Colorazione proteine ​​in gel

In un video precedente intitolato Separazione elettroforetica di proteine, abbiamo dimostrato come una miscela complessa di proteine possa essere separata mediante elettroforesi su gel. In questo video, vi mostreremo quattro diversi metodi di colorazione del gel per visualizzare la posizione delle proteine all'interno del gel. Ciao, sono Sean Gallagher di UVP che collabora con il Centro di Proteomica presso l'Istituto Graduate KEG.

Oggi vi mostrerò diverse tecniche per la visualizzazione delle proteine dopo la separazione mediante elettroforesi. Queste includono la colorazione con blu di Kamasi, cyro orange e cyro ruby. Cominciamo dunque con la colorazione con blu di Kamasi.

Il rilevamento delle bande proteiche in un gel mediante colorazione con blu di Kamasi dipende dal legame non specifico di un colorante. In questo caso, blu brillante di Kamasi G due 50. In questo metodo, le proteine separate in un gel di poli acrilamide vengono lavate utilizzando acqua ad alta purezza.

La localizzazione delle proteine viene quindi rilevata utilizzando una colorazione acquosa con blu di kamasi. Il limite di rilevamento è compreso tra 0,3 e un microgrammo per banda proteica. Per iniziare, partire da un gel di poli acrilamide in cui le proteine sono state separate mediante elettroforesi.

Mescolando lentamente, posizionare il gel di poliacrilamide in un contenitore di plastica riempito con 300 millilitri di acqua ad alta purezza. Lasciare per cinque minuti. Scartare l'acqua e ripetere altre due volte dopo il terzo lavaggio.

Versare l'acqua e coprire il gel con la soluzione colorante blu Kamasi per un'ora, agitando lentamente. Trascorsa un'ora di colorazione, versare via la soluzione colorante. Risciacquare brevemente il gel ponendolo in circa 200 millilitri di acqua per 30 minuti. A questo punto, il gel può essere conservato in acqua per successive analisi di imaging.

Il gel può anche essere essiccato in questa fase per conservare una registrazione permanente del gel. Per fare ciò, posizionare il gel su due fogli di carta filtrante Watman tre mm e coprire la parte superiore con pellicola trasparente. Quindi essiccare in un essiccatore per gel tradizionale per una o due ore a circa 80 gradi celsius.

Un altro metodo di colorazione delle proteine è la colorazione argentica, che illustreremo ora. Sebbene il metodo di colorazione con blu di Kamasi sia più semplice e rapido, la colorazione argentica è notevolmente più sensibile, con un limite di rilevamento di 0,3 nanogrammi di BSA. Il rilevamento di bande proteiche in un gel mediante colorazione argentica dipende dal legame dell'argento con diversi gruppi chimici presenti nella proteina.

Il seguente protocollo si basa sul kit per colorazione argentica Silver Quest di in Vitrogen. Il protocollo deriva dal metodo di colorazione rapida, della durata di circa 30 minuti, ed è rappresentativo di una delle numerose chimiche a base di kit utilizzate per la colorazione argentica compatibile con la spettrometria di massa. In questo caso, utilizzeremo un gel mini preformato di in Vitrogen prima di iniziare la colorazione argentica.

Assicurarsi di indossare sempre guanti per evitare contaminazioni da impronte digitali. Posizionare il gel in un contenitore idoneo per microonde con 100 millilitri di acqua di grado reagente. Risciacquare brevemente e quindi versare via l'acqua.

Successivamente, aggiungere 100 millilitri di fissativo, composto da etanolo al 40%, acido acetico al 10% in acqua ad alta purezza, e trattare al microonde per 30 secondi. Il trattamento a microonde abbrevia i passaggi di incubazione necessari accelerando il legame e la colorazione. A questo punto, posizionare il gel su un agitatore e agitare lentamente per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, versare il fissativo, aggiungere 100 millilitri di etanolo al 30% e scaldare in microonde per 30 secondi, quindi posizionare il gel su un agitatore per cinque minuti. Dopo cinque minuti, eliminare l'etanolo. Aggiungere ora 100 millilitri di reagente sensibilizzante, scaldare in microonde per 30 secondi, quindi posizionare su un agitatore per due minuti.

Dopo due minuti, versare via il reagente sensibilizzante. Aggiungere 100 millilitri di acqua di grado reagente, riscaldare al microonde per 30 secondi e posizionare su un agitatore per due minuti. Versare via e ripetere per un totale di due cicli di lavaggio.

Ora aggiungere 100 millilitri di soluzione di colorazione, riscaldare al microonde per 30 secondi e agitare lentamente per cinque minuti. Trascorsi i cinque minuti, versare via la soluzione di colorazione. Aggiungere 100 millilitri di acqua di grado reagente, saltare il passaggio al microonde e posizionare direttamente su un agitatore per 20-60 secondi.

Scartare l'acqua e aggiungere immediatamente 100 millilitri della soluzione di sviluppo, sviluppando fino a quando le bande proteiche diventano visibili. Con lo sfondo che rimane chiaro, questo richiederà approssimativamente da cinque a dieci minuti. A questo punto, aggiungere 10 millilitri di soluzione arrestante allo sviluppatore per interrompere lo sviluppo e ottenere i migliori risultati.

Fotografare il gel il prima possibile, poiché potrebbero verificarsi lievi variazioni nell'intensità del colore e un aumento di elementi di fondo non specifici. Nel tempo, il gel che si osserva contiene proteine residue. Dopo l'elettroblotting, asciugare il gel per conservare una registrazione permanente oppure conservarlo in un sacchetto di plastica richiudibile. Successivamente, illustriamo un metodo per la colorazione fluorescente dei gel.

I coloranti fluorescenti presentano diversi vantaggi rispetto alle colorazioni proteiche tradizionali. Le colorazioni per gel proteici con cipro arancione, che illustreremo qui di seguito, possono rilevare da uno a due nanogrammi di proteina per banda. Questa sensibilità è maggiore rispetto alla colorazione con blu brillante di kamasi e paragonabile a quella di molte tecniche di colorazione argentica.

La colorazione fluorescente è semplice, richiede meno tempo manuale rispetto ai tipici protocolli di colorazione argentica ed è completata in meno di un'ora. Le proteine colorate possono essere visualizzate utilizzando un transilluminatore UV standard a 300 nanometri o uno scanner laser. In questo caso, utilizzeremo nuovamente un gel mini preconfezionato in vitro per preparare e separare le proteine mediante elettroforesi SDS-PAGE.

Ma utilizzare SDS allo 0,05% nel buffer di corsa invece dell'usuale SDS allo 0,1% per ridurre la fluorescenza di fondo. Per iniziare la procedura di colorazione, versare la soluzione di colorazione fluorescente cipro in una piccola capsula di plastica per uno o due gel mini di dimensioni standard. Utilizzare circa 50 millilitri di soluzione di colorazione.

È importante notare che le vaschette per la colorazione devono essere pulite e risciacquate accuratamente prima dell'uso, poiché eventuali residui di detersivo interferirebbero con la colorazione. Ora, posizionare il gel nella soluzione di colorazione. Coprire il contenitore con carta d'alluminio per proteggere il colorante dalla luce intensa.

Agitare delicatamente il gel a temperatura ambiente per 40-60 minuti. Scartare la soluzione di colorazione, quindi risciacquare il gel per meno di un minuto con acido acetico al 7,5%, usando circa 100 millilitri per rimuovere l'eccesso di colorante dalla superficie del gel. Mantenere il gel incubandolo tutta la notte in tween 20 allo 0,1% per visualizzare e fotografare le bande proteiche. Posizionare il gel marcatto con fluoroforo direttamente su un transilluminatore standard a 300 nanometri o su un transilluminatore a luce blu.

Successivamente, illustreremo un metodo alternativo di colorazione fluorescente che utilizza il colorante fluorescente Cipro ruby. Il metodo di colorazione con Cipro ruby è stato progettato specificamente per l'uso in elettroforesi bidimensionale, ma si è rivelato il colorante per gel proteici più sensibile per l'elettroforesi standard monodimensionale in SDS page. Per iniziare, trasferire il gel in un contenitore pulito in polipropilene o PVC di dimensioni adeguate.

Incubare il gel nella quantità appropriata di colorante proteico per gel Cipro Ruby non diluito, con agitazione continua e delicata su un agitatore orbitale a 50 giri/min. Coprire il gel e incubare per almeno tre ore. Trasferire il gel in una vaschetta pulita per colorazione e lavarlo una volta con una soluzione al 10% di metanolo e 7% di acido acetico, recuperare il gel e riposizionarlo sul rocker per 30 minuti.

Per ridurre la fluorescenza di fondo e aumentare la sensibilità, il gel è ora pronto per essere osservato e fotografato. Desidero ringraziarvi per aver seguito i protocolli di oggi. Vi abbiamo mostrato diverse procedure per la visualizzazione delle proteine dopo l'elettroforesi.

Alcuni sono molto sensibili, come la colorazione fluorescente e la colorazione con argento, e altri sono di routine, come la colorazione con blu di kamasi. È importante ricordare che la purezza dei reagenti è fondamentale. L'uso di acqua ultrapura è altrettanto molto importante, così come i tempi di ciascuna delle fasi.

È necessario prestare molta attenzione a questo aspetto per ottenere anche risultati riproducibili. Questo è tutto e buona fortuna nei tuoi prossimi esperimenti.