesiderati della pipetta durante il prelievo.
All'estremità del tubo, inserire un ago in modo che possa essere collegata e sostituita tra un utente e l'altro una siringa da un millilitro con connessione a bloccaggio a vite. Preparare la micropipetta rompendone la punta in modo controllato, tenendo un fazzoletto di carta Kim teso tra le dita di una mano e sfiorando molto delicatamente la punta della pipetta sulla carta da una a due volte. L'apertura dovrebbe essere approssimativamente dal 75 al 100% della dimensione della cellula bersaglio.
Fissare la micropipetta nel supporto della micropipetta e attaccare il supporto alla slitta dei micromanipolatori. Infine, impostare l'obiettivo 40x. Posizionare la piastra sul tavolo del microscopio e individuare una regione di cellule adatta per il prelievo.
Nel caso di colture neuronali primarie, la cellula deve essere relativamente isolata rispetto alle sue vicine. Per evitare il prelievo di cellule circostanti e/o dei loro prolungamenti, posizionare la cellula da prelevare al centro del campo visivo. Utilizzare il micromanipolatore per avanzare la micropipetta verso la soluzione nella piastra, inserendola nel percorso della luce.
Abbassare la punta della pipetta nella soluzione. Guardando attraverso l'oculare, la pipetta dovrebbe apparire come un'ombra nel campo visivo. Applicare una pressione positiva da questo punto in poi soffiando leggermente attraverso la siringa ben al di sopra del piano delle cellule.
Regolare la posizione della punta della pipetta finché non si trova nel campo visivo e mettere a fuoco la punta utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana. A questo punto, valutare se il diametro interno della pipetta è troppo grande o troppo piccolo. Se il diametro interno non è corretto, sostituirla con un'altra micropipetta finché non si trova quello con il diametro interno appropriato, per prevenire la rottura della pipetta nella zona di raccolta.
Utilizzare la messa a fuoco grossolana per avanzare il piano focale prima di avvicinare la punta della pipetta alle cellule mediante i micromanipolatori. Quando le cellule risultano più vicine, utilizzare la messa a fuoco fine finché sia le cellule che la punta della pipetta non risultano a fuoco. Arrestare l'applicazione di pressione positiva prima di raggiungere le cellule bersaglio per evitare di spostarle dal vetrino.
Posizionare la punta della pipetta con i micromanipolatori in modo che tocchi il corpo cellulare da raccogliere. Utilizzando la siringa, applicare un'aspirazione delicata tramite bocca finché la cellula non entra nella punta della pipetta. Se la cellula non entra nella punta, spostare delicatamente la punta più vicino alla cellula e verso il basso finché questa non si stacca dal vetrino.
Utilizzare il micromanipolatore per spostare immediatamente la pipetta verso l'alto ed fuori dalla soluzione. Rimuovere la pipetta dal supporto. Tenere in una mano il tubo einor da 1,7 millilitri preparato e rompere delicatamente la punta della pipetta contro la parete del tubo in prossimità del fondo.
Puntare al segno di 0,1 millilitro con la punta rotta posizionata al centro all'interno della provetta, quindi inserire un ago collegato a una siringa da un millilitro nell'apertura superiore della pipetta. Premere rapidamente lo stantuffo, costringendo la soluzione nella pipetta a fuoriuscire sotto forma di spruzzo nella provetta. Prestare attenzione a non far toccare la punta a qualsiasi liquido presente sulle pareti della provetta.
Dato che l'azione capillare riporterà il liquido all'interno della pipetta, la cellula deve rimanere nella punta estrema della pipetta, il che dovrebbe essere sufficiente per espellere correttamente la cellula. Centrifugare rapidamente il contenuto del tubo utilizzando una microcentrifuga da banco e congelare su ghiaccio secco oppure porre sul ghiaccio per ulteriori lavorazioni o per altre applicazioni come la PCR o il sequenziamento di nuova generazione. Qui viene mostrato un esempio di raccolta riuscita di un neurone isolato.
Per iniziare, è stata selezionata una regione di cellule con densità relativamente bassa. La punta della pipetta è stata quindi avanzata verso la cellula desiderata. Qui il campo visivo è mostrato dopo il prelievo della cellula.
Si noti che i processi circostanti rimangono sul vetrino. Al contrario, questa figura mostra due immagini di punte di pipetta, che hanno dimensioni inadeguate per un'efficace raccolta. Questa punta porterà a una raccolta incompleta, mentre la punta mostrata qui determinerà la raccolta dell'ambiente circostante.
Dopo il raccolto e un'analisi di amplificazione dell'RNA, si raccomanda l'utilizzo di un bioanalizzatore per esaminare la distribuzione e la quantità di RNA amplificato. Un'amplicazione riuscita a partire da materiale di singola cellula produrrà quantità totali nell'ordine di pochi microgrammi e avrà una distribuzione liscia e ampia. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente; durante la procedura, è fondamentale utilizzare tecniche prive di RNasi.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'isolamento di singole cellule da colture neuronali primarie di ratto per l'analisi del trascrittoma mediante amplificazione di aRNA. La tecnica è adattabile a diversi tipi cellulari, consentendo uno studio dettagliato dell'espressione genica a livello di singola cellula.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Trascrittomica
Sfondo
- L'analisi a singola cellula fornisce informazioni sull'eterogeneità cellulare.
- Comprendere le differenze nell'espressione genica è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- Le colture primarie di neuroni sono essenziali per lo studio della funzione neuronale.
- Le tecniche di raccolta sono fondamentali per un'analisi accurata del trascrittoma.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento di singoli neuroni.
- Facilitare l'analisi del trascrittoma di cellule singole.
- Migliorare la comprensione della variabilità dell'espressione genica nei neuroni.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di singole cellule mediante tecniche di micropipettaggio.
- Applicazione dell'amplificazione di aRNA per l'analisi del trascrittoma.
- Utilizzo della microscopia ottica invertita per la visualizzazione delle cellule.
- Micro manipolatore per il posizionamento preciso della pipetta.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di singoli neuroni da colture primarie.
- Dimostrazione delle differenze tra popolazioni di mRNA tra cellule isolate.
- Applicazioni potenziali nella PCR e nel sequenziamento di nuova generazione.
- Informazioni sulla funzione dendritica mediante raccolta mirata.
Conclusioni
- Il metodo consente un'analisi trascrittomica dettagliata a livello di singola cellula.
- Può essere adattato per diversi tipi cellulari oltre ai neuroni.
- Questo approccio migliora la nostra comprensione della diversità cellulare nei tessuti neurali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi del trascrittoma a singola cellula consente ai team biofarmaceutici di risolvere l'eterogeneità cellulare e identificare differenze nell'espressione genica che rimangono mascherate nei saggi su tessuti interi. Questa capacità è fondamentale per la validazione di target, la riduzione del rischio meccanicistica e la priorizzazione di popolazioni cellulari rilevanti per la malattia nella fase iniziale della scoperta. L'integrazione di flussi di lavoro robusti a singola cellula rafforza la fiducia predittiva e orienta le decisioni di triage del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'espressione genica alla risoluzione di singole cellule, chiarificando l'attività delle vie metaboliche e l'interazione con i bersagli.
- Supporta la riduzione del rischio biologico distinguendo le firme molecolari tra tipi cellulari e compartimenti subcellulari.
- Migliora la sicurezza predittiva nella selezione dei bersagli rivelando l'eterogeneità all'interno di tessuti rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Semplifica la preparazione di campioni singoli di cellule validati per saggi trascrittomica successivi.
- Permette l'isolamento e l'amplificazione riproducibile di RNA da cellule singole, supportando lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Fornisce materiale in ingresso scalabile per piattaforme di microarray, PCR o sequenziamento di nuova generazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo molecolare a sottotipi o compartimenti neuronali rilevanti per la malattia, favorendo l'individuazione di biomarcatori traslazionali.
- Mantiene la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo analisi con risoluzione a singola cellula.
- Riduce il rischio di proseguire con target non rappresentativi confermando l'espressione nelle popolazioni cellulari pertinenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro per l'isolamento di singole cellule e l'amplificazione di aRNA collega la fase iniziale di scoperta alla ricerca preclinica, fornendo dati trascrittomici ad alta risoluzione per la validazione degli obiettivi e l'identificazione dei candidati promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi dell'espressione genica a livello di singola cellula.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili di RNA adatti per saggi successivi ad alto rendimento.
- Analisi: Genera RNA amplificato per microarray o sequenziamento, consentendo confronti robusti dell'espressione genica tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari a sottotipi o compartimenti neuronali rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e adattabile per diversi tipi cellulari e modelli sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento e l'amplificazione di singole cellule, migliorando la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di target con rilevanza cellulare validata, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di singole cellule e in tecniche prive di RNA per prevenire contaminazioni.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per micro-manipolazione e piattaforme analitiche per la quantificazione e l'analisi dell'RNA.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale dei protocolli di isolamento e amplificazione per garantire riproducibilità.
- Adattabile a diversi tipi cellulari e compartimenti subcellulari mediante modifiche al protocollo.
- L'integrità del campione e il rendimento di RNA sono sensibili alla manipolazione e ai tempi, richiedendo una gestione accurata del flusso di lavoro.
