Rilevamento di proteine prioniche anomale nel tessuto cerebrale mediante immunoistochimica

Prendi una diapositiva con una sezione fissa del cervello di mammifero che mostra aggregati di proteine prioniche mal ripiegate.

Trattare la sezione con acido formico per ridurre l'infettività degli aggregati prionici.

Trattare con un tampone acido all'interno di una camera a pressione idratata. Un calore elevato e un pH acido rompono i legami crociati proteici indotti dalla fissazione, smascherando gli epitopi antigenici.

Immergere in perossido di idrogeno per inattivare la perossidasi endogena, prevenendo la colorazione indesiderata del fondo.

Posizionare il vetrino in una piastra di copertura e aggiungere un tampone per mantenere l'idratazione dei tessuti.

Introdurre una soluzione bloccante, impedendo il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere un anticorpo primario specifico per gli aggregati prionici.

Rimuovere le molecole di anticorpi non legate. Introdurre un anticorpo secondario biotinilato che si lega all'anticorpo primario.

Rimuovere le molecole di anticorpi non legate. Aggiungere un enzima perossidasi biotinilata complessato con avidina che si lega alla biotina sull'anticorpo secondario.

Aggiungere un substrato cromogenico, che la perossidasi ossida in un prodotto colorato.

Al microscopio, osservare gli aggregati colorati.

Immergere con cura le sezioni di tessuto in acido formico al 98% a temperatura ambiente per 30 minuti. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 5 minuti, quindi risciacquare due volte in acqua distillata. Utilizzare un contenitore colorante in acciaio inossidabile nella camera a pressione riempita con 500 millilitri di acqua distillata per pretrattare 10 millimolari di citrato tampone a 98 gradi Celsius per 20 minuti.

Ai fini del controllo di qualità, posizionare una sezione di nastro adesivo indicatore per autoclave sul cestello per monitorare la temperatura e la pressione. Una volta che l'allarme indica che l'apparecchiatura ha raggiunto il tempo e la temperatura del programma, immergere il cestello con i vetrini. Quindi, avviare il programma sulla camera di pressione fino al punto due e registrare la pressione iniziale e finale di questo programma.

Per l'inattivazione della perossidasi endogena, immergere il cestello del vetrino contenente le sezioni del campione in un bagno di perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 30 minuti. Sciacquare le sezioni sotto l'acqua corrente per 5 minuti. Dopo lo svuotamento, immergere le sezioni in soluzione salina tamponata per altri 5 minuti. Per la rilevazione immunologica, posizionare ciascun vetrino su un supporto per piastra di copertura disponibile in commercio preinumidito con soluzione fisiologica tamponata con Tris.

Con il lato in tessuto rivolto verso il supporto e i bordi di scorrimento che coincidono con i due punti inferiori del supporto, assicurarsi di evitare bolle d'aria. Tenere il gruppo portavetrini tra il pollice e l'indice. Tenere un dito sulla parte superiore del vetrino del campione e l'altro sulla parte inferiore del supporto. Quindi posizionare l'assieme nella galleria del sistema.

Per assicurarsi che il set sia ben assemblato, riempire il pozzetto tra il vetrino del campione e il supporto con soluzione fisiologica tris-tamponata, senza traboccare. Da questo punto, assicurarsi che circa 80 microlitri di soluzione fisiologica tamponata Tris debbano essere trattenuti tra il supporto e il vetrino. Non lasciare asciugare le ciocche.

Ridurre la colorazione di fondo prima del trattamento con l'anticorpo primario preincubando i campioni di vetrino per 30 minuti con il 20% di siero normale della stessa specie dell'ospite dell'anticorpo secondario in soluzione salina tamponata con Tris. Senza lavare le sezioni, applicare 200 microlitri della soluzione di anticorpi primari direttamente in ciascun pozzetto del set di supporto per vetrini e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.

Per lavare le sezioni, riempire i pozzetti con soluzione fisiologica tris-tamponata e attendere 5 minuti. Ripetere il lavaggio due volte. Successivamente, diluire l'anticorpo secondario biotinilato a una concentrazione compresa tra 1 e 200 in soluzione salina tamponata con tris con siero di cavallo al 10%.

Riparare il volume richiesto, a seconda del numero di sezioni da trattare. Applicare 200 microlitri di soluzione di anticorpi secondari su ciascun pozzetto del set di supporto per vetrini. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, ripetere il lavaggio con soluzione salina tamponata con Tris.

Per l'incubazione con il complesso avidina-biotina perossidasi, preparare il reagente 30 minuti prima dell'uso e applicare 200 microlitri di soluzione in ciascun pozzetto del supporto della piastra del vetrino. Una volta fatto, incubare il set di portapiastre per 30 minuti a temperatura ambiente.