Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di studiare i bioeffetti indotti dalla cavitazione nel confinamento microfluidico utilizzando il pattern di superficie per controllare con precisione la generazione di bolle tandem e la posizione e la forma delle singole cellule bersaglio. Questo sistema microfluidico consente la sperimentazione di queste bolle e cellule di cavitazione di transito che è rilevante per la pubblicazione terapeutica e sonora e il funzionamento del suono. Il vantaggio principale di questa tecnica deriva dal migliorare la precisione della modellazione superficiale.

Ci permette di studiare i bioeffetti delle singole cellule ed è un alto carico di flusso da un'interazione affidabile bolla-bolla. La dimostrazione visiva delle procedure è fondamentale in quanto la modellazione della superficie e la preparazione delle celle nelle fasi del chip sono complesse e coinvolgono varie tecniche e punte. Eseguire tutte le procedure di microfabbricazione in una camera bianca indossando una tuta per camera bianca.

Progetta l'area di ogni punto d'oro entro 25-30 micron quadrati, in modo che sia abbastanza grande da assorbire l'energia laser per la generazione di bolle, ma abbastanza piccolo da evitare che le singole cellule vi aderiscano. Pulire il vetrino in una cappa chimica secondo il protocollo di testo, quindi procedere alla cappa di rivestimento rotante. Programmare lo spin coder per accelerare a 1000 giri/min in due secondi e mantenere tale velocità per cinque secondi, quindi farlo rampare a 3000 giri/min in tre secondi e mantenere tale velocità per 30 secondi.

Quindi, fissare il vetrino al centrifugo utilizzando l'aspirapolvere. Quindi, coprire il vetrino con P20 e iniziare la centrifuga. Quindi, applicare il fotoresist negativo NFR utilizzando lo stesso ciclo.

Ora, cuocete lo scivolo su una piastra calda a 95 gradi centigradi per 60 secondi. Una volta raffreddato a temperatura ambiente eseguire la fotolitografia. Montare la maschera cromata sull'allineatore della maschera e assicurarsi che il lato del modello sia rivolto verso il basso verso il vetrino.

Quindi, impostare la ricetta della fotolitografia sulla modalità di esposizione dura con nove secondi di esposizione ai raggi UV e allineare il substrato di vetro con la maschera. Dopo l'esposizione ai raggi UV, cuocere il vetrino a 95 gradi Celsius per un minuto, quindi lasciarlo raffreddare come prima. Per sviluppare il motivo sul vetrino, metterlo nella soluzione di sviluppo per 60 secondi, quindi lavare il vetrino con acqua distillata e asciugarlo con azoto gassoso.

Dopo aver confermato il modello mediante ispezione microscopica, cuocere il vetrino a 120 gradi Celsius per cinque minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Ora, pulire il vetrino con il plasma nella macchina per l'incisione ionica reattiva per 90 secondi a 500 tor e 100 watt. Utilizzando un evaporatore a fascio di E, fissare il campione al supporto della piastra.

Programmare la macchina per depositare uno strato di titanio a 5 nanometri, seguito da uno strato d'oro a 15 nanometri. Una volta completata questa posizione, ventilare la macchina. Quindi, immergere il vetrino per una notte in un becher di solvente per la rimozione dei fotoresist per rimuovere l'oro che poggia sopra il resist NFR.

Il giorno successivo, lavare il vetrino con acetone, seguito da IPA e poi asciugarlo con azoto. Sciacquare il vetrino con acqua deionizzata e asciugarlo nuovamente con azoto. Ora, riscalda lo scivolo a 115 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi, pulire il vetrino con motivo a punti d'oro utilizzando un essiccatore al plasma di ossigeno a 100 watt per 90 secondi. Impostare l'area di ciascuna isola codificata con fibronectina in modo che sia compresa tra 700 e 900 micron quadrati per facilitare un'adeguata diffusione delle cellule hela in una regione quadrata, riducendo al minimo le possibilità di aggregazione di più cellule sull'isola. La fabbricazione è molto simile a quella del modello d'oro.

Girare la codifica del vetrino come prima utilizzando il fotoresist positivo S18 e cuocere sulla codifica a 115 gradi Celsius. Quindi, eseguire la fotolitografia, allineando i segni sulla maschera con quelli sul substrato. Controllare il motivo sulla parte centrale per confermare l'angolo corretto e regolare la distanza di distanziamento dai punti dorati al modello H.

Eseguire l'esposizione ai raggi UV per nove secondi senza post-cottura. La differenza successiva è che la fase di sviluppo richiede solo 45 secondi. Per l'incisione ionica reattiva, impostare i parametri su 500 per 100 watt e 90 secondi.

Quindi, applicare una goccia di soluzione passivante per peg PLLG su un pezzo di pellicola di paraffina e inserire la soluzione sul lato del modello del vetrino. Evitare di intrappolare le bolle. Dopo 45 minuti, rimuovere il vetrino dalla pellicola.

Sciacquare lo scivolo con acqua deionizzata e poi asciugarlo con azoto. Quindi, immergere il vetrino consecutivamente nel dispositivo di rimozione del fotoresist 1165. Quindi il 50 percento di 1165 in acqua deionizzata.

Poi solo acqua deionizzata. Durante ogni bagno, agitare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni per 90 secondi. Ora, asciuga il vetrino su una piastra calda, quindi sigillalo in un essiccatore e conservalo a 4 gradi Celsius.

Assemblare i vetrini in un chip a microcanali come descritto nel protocollo di testo. Prestare particolare attenzione a schermare l'area modellata del substrato di vetro con la piccola lastra PDMS prima di utilizzare l'incisione ionica reattiva per rimuovere il piolo PLLG dall'area periferica. Recuperare il vetro modellato dalla macchina RIE e rimuovere la piccola lastra PDMS.

Dopo aver trattato il PDMS a microcanali con una dose ridotta di plasma di ossigeno, allinearlo al substrato di vetro modellato sotto uno stereoscopio. Portare il PDMS a microcanali e il substrato di vetro modellato in contatto conforme. Ora, procedi con l'uso del chip.

Innanzitutto, adescare il chip facendo scorrere il PBS lungo il microcanale per 30 minuti a un microlitro al minuto. Quindi infondere il chip con una soluzione di fibronectina per 45 minuti alla stessa portata. Nell'attesa, prepara le cellule a cinque milioni di cellule per millilitro.

Lo stato di salute e l'alta confluenza sono fondamentali per questa procedura. Successivamente, sostituire la soluzione che scorre attraverso il chip con PBS e aumentare la portata a dieci microlitri al minuto. Lascia scorrere il PBS per cinque minuti.

Quindi, iniettare le cellule preparate nel chip con una siringa. Quando una goccia è fuoriuscita dal tubo, interrompere l'iniezione e bloccare l'uscita. Quindi, metti il chip in un'incubatrice per 30 minuti.

Successivamente, rilasciare l'uscita e lavare il chip con terreno di coltura cellulare a dieci microlitri al minuto per cinque minuti. Dopo cinque minuti, abbassare il flusso a 0,75 microlitri al minuto e trasferire il chip e la pompa in un'incubatrice per due ore. Dopo due ore, procedere con la generazione di bolle in tandem visualizzando il chip al microscopio invertito con due laser NDI pulsati su controlli di temporizzazione diretti al modello di punti d'oro e con una telecamera ad alta velocità pronta a catturare i risultati.

Per bolle da 50 micron, impostare il ritardo tra i due laser a 2,5 microsecondi e impostare la loro potenza a dieci microjoule. Quindi, sincronizza la registrazione della telecamera ad alta velocità con i laser e registra a due milioni di fotogrammi al secondo con esposizioni di 200 nanosecondi. Pertanto, vengono registrate le dinamiche dell'espansione delle bolle, dell'interazione bolla-bolla di collasso e della formazione dei getti.

Le interazioni bolla-bolla e una varietà di bioeffetti indotti dalla cavitazione sono state studiate a livello di singola cellula utilizzando la tecnica descritta, come le interazioni transitorie delle bolle tandem con la formazione del getto, la visualizzazione del campo di flusso risultante e il calcolo della velocità del getto. Il flusso di getto direzionale attorno alla bolla tandem è di circa dieci metri al secondo, è largo circa dieci micron ed è quindi in grado di produrre uno stress e un gradiente di stress impulsivi e localizzati sulle cellule bersaglio vicine. È stata studiata anche la deformazione della membrana cellulare indotta da bolle tandem.

La deformazione e il recupero della membrana sono evidenziati dallo spostamento di perle funzionalizzate attaccate al bordo anteriore della membrana cellulare. Dalle coordinate di una triade di perline adiacenti, è stata calcolata la deformazione dell'area locale. Questo schema mostra la variazione massima dell'area in diverse posizioni sulla superficie della cella.

Il bordo d'attacco è principalmente allungato, mentre il bordo d'uscita o i lati laterali della cella sono compressi, indicando l'eterogeneità e la deformazione della cella prodotta dal flusso di getto indotto da bolle tandem. La variazione temporale della deformazione dell'area sul bordo d'attacco della cella è composta da poche oscillazioni rapide seguite da un allungamento ampio e sostenuto per circa 100 microsecondi e da un successivo recupero graduale su una scala temporale di diversi millisecondi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un'interazione bolla-bolla controllabile per studiare i bioeffetti di singole cellule con forma e posizione controllate dal pattern superficiale.

Dopo questa procedura, altre misure come l'assottigliamento del citoscheletro e l'imaging coniugale possono essere ulteriormente eseguite per studiare il riarrangiamento del citoscheletro cellulare del trattamento con bolle tandem. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'ecografia subpretica per esplorare i bioeffetti indotti dalla captazione a livello di singola cellula. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una buona confluenza cellulare e le condizioni per il successo durante il patterning cellulare.

Non dimenticare che lavorare con prodotti chimici e laser per camere bianche può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e occhiali laser.