Flusso di lavoro senza macchie V3 per un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale delle proteine nell'blotting occidentale
30 dicembre 2013
Il flusso di lavoro V3 è una procedura western blot che utilizza gel senza macchie. La tecnologia senza macchie consente ai ricercatori di visualizzare la qualità della separazione proteica, di verificare l'efficienza di trasferimento e, soprattutto, di convalidare il cambiamento nella proteina di interesse utilizzando la quantificazione totale delle proteine come controllo di carico affidabile.
Il flusso di lavoro BioRad V three fornisce ai ricercatori una quantificazione più affidabile e una maggiore sicurezza nel processo di Western blotting. Ciò si ottiene utilizzando prima i gel anticolorazione TGX per separare e visualizzare i campioni di proteine. Dopo la separazione, le proteine vengono trasferite su una membrana utilizzando il sistema di trasferimento rapido blot turbo, che consente di verificare la qualità e l'efficienza del trasferimento.
Dopo aver verificato il trasferimento, la membrana viene bloccata e sondata con anticorpi primari e secondari per le proteine bersaglio. Infine, i livelli di proteina target vengono normalizzati utilizzando la misurazione delle proteine totali senza colorazione come controllo del carico. Il flusso di lavoro V three offre praticità e trasparenza al processo di western blotting, fornendo ai ricercatori sicurezza in ogni fase, dalla separazione al trasferimento e alla quantificazione.
Il vantaggio principale del flusso di lavoro V three Western rispetto al tradizionale Western blotting è che la tecnologia antimacchia offre un controllo pratico, conveniente e affidabile del carico totale di proteine per normalizzare i segnali delle proteine target. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative all'affidabilità delle metodologie di controllo del carico per la tecnica Western blotting che coinvolgono la sovrasaturazione dei segnali proteici di housekeeping e i livelli di espressione differenziale delle proteine di housekeeping in condizioni sperimentali variabili. Abbiamo scoperto che le proteine attivate nei gel senza macchie possono anche essere visualizzate su blos senza ulteriori colorazioni, consentendo loro di essere utilizzate come alternativa alle colorazioni proteiche totali convenzionali, nonché di controllare il carico proteico.
Nei prossimi minuti, dimostreremo il flusso di lavoro completo di V three utilizzando la fluorescenza multiplex. La stessa procedura può essere utilizzata anche per la chemiluminescenza dopo la preparazione di campioni proteici secondo il protocollo di testo. Utilizzando un criterio TGX antimacchia qualsiasi gel prefabbricato KD, rimuovere il pettine e il nastro adesivo dal fondo della cassetta.
Posizionare la cassetta nell'apparecchio per gel e riempire entrambi i serbatoi con tamponi in funzione. Carica gli standard e i campioni proteici. Quindi far funzionare il gel per 20 minuti a 300 volt.
Al termine dell'elettroforesi, utilizzare lo strumento di apertura della cassetta del gel sul coperchio della cella Criterion per aprire la cassetta. Quindi applicare alcuni millilitri di acqua al transluminatore UV dell'imager Chemi Dock MP. Sollevare con cautela il gel dalla cassetta e posizionarlo sul software UV Trans Illuminator Launch Image Lab e impostare un nuovo protocollo a canale singolo per gel senza macchie utilizzando il tempo di attivazione del gel predefinito di un minuto, selezionare il tipo di gel appropriato e l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense.
Quindi fare clic su Esegui protocollo. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, è possibile visualizzare la separazione e la qualità del campione. Quindi procedi immediatamente alla fase di trasferimento.
Per effettuare il trasferimento delle proteine, aprire una confezione di trasferimento trans block turbo MIDI PVDF. Posiziona la pila inferiore al centro della base della cassetta. Rimuovere il gel dalla termocamera.
Allineare il gel sulla parte superiore della membrana. Utilizzare delicatamente il rullo per rimuovere le bolle d'aria tra il gel e la membrana. Quindi, allinea la pila superiore sopra il gel.
Dopo aver rimosso eventuali bolle d'aria, posizionare il coperchio della cassetta sulla base. Premere con decisione il coperchio verso il basso, ruotare la manopola in senso orario per bloccare e inserire la cassetta in uno dei due alloggiamenti per assorbente. Dalla schermata principale, selezionare il protocollo turbo.
Scegli i due mini o un mini gel e premi il pulsante di esecuzione per l'alloggiamento appropriato. Il trasferimento sarà completato in sette minuti. Rimuovere la cassetta dall'alloggiamento.
Sbloccare la cassetta e smontare il panino assorbente. Posizionare il gel post trasferimento sul transluminatore UV dell'imager Chemi dock MP e immergere immediatamente la membrana in acqua deionizzata. Imposta un nuovo protocollo a canale singolo per gel senza macchie senza un tempo di attivazione.
Selezionare il tipo di gel appropriato e impostare manualmente il tempo di esposizione su quello del gel pre-trasferimento e fare clic su Esegui protocollo. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine. Verifica l'efficienza del trasferimento confrontando le intensità della banda di campionamento tra i gel pre e post trasferimento.
Rimuovere il gel dal vassoio del campione poiché non è più necessario e gettarlo. Per verificare, trasferire sulla macchia. Posizionare la membrana sul vassoio del campione e impostare un nuovo protocollo a canale singolo.
Per macchie senza macchie. Seleziona il tipo di gel appropriato e l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense. Quindi fare clic su Esegui protocollo.
Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, verificare il trasferimento sulla membrana. Rimuovere la membrana blot dall'illuminatore trans UV e metterla nel tampone bloccante per il western blotting. Dopo aver incubato la membrana a temperatura ambiente per un'ora, incubarla con anticorpi primari di topo e coniglio per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.
Versare la soluzione di anticorpi e utilizzare 50 millilitri di TBST per lavare il blot per cinque minuti. Incubare il blot con anticorpi secondari fluorescenti coniugati, anti musa e anti coniglio per un'ora a temperatura ambiente. Quindi usa TBST per lavare la macchia cinque volte per cinque minuti ciascuna.
Per visualizzare la macchia, posizionarla sull'illuminatore UV trans dell'imager Chemi doc MP nel software di laboratorio di immagini. Configurare un nuovo protocollo multicanale. Configura il canale uno selezionando dite six 50 in applicazioni blot e utilizza l'ottimizzazione automatica predefinita per le bande intense.
Ripetere questi passaggi per configurare i canali due e tre rispettivamente per DITE 5, 49 e macchia senza macchie. Selezionare il tipo di gel appropriato e fare clic su Esegui protocollo. Per definire le corsie, selezionare la corsia e le bande dell'immagine con macchie libere da macchie.
Quindi il rilevatore automatico di corsia per una quantificazione accurata. Assicurarsi che i profili di sfondo in ciascuna corsia di campionamento siano simili regolando la dimensione del disco di rotolamento su 70. Conferma l'uniformità dello sfondo scansionando tutti i profili delle corsie per definire le bande in entrambi i canali dite six 50 e 5 49.
Utilizzare lo strumento di ricerca della banda per rilevare le bande utilizzando le impostazioni di sensibilità predefinite. Per designare il canale di normalizzazione, tornare alla casella degli strumenti di analisi. Fare clic su normalizzazione e scegliere il blot senza macchie, assicurandosi che sia selezionata la proteina della corsia totale.
Per assegnare le corsie standard del peso molecolare per tornare alla casella degli strumenti di analisi, fare clic su Strumenti di analisi MW e selezionare la casella sotto la corsia appropriata. Infine, per visualizzare le intensità delle bande proteiche normalizzate, fare clic sulla tabella di analisi nella barra degli strumenti. Il software genererà automaticamente una tabella che contiene le intensità dei volumi, i fattori di normalizzazione e i volumi normalizzati.
I volumi normalizzati devono essere utilizzati per l'analisi dei dati e la creazione di report. La tabella può essere esportata. Per ulteriori analisi, abbiamo dimostrato il flusso di lavoro completo del Western blotting V three.
Ora ti mostreremo i risultati rappresentativi di un vero esperimento. I lisati di controllo e le colture cellulari di linfoblasti irradiati sono stati analizzati utilizzando il flusso di lavoro V three Western blot. Il segnale proteico totale libero da colorazione appare in blu.
La proteina bersaglio M CM sette è mostrata in rosso e il controllo del carico proteico convalidato GA DH è mostrato in verde. GA DH è stato convalidato come un adeguato controllo del carico valutando la sua linearità utilizzando le condizioni sperimentali descritte in questo video. I segnali proteici totali privi di colorazione per ciascuna corsia del blot sono stati misurati utilizzando il software di laboratorio di immagini.
Le sette intensità del segnale MCM sono state normalizzate utilizzando sia la proteina totale che i segnali GA DH. I volumi delle sette bande proteiche MCM normalizzati con entrambi i metodi hanno rivelato una diminuzione del 25% dei livelli di espressione nei campioni irradiati rispetto ai campioni di controllo prima di un'accurata normalizzazione. La proteina di housekeeping richiede una convalida che confermi il suo intervallo lineare e i livelli di espressione coerenti tra i campioni senza convalida.
I controlli del carico proteico non garantiscono una normalizzazione accurata. Al contrario, la normalizzazione totale delle proteine non richiede convalida. Pertanto, il segnale proteico totale privo di colorazione ottenuto dal flusso di lavoro V 3 offre un controllo del carico pratico, conveniente e più affidabile durante il tentativo di questa procedura.
Ricordiamo che la tecnologia antimacchia consente la visualizzazione fluorescente di campioni proteici attraverso una modifica covalente indotta dai raggi UV dei residui di triptofano disponibili. Solo in rari casi questa modifica avrà un impatto significativo sulle applicazioni a valle, come il rilevamento immunologico o la spettrometria di massa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il flusso di lavoro occidentale V tre e la normalizzazione totale delle proteine senza colorazioni.
Sebbene abbiamo dimostrato questo flusso di lavoro per il Western blotting fluorescente multiplex, la tecnologia senza macchie può essere utilizzata anche per la normalizzazione totale delle proteine con Western blots luminescenti.
Panoramica
Il protocollo V3 è una procedura di western blot che utilizza gel senza colorazione, migliorando la visualizzazione e la quantificazione delle proteine. Questo metodo permette un controllo affidabile del caricamento e verifica l'efficienza del trasferimento proteico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica Clinica
- Analisi delle Proteine
Sfondo
- Il blotting Western è una tecnica comune per l'analisi delle proteine.
- La tecnologia senza colorazione migliora l'affidabilità dei controlli di caricamento.
- I metodi tradizionali possono soffrire di sovrasaturazione delle proteine di housekeeping.
- Il flusso di lavoro V3 offre un'alternativa pratica per la quantificazione delle proteine bersaglio.
Scopo dello studio
- Dimostrare il flusso di lavoro V3 per il western blotting.
- Convalidare l'uso di gel senza colorazione come controllo di caricamento.
- Potenziare la fiducia nei metodi di quantificazione proteica.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di gel TGX senza colorazione per la separazione delle proteine.
- Trasferimento rapido delle proteine su membrane mediante il sistema blot turbo.
- Blocco e sonda delle membrane con anticorpi per le proteine bersaglio.
- Normalizzazione dei livelli delle proteine bersaglio mediante la misurazione totale delle proteine senza colorazione.
Risultati principali
- La tecnologia senza colorazione consente la visualizzazione senza ulteriori passaggi di colorazione.
- L'efficienza del trasferimento può essere verificata confrontando i gel pre e post trasferimento.
- La normalizzazione mediante gel senza colorazione migliora l'accuratezza della quantificazione.
- Il flusso di lavoro aumenta la trasparenza e la praticità nel western blotting.
Conclusioni
- Il flusso di lavoro V3 fornisce un metodo affidabile per l'analisi delle proteine.
- I gel senza colorazione fungono da controlli efficaci del caricamento.
- Questo metodo affronta i limiti delle tecniche tradizionali di western blotting.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il flusso di lavoro V3 senza colorazione risolve un collo di bottiglia fondamentale nel Western blot fornendo un controllo pratico e quantitativo del caricamento totale delle proteine, eliminando la necessità di validare le proteine di riferimento. Ciò aumenta l'affidabilità dei dati e accelera il processo decisionale nei flussi di lavoro di validazione del bersaglio e di ottimizzazione del composto leader, dove le variazioni nell'espressione proteica devono essere quantificate con precisione. Permettendo la visualizzazione in tempo reale della qualità del gel, dell'efficienza di trasferimento e dei segnali del bersaglio normalizzati, il flusso di lavoro riduce l'incertezza sperimentale e supporta una deriskizzazione preclinica riproducibile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso una normalizzazione accurata dei livelli della proteina bersaglio, senza dover dipendere da proteine di controllo potenzialmente variabili.
- Valore operativo: Riduce il tempo necessario per la rimozione e la riprova dei blot per i controlli di caricamento, aumentando la produttività nei saggi di validazione del bersaglio.
- Valore predittivo: Consente decisioni sicure di proseguimento o interruzione dello studio, minimizzando falsi positivi e falsi negativi derivanti da una normalizzazione inadeguata nell'analisi dei percorsi biologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la preparazione di lisati e la validazione della qualità del campione prima dello screening dei composti.
- Output quantitativo: Genera misurazioni del contenuto proteico totale mediante tecnica priva di colorazione, che funge da controllo universale di caricamento compatibile con la rilevazione multiplex a fluorescenza e chemiluminescenza.
- Scalabilità: Compatibile con gel prefabbricati e sistemi di trasferimento rapido, consentendo l'integrazione in flussi di lavoro automatizzati o semi-automatizzati di Western blotting per la conferma dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Garantisce una quantificazione proteica costante dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, eliminando la variabilità introdotta dalle variazioni nell'espressione delle proteine di controllo in condizioni di stress o trattamento.
- Allineamento del Biomarcatore: Permette un rilevamento affidabile di biomarcatori tradotti, laddove la normalizzazione rispetto alla proteina totale è preferibile rispetto all'uso di proteine di controllo che potrebbero essere modulate nei modelli di malattia.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Aumenta la fiducia nei dati di efficacia preclinica fornendo un metodo di normalizzazione validato che non richiede una validazione separata per ogni condizione sperimentale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro V3 si inserisce nel percorso di scoperta che va dai primi saggi di interazione con il bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, in cui una quantificazione accurata delle proteine è essenziale per confermare il meccanismo d'azione e per gli studi sulle relazioni struttura-attività (SAR).
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo una misurazione precisa della modulazione della proteina bersaglio in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Migliora l'affidabilità del saggio verificando l'integrità del gel e l'efficienza del trasferimento, assicurando che i segnali indotti dal composto riflettano effettive variazioni biologiche.
- Analisi: Fornisce intensità normalizzate delle bande proteiche tramite il software Image Lab, permettendo un confronto diretto tra gruppi trattati e punti temporali diversi.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità con studi preclinici fornendo un metodo di controllo del caricamento robusto rispetto alle variazioni delle condizioni sperimentali che influenzano le proteine di mantenimento.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità standardizzata e indipendente dalla piattaforma per la quantificazione delle proteine, condivisibile tra dipartimenti e progetti senza necessità di riconvalida.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi fornendo un metodo di normalizzazione affidabile, non influenzato dalla modulazione sperimentale delle proteine di housekeeping.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e riduce il tempo di manipolazione grazie a fasi rapide di colorazione del gel, trasferimento e acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Potenzia l'efficienza del capitale riducendo gli esperimenti falliti a causa di una cattiva normalizzazione e consentendo un'iterazione più rapida nelle campagne di SAR.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio degli obiettivi migliorando la qualità dei dati negli studi iniziali di efficacia e di meccanismo d'azione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con la manipolazione di gel senza colorazione e sistemi di imaging attivati da UV, come l'imager Chemi Doc MP.
- Dipende dall'accesso ai gel stain-free TGX di Bio-Rad e ai sistemi di trasferimento Blot Turbo per prestazioni ottimali.
- Necessita della standardizzazione delle impostazioni del software Image Lab per la rilevazione dei pozzetti, la correzione del fondo e la normalizzazione tra diversi utenti.
- Potrebbe richiedere adattamenti quando si utilizzano percentuali non standard di gel o tipi diversi di membrane, sebbene la flessibilità del protocollo sia dimostrata sia per fluorescenza che per chemiluminescenza.
- Limitato dalla necessità di utilizzare imagers compatibili con UV; non compatibile con sistemi standard solo per chemiluminescenza privi di capacità di acquisizione delle immagini.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Gel Electrophoresis with Stain-free Gels and Ge Imaging
3:29
Protein Transfer with Trans-blot Turbo System and Antibody Incubation
6:32
Imaging and Calculating the Total Protein Normalization: Image Lab
8:53
Total Protein Normalization Results for MCM-7 in Irradiated Lymphoblastoid Cells
10:43
Conclusion
