Flusso di lavoro senza macchie V3 per un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale delle proteine nell'blotting occidentale

Il flusso di lavoro BioRad V three fornisce ai ricercatori una quantificazione più affidabile e una maggiore sicurezza nel processo di Western blotting. Ciò si ottiene utilizzando prima i gel anticolorazione TGX per separare e visualizzare i campioni di proteine. Dopo la separazione, le proteine vengono trasferite su una membrana utilizzando il sistema di trasferimento rapido blot turbo, che consente di verificare la qualità e l'efficienza del trasferimento.

Dopo aver verificato il trasferimento, la membrana viene bloccata e sondata con anticorpi primari e secondari per le proteine bersaglio. Infine, i livelli di proteina target vengono normalizzati utilizzando la misurazione delle proteine totali senza colorazione come controllo del carico. Il flusso di lavoro V three offre praticità e trasparenza al processo di western blotting, fornendo ai ricercatori sicurezza in ogni fase, dalla separazione al trasferimento e alla quantificazione.

Il vantaggio principale del flusso di lavoro V three Western rispetto al tradizionale Western blotting è che la tecnologia antimacchia offre un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale di proteine per normalizzare i segnali delle proteine target. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative all'affidabilità delle metodologie di controllo del carico per la tecnica Western blotting che coinvolgono la sovrasaturazione dei segnali proteici di housekeeping e i livelli di espressione differenziale delle proteine di housekeeping in condizioni sperimentali variabili. Abbiamo scoperto che le proteine attivate nei gel senza macchie possono anche essere visualizzate su blos senza ulteriori colorazioni, consentendo loro di essere utilizzate come alternativa alle colorazioni proteiche totali convenzionali, nonché di controllare il carico proteico.

Nei prossimi minuti, dimostreremo il flusso di lavoro completo di V three utilizzando la fluorescenza multiplex. La stessa procedura può essere utilizzata anche per la chemiluminescenza dopo la preparazione di campioni proteici secondo il protocollo di testo. Utilizzando un criterio TGX antimacchia qualsiasi gel prefabbricato KD, rimuovere il pettine e il nastro adesivo dal fondo della cassetta.

Posizionare la cassetta nell'apparecchio per gel e riempire entrambi i serbatoi con tamponi in funzione. Carica gli standard e i campioni proteici. Quindi far funzionare il gel per 20 minuti a 300 volt.

Al termine dell'elettroforesi, utilizzare lo strumento di apertura della cassetta del gel sul coperchio della cella Criterion per aprire la cassetta. Quindi applicare alcuni millilitri di acqua al transluminatore UV dell'imager Chemi Dock MP. Sollevare con cautela il gel dalla cassetta e posizionarlo sul software UV Trans Illuminator Launch Image Lab e impostare un nuovo protocollo a canale singolo per gel senza macchie utilizzando il tempo di attivazione del gel predefinito di un minuto, selezionare il tipo di gel appropriato e l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense.

Quindi fare clic su Esegui protocollo. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, è possibile visualizzare la separazione e la qualità del campione. Quindi procedi immediatamente alla fase di trasferimento.

Per effettuare il trasferimento delle proteine, aprire una confezione di trasferimento trans block turbo MIDI PVDF. Posiziona la pila inferiore al centro della base della cassetta. Rimuovere il gel dalla termocamera.

Allineare il gel sulla parte superiore della membrana. Utilizzare delicatamente il rullo per rimuovere le bolle d'aria tra il gel e la membrana. Quindi, allinea la pila superiore sopra il gel.

Dopo aver rimosso eventuali bolle d'aria, posizionare il coperchio della cassetta sulla base. Premere con decisione il coperchio verso il basso, ruotare la manopola in senso orario per bloccare e inserire la cassetta in uno dei due alloggiamenti per assorbente. Dalla schermata principale, selezionare il protocollo turbo.

Scegli i due mini o un mini gel e premi il pulsante di esecuzione per l'alloggiamento appropriato. Il trasferimento sarà completato in sette minuti. Rimuovere la cassetta dall'alloggiamento.

Sbloccare la cassetta e smontare il panino assorbente. Posizionare il gel post trasferimento sul transluminatore UV dell'imager Chemi dock MP e immergere immediatamente la membrana in acqua deionizzata. Imposta un nuovo protocollo a canale singolo per gel senza macchie senza un tempo di attivazione.

Selezionare il tipo di gel appropriato e impostare manualmente il tempo di esposizione su quello del gel pre-trasferimento e fare clic su Esegui protocollo. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine. Verifica l'efficienza del trasferimento confrontando le intensità della banda di campionamento tra i gel pre e post trasferimento.

Rimuovere il gel dal vassoio del campione poiché non è più necessario e gettarlo. Per verificare, trasferire sulla macchia. Posizionare la membrana sul vassoio del campione e impostare un nuovo protocollo a canale singolo.

Per macchie senza macchie. Seleziona il tipo di gel appropriato e l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense. Quindi fare clic su Esegui protocollo.

Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, verificare il trasferimento sulla membrana. Rimuovere la membrana blot dall'illuminatore trans UV e metterla nel tampone bloccante per il western blotting. Dopo aver incubato la membrana a temperatura ambiente per un'ora, incubarla con anticorpi primari di topo e coniglio per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Versare la soluzione di anticorpi e utilizzare 50 millilitri di TBST per lavare il blot per cinque minuti. Incubare il blot con anticorpi secondari fluorescenti coniugati, anti musa e anti coniglio per un'ora a temperatura ambiente. Quindi usa TBST per lavare la macchia cinque volte per cinque minuti ciascuna.

Per visualizzare la macchia, posizionarla sull'illuminatore UV trans dell'imager Chemi doc MP nel software di laboratorio di immagini. Configurare un nuovo protocollo multicanale. Configura il canale uno selezionando dite six 50 in applicazioni blot e utilizza l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense.

Ripetere questi passaggi per configurare i canali due e tre rispettivamente per DITE 5, 49 e macchia senza macchie. Selezionare il tipo di gel appropriato e fare clic su Esegui protocollo. Per definire le corsie, selezionare la corsia e le bande dell'immagine con macchie libere da macchie.

Quindi il rilevatore automatico di corsia per una quantificazione accurata. Assicurarsi che i profili di sfondo in ciascuna corsia di campionamento siano simili regolando la dimensione del disco di rotolamento su 70. Conferma l'uniformità dello sfondo scansionando tutti i profili delle corsie per definire le bande in entrambi i canali dite six 50 e 5 49.

Utilizzare lo strumento di ricerca della banda per rilevare le bande utilizzando le impostazioni di sensibilità predefinite. Per designare il canale di normalizzazione, tornare alla casella degli strumenti di analisi. Fare clic su normalizzazione e scegliere il blot senza macchie, assicurandosi che sia selezionata la proteina della corsia totale.

Per assegnare le corsie standard del peso molecolare per tornare alla casella degli strumenti di analisi, fare clic su Strumenti di analisi MW e selezionare la casella sotto la corsia appropriata. Infine, per visualizzare le intensità delle bande proteiche normalizzate, fare clic sulla tabella di analisi nella barra degli strumenti. Il software genererà automaticamente una tabella che contiene le intensità dei volumi, i fattori di normalizzazione e i volumi normalizzati.

I volumi normalizzati devono essere utilizzati per l'analisi dei dati e la creazione di report. La tabella può essere esportata. Per ulteriori analisi, abbiamo dimostrato il flusso di lavoro completo del Western blotting V three.

Ora ti mostreremo i risultati rappresentativi di un vero esperimento. I lisati di controllo e le colture cellulari di linfoblasti irradiati sono stati analizzati utilizzando il flusso di lavoro V three Western blot. Il segnale proteico totale libero da colorazione appare in blu.

La proteina bersaglio M CM sette è mostrata in rosso e il controllo del carico proteico convalidato GA DH è mostrato in verde. GA DH è stato convalidato come un adeguato controllo del carico valutando la sua linearità utilizzando le condizioni sperimentali descritte in questo video. I segnali proteici totali privi di colorazione per ciascuna corsia del blot sono stati misurati utilizzando il software di laboratorio di immagini.

Le sette intensità del segnale MCM sono state normalizzate utilizzando sia la proteina totale che i segnali GA DH. I volumi delle sette bande proteiche MCM normalizzati con entrambi i metodi hanno rivelato una diminuzione del 25% dei livelli di espressione nei campioni irradiati rispetto ai campioni di controllo prima di un'accurata normalizzazione. La proteina di housekeeping richiede una convalida che confermi il suo intervallo lineare e i livelli di espressione coerenti tra i campioni senza convalida.

I controlli del carico proteico non garantiscono una normalizzazione accurata. Al contrario, la normalizzazione totale delle proteine non richiede convalida. Pertanto, il segnale proteico totale privo di colorazione ottenuto dal flusso di lavoro V 3 offre un controllo del carico pratico, conveniente e più affidabile durante il tentativo di questa procedura.

Ricordiamo che la tecnologia antimacchia consente la visualizzazione fluorescente di campioni proteici attraverso una modifica covalente indotta dai raggi UV dei residui di triptofano disponibili. Solo in rari casi questa modifica avrà un impatto significativo sulle applicazioni a valle, come il rilevamento immunologico o la spettrometria di massa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il flusso di lavoro occidentale V tre e la normalizzazione totale delle proteine senza colorazioni.

Sebbene abbiamo dimostrato questo flusso di lavoro per il Western blotting fluorescente multiplex, la tecnologia senza macchie può essere utilizzata anche per la normalizzazione totale delle proteine con Western blots luminescenti.