Colorazione proteine ​​in gel

In un precedente video intitolato Electrophoretic Separation of Proteins, abbiamo dimostrato come una complessa miscela di proteine possa essere separata utilizzando l'elettroforesi su gel. In questo video, ti mostreremo quattro diversi metodi di colorazione del gel per visualizzare la posizione delle proteine nel gel. Ciao, sono Sean Gallagher dell'UVP e lavoro con il Proteomics Center qui al KEG Graduate Institute.

Oggi vi mostrerò una serie di tecniche per visualizzare le proteine dopo la separazione mediante elettroforesi. Ciò include la colorazione dell'argento blu Kamasi, l'arancio cyro e il rubino cyro. Quindi iniziamo con Kamasi blue First.

Il rilevamento dei divieti proteici in un gel mediante colorazione blu Kamasi dipende dal legame non specifico di un colorante. In questo caso, Kamasi blu brillante G due 50. In questo metodo, le proteine separate in un gel di poliacrilammide vengono lavate utilizzando acqua ad alta purezza.

La posizione delle proteine viene quindi rilevata utilizzando una colorazione blu kamasi a base d'acqua. Il limite di rilevamento è compreso tra 0,3 e un microgrammo per banda proteica. Per iniziare, inizia con un gel di poliacrilammide in cui le proteine sono state separate mediante elettroforesi.

Mentre si agita lentamente, mettere il gel di poliacrilammide in un contenitore di plastica riempito con 300 millilitri di acqua ad alta purezza. Lasciare agire per cinque minuti. Scartare e ripetere altre due volte dopo il terzo lavaggio.

Versare l'acqua e coprire il gel con la soluzione colorante blu Kamasi per un'ora agitando lentamente dopo un'ora di colorazione, versare la soluzione colorante. Sciacquare brevemente il gel inserendo circa 200 millilitri di acqua per 30 minuti. A questo punto, il gel può essere conservato in acqua per future imaging.

Il gel può anche essere essiccato in questa fase per mantenere una registrazione permanente del gel. Per fare ciò, posizionare il gel su due fogli di carta da filtro Watman da tre mm e coprire la parte superiore con pellicola trasparente. Quindi asciugare in un essiccatore in gel convenzionale per una o due ore a circa 80 gradi Celsius.

Un altro metodo di colorazione delle proteine è la colorazione con argento, che dimostreremo in seguito. Sebbene il metodo di colorazione blu Kamasi sia più semplice e rapido, la colorazione con argento è considerevolmente più sensibile con un limite di rilevamento di 0,3 nanogrammi BSA. La rilevazione di bande proteiche in un gel mediante colorazione con argento dipende dal legame dell'argento a vari gruppi chimici nella proteina.

Il seguente protocollo si basa sul kit di colorazione dell'argento Silver Quest di Vitrogen. Il protocollo è derivato dal protocollo di colorazione veloce, circa 30 minuti e rappresenta una delle tante sostanze chimiche basate su kit utilizzate per la colorazione dell'argento compatibili con la spettrometria di massa. In questo caso, utilizzeremo un mini gel prefabbricato in vitrogeno prima di iniziare la colorazione con argento.

Assicurati di indossare sempre i guanti per evitare la contaminazione delle impronte digitali. Metti il gel in un vassoio adatto al microonde con 100 millilitri di acqua reagente. Sciacquare brevemente e poi versare l'acqua.

Successivamente, aggiungere 100 millilitri di fissativo, composto da 40% etanolo, 10% acido acetico in acqua ad alta purezza e microonde per 30 secondi. Il processo a microonde accorcia le fasi di incubazione necessarie accelerando il legame e la colorazione. A questo punto, posizionare il gel su uno shaker e agitare lentamente per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, versare il fissativo, aggiungere 100 millilitri, il 30% di etanolo per lavare il microonde in gel per 30 secondi, quindi posizionare il gel su uno shaker per cinque minuti. Dopo cinque minuti, versare l'etanolo. Ora aggiungere 100 millilitri di reagente sensibilizzante a microonde per 30 secondi, quindi posizionare su uno shaker per due minuti.

Trascorsi i due minuti, versare il reagente sensibilizzante. Aggiungere 100 millilitri di acqua per microonde per 30 secondi e mettere su uno shaker per due minuti. Versare e ripetere per un totale di due cicli di lavaggio.

Ora aggiungi 100 millilitri di soluzione colorante, cuoci nel microonde per 30 secondi e agita lentamente per cinque minuti. Trascorsi i cinque minuti, versare la soluzione colorante. Aggiungere 100 millilitri di acqua reagente, saltare il microonde, passare e posizionare direttamente su uno shaker per 20-60 secondi.

Scartare l'acqua e aggiungere immediatamente 100 millilitri della soluzione di sviluppo e sviluppare fino a quando le bande proteiche diventano visibili. Con lo sfondo che rimane chiaro, ci vorranno circa 5-10 minuti. A questo punto, aggiungi 10 millilitri di soluzione di tappo allo sviluppatore per arrestare lo sviluppo e ottenere i migliori risultati.

Fotografare il gel il prima possibile poiché potrebbero esserci lievi cambiamenti nell'intensità del colore e aumenti di elementi di sfondo non specifici. Nel tempo, il gel che stai vedendo contiene proteine residue Dopo l'elettrotamponamento, asciuga il gel per mantenere una registrazione permanente o conservalo in un sacchetto di plastica sigillabile. Successivamente, dimostriamo un metodo per colorare i gel in modo fluorescente.

I coloranti fluorescenti presentano una serie di vantaggi rispetto ai tradizionali coloranti proteici. Le colorazioni in gel proteico all'arancia Cipro, che illustreremo qui, possono rilevare da uno a due nanogrammi di proteine per banda. Questo è più sensibile della colorazione blu brillante kamasi e sensibile come molte tecniche di colorazione dell'argento.

La colorazione fluorescente è semplice con meno tempo a disposizione delle mani rispetto ai tipici protocolli di colorazione dell'argento ed è completa in meno di un'ora. Le proteine colorate possono essere visualizzate utilizzando un transluminatore UV standard da 300 nanometri o uno scanner laser. In questo caso, utilizzeremo nuovamente un mini gel prefabbricato in vitrogeno per iniziare a preparare e separare le proteine utilizzando la pagina SDS.

Tuttavia, utilizzare lo 0,05% di SDS nel buffer in esecuzione anziché il consueto 0,1% di SDS per ridurre la fluorescenza in background. Per iniziare la procedura di colorazione, versare la soluzione colorante fluorescente all'arancia cipro in un piccolo piatto di plastica per uno o due mini gel di dimensioni standard. Utilizzare circa 50 millilitri di soluzione colorante.

È importante notare che i piatti macchiati devono essere puliti e risciacquati bene prima dell'uso poiché eventuali detersivi interferiranno con la macchia. Ora, metti il gel nella soluzione colorante. Copri il contenitore con un foglio di alluminio per proteggere il colorante dalla luce intensa.

Agitare delicatamente il gel a temperatura ambiente per 40-60 minuti. Scartare la soluzione colorante e quindi risciacquare il gel per meno di un minuto con acido acetico al 7,5%, circa 100 millilitri per rimuovere la macchia in eccesso dalla superficie del gel, trattenere il gel incubando per una notte allo 0,1% tra 20 per visualizzare e fotografare le bande proteiche. Posizionare il gel marcato con fluorescenza direttamente su un transluminatore standard da 300 nanometri o su un transluminatore a luce blu.

Successivamente, dimostreremo un metodo alternativo di colorazione fluorescente, che utilizza il colorante fluorescente a rubino Cipro. Il metodo di colorazione del rubino Cipro è stato progettato appositamente per l'uso in pagine bidimensionali, ma ha dimostrato di essere il colorante per gel proteico più sensibile per la pagina SDS unidimensionale standard. Per iniziare, trasferire il gel in una capsula pulita in polipropilene o PVC di dimensioni adeguate.

Incubare il gel nella quantità appropriata di colorante di gel di proteina cipro rubino non diluito con agitazione delicata continua su un agitatore orbitale a 50 giri/min. Coprire il gel e incubare per almeno tre ore. Trasferire il gel in una pirofila pulita e lavarlo una volta in una soluzione al 10% di metanolo e acido acetico al 7%, recuperare e riposizionare il gel sul bilanciere per 30 minuti.

Al fine di ridurre la fluorescenza di fondo e aumentare la sensibilità, il gel è ora pronto per essere visualizzato e fotografato. Voglio ringraziarvi per aver guardato i protocolli di oggi oggi. Vi abbiamo mostrato una serie di procedure diverse per visualizzare le proteine dopo l'elettroforesi.

Alcuni sono molto sensibili, come la colorazione fluorescente e la colorazione con argento, e alcuni sono di routine come la colorazione blu kamasi. È importante ricordare che la purezza dei reagenti è fondamentale. Anche l'uso di acqua ultra pura è molto importante, così come i tempi su ciascuno dei passaggi.

È necessario prestare molta attenzione a questo per ottenere anche risultati riproducibili. Questo è tutto e buona fortuna per la tua prossima serie di esperimenti.