Procedure per l'identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l'apparato digerente di una specie aviaria

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di documentare il passaggio di materiale infettivo PreOn attraverso l'apparato digerente dei corvi americani. Ciò si ottiene misurando prima i corvi con materiale PreOn infettivo. Il secondo passo consiste nel raccogliere le feci di corvo per quattro ore dopo la sonda e prepararle per l'iniezione nei topi.

Successivamente, i topi vengono inoculati per via intraperitoneale con un millilitro di omogenato fecale di corvo. Il passo finale consiste nel monitorare i topi ogni giorno fino a quando non esprimono segni clinici di raschiatura del topo. In definitiva, l'analisi western blot viene utilizzata per confermare la presenza di PreOn infettivo nel modello murino e verificare la trasmissione della malattia.

L'idea che i corvi potessero trasportare. CWD è venuto da noi un giorno d'inverno quando, dopo aver guidato verso una struttura di alci in cattività dove stavamo facendo alcune ricerche e vedendo alci uccisi sulla strada nutriti dai corvi, e più tardi quel giorno, corvi che uscivano dal cielo dal nulla, atterrando in queste mangiatoie, nutrendosi proprio accanto all'alce, defecando sul grano che l'alce stava consumando che in cima all'osservazione dalla letteratura che un sacco di Quell'estate in tutto il Colorado, Wyoming, sverna in un'area concentrata nel New Mexico, si dà il caso che quella zona del New Mexico sia dove è spuntato un po' di CABD ed è a cento miglia di distanza dall'epicentro della malattia del crack. Quindi queste due osservazioni ci hanno fatto pensare che potenzialmente i corvi potrebbero svolgere un ruolo nel trasporto della CWD in tutto il paesaggio.

Una dimostrazione visiva di queste tecniche è fondamentale in quanto tecniche di sonda intraperitoneale e orale errate possono provocare la morte degli animali oggetto di studio. Per iniziare, aggiungi quattro gocce di colorante blu a un uovo strapazzato e mescola bene. Quindi aspirare cinque millilitri di miscela di colorante e uova in un ago da sonda da due pollici con una persona che trattiene delicatamente il corvo.

Apri il becco del corvo abbastanza da vedere in fondo alla sua gola e inserisci con cura l'ago del gavage nel suo esofago. Se si nota un'alterazione della respirazione, rimuovere la siringa e riprovare poiché potrebbe essere stata inserita nella trachea. Una volta che è certo che l'ago della sonda gastrica si trova nell'esofago, estrarre lentamente il contenuto della siringa.

Controlla il corvo ogni 30 minuti fino a quando le feci macchiate di blu-verde non vengono più espulse. I corvi di prova hanno impiegato circa quattro ore per smettere di espellere feci colorate di blu. Quindi, aggiungi una parte di cervello di topo nero C 57 non infetto a quattro parti di PBS sterile e alcune perle di vetro in un frullatore a proiettile.

Omogeneizzatore Omogeneizzare il campione da uno a cinque minuti fino a raggiungere una consistenza liscia. Ripetere il processo utilizzando il ceppo R ML Chandler malato terminale infetto da C 57 nero sei cervelli di topo. Centrifugare quindi l'omogeneo a 3000 volte G per un minuto.

Per rimuovere il particolato più grande. Quindi rimuovere il surnatante e diluirlo con un volume uguale di XPBS sterile per generare un 10% in peso per volume di materia cerebrale. In PBS, conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non sarà necessario 17 ore prima del calibro.

Togliete il cibo ma non l'acqua dai recinti di porco. Assegnare casualmente i corvi in gruppi di trattamento e sottoporre oralmente ogni corvo con cinque millilitri di omogeneizzato cerebrale di topo appena scongelato, normale o infetto utilizzando un ago da due pollici. Quindi trasferisci i corvi in gabbie individuali.

Raccogli e raccogli tutte le feci all'interno di ogni gabbia a quattro ore dopo il gavage. Quindi, omogeneizzare le feci raggruppate per ogni corvo in un omogeneizzatore a proiettile blu con perle di vetro fino a ottenere una consistenza uniforme. Quindi prendi 500 microlitri della miscela e diluiscila da uno a 20 con 9,5 millilitri di centrifuga PBS sterile, l'omogenato fecale diluito per 15 minuti.

Aggiungere 1.300 volte G e poi trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Per ridurre al minimo la minaccia di un'infezione microbica secondaria, aggiungere un'unità di penicillina e un microgrammo di streptomicina per millilitro di omogeneizzato. Quindi sonicare i campioni in un atomizzatore da 3000 MP a una potenza di 70 per 30 secondi per distruggere la membrana di eventuali microbi rimanenti.

Innanzitutto, assegna casualmente i topi a uno dei quattro gruppi mostrati qui. Il primo gruppo riceverà feci di corvo infette. Il secondo gruppo riceverà feci di corvo non infette.

Il gruppo tre riceverà il cervello di topo infetto e il gruppo quattro riceverà il cervello di topo normale. Quindi, per i gruppi MN uno e due, prelevare un millilitro di feci di corvo positive o negative raschianti. Omogeneizzare utilizzando un ago calibro 25 in base al numero di gruppo del topo.

Quindi afferra il topo per il pelo del collo dorsale. Usando il pollice e l'indice e ruotalo delicatamente per esporre il lato ventrale. Sollevare l'estremità posteriore del topo in modo che la sua testa sia leggermente più bassa.

Inserire l'ago un centimetro attraverso la pelle, un centimetro lateralmente alla linea mediana e uno o due centimetri anteriormente all'articolazione sacroiliaca. Quindi tirare leggermente indietro e iniettare lentamente l'omogeneo nella cavità del corpo del topo. Successivamente, preparare l'omogeneizzato di cervello di topo congelato con e senza scrappy per l'iniezione negli animali dei gruppi tre e quattro.

Diluendo prima le miscele stock di haws da uno a 10 con PBS sterile. Quindi iniettare un millilitro dell'omogenato cerebrale positivo diluito nei topi del gruppo tre e un millilitro dell'omogenato cerebrale negativo diluito nei topi. Nel gruppo quattro.

Monitorare i topi ogni giorno fino a quando non esprimono segni clinici di raschiatura del topo. I segni clinici possono includere cifosi, atassia, rigidità della coda, mancanza di toelettatura, deperimento e letargia. Segna il mio punteggio giornaliero per ciascuno dei sei segni clinici.

Quando i segni visibili sono evidenti. Zero equivale a nessun segno visibile. Uno equivale a moderato e due equivale a un livello grave di un segno.

Sopprimere i topi quando i punteggi giornalieri totali per ogni segno, raggiungono un valore maggiore o uguale a otto per un giorno, maggiore o uguale a sei continuamente per tre giorni o a 365 giorni. Dopo l'inoculazione, prelevare i cervelli subito dopo l'eutanasia e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Quindi smaltire correttamente le carcasse per confermare una diagnosi frammentaria.

Scongelare i cervelli di topo congelati e omogeneizzarli individualmente in un omogeneizzatore a proiettile blu con perle di vetro fino a ottenere una consistenza uniforme. Successivamente, preparare 125 microlitri di una soluzione di digestione della proteinasi K combinando 109,39 microlitri di PBS con 12,5 microlitri di EDTA da 500 millimolari a pH otto e 3,1 microlitri di una soluzione di proteinasi K da 50 microgrammi per millilitro. Quindi aggiungere tre microlitri della soluzione digestiva a 17 microlitri del cervello. Omogeneato.

Incubare i campioni a 45 gradi Celsius su un blocco termico di agitazione per 30 minuti. Una volta terminata l'incubazione, inattivare la soluzione digestiva aggiungendo otto microlitri di tampone di caricamento delle pagine SDS e incubare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare quindi gli esempi in una pagina SDS al 12%.

Elettroforesi su gel le proteine e trasferire il gel su una membrana IMON PVDF Una volta trasferito, bloccare la membrana PVDF con il 5% di latte scremato in PBS con lo 0,2% tra 20 e agitare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi sonda la membrana con borrow 224 e anticorpo monoclonale IPRP coniugato alla perossidasi di rafano diluita da uno a 20.000 in superblocco e roccia per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione. Sciacquare la membrana per un'ora in PBS allo 0,2% tra 20.

Visualizzare le proteine incubando la membrana con un substrato chemiluminescente per cinque minuti. Quindi imaging della membrana su un sistema di documentazione su gel G box. I topi malati sono stati identificati dalla manifestazione di segni clinici di scrapy del topo e la conferma della malattia è stata completata dall'analisi del sangue occidentale.

Il cervello normale del topo, omogeneo senza raschiatura, è mostrato qui a sinistra: due corsie con e senza l'aiuto della proteasi K Senza proteasi K si vedono tre curve. Tuttavia, poiché la proteina normale è suscettibile alle proteinasi, le curve non si vedono nella seconda corsia. La terza corsia mostra un campione di controllo positivo raschiante digerito con proteasi.

Le proteasi causano uno spostamento nelle tre bande originali a causa della perdita dei termini n e c delle proteine. Ma le proteine infette non possono essere completamente digerite come nel normale campione di cervello. La proteinasi K digerita dal cervello di un topo inoculato con feci da un corvo inoculato è mostrata a destra e conferma la presenza di prioni nel campione poiché le bande non vengono digerite.

Dopo aver visto questo video, avrai una maggiore comprensione di come documentare il passaggio di materiale prionico infettivo attraverso l'apparato digerente dei corvi. Quindi verificare l'infettività con un biotest interperitoneale sui topi.