Name: Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri gli effetti biologici della cavitazione in microfluidica utilizzando il patterning superficiale per controllare la generazione di bolle e il posizionamento cellulare. Questo metodo permette di studiare la porazione della membrana e la risposta del calcio intracellulare a livello di singola cellula.

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Vorremmo riconoscere l'uso della struttura di camera bianca SMIF presso la Duke University. Vogliamo anche ringraziare Hao Qiang per la sua assistenza nella misurazione della velocità del getto. Gli autori ringraziano Todd Rumbaugh di Hadland Imaging per aver fornito la fotocamera Shimadzu HPV-X utilizzata in questo studio. Il lavoro è stato finanziato in parte dal NIH attraverso le sovvenzioni 5R03EB017886-02 e 4R37DK052985-20.

1. Microfabbricazione NOTA: Tutte le procedure di microfabbricazione vengono eseguite in una camera sterile. Una maschera di cromo è progettato prima della microfabbricazione, vedi Figura 2. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig2.jpg" /> Figura 2: Schema del disegno di canale nel chip microfluidica e le dimensioni delle unità di lavoro. a) progettazione maschera del PDMS microcanali allineati (verde) e i modelli sul substrato di vetro (blu e rosso). b) l&#39;immagine ingrandita del disegno maschera in una sezione rappresentativa degli array di unità di lavoro. c) Schema di una unità di lavoro che mostra un modello di cellule (blu) e una coppia di punti d&#39;oro (rosso). Tutte le scale di lunghezza sono mostrati in basso a destra. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un lar</a>Versione ger di questa figura. <ol><li> Patterning dot oro NOTA: L&#39;area di ogni punto oro è progettato per essere entro 25-30 micron 2, in modo che sia sufficientemente grande da assorbire energia laser per la generazione di bolle, ma abbastanza piccolo per evitare singole cellule aderenti ad essa. Un diagramma schematico per il punto dell&#39;oro fabbricazione è mostrato in figura 3a. <ol><li> Vetrino pulizia (in una cappa chimica) <ol><li> Lavare il vetrino con acetone seguito da alcol isopropilico (IPA), e poi asciugare con il flusso di N 2. </li><li> Bagnare il vetrino in soluzione Piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) per 10 min. </li><li> Estrarre la slitta, sciacquarlo con acqua deionizzata, e poi asciugare con il flusso di N 2. </li><li> Cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 120 ° C per 10 min. </li><li> Trattare il vetrino in un Asher al plasma a 100 W per 90 s. </li></ol></li><li> Spin-rivestimento (Cappuccio spin-coating) <ol><li> Accendere una piastra riscaldante e attendere che la temperatura è stabile a 95 ° C. </li><li> Seguire la procedura di rivestimento: 1.000 rpm per 5 s con a / s rampa di 500 giri al minuto; poi 3.000 rpm per 30 s con / s rampa 1.000 rpm. </li><li> Fissare il vetrino pulito sul dispositivo a induzione rotazione mediante l&#39;applicazione di un vuoto. </li><li> Coprire la superficie di scorrimento con P-20 e inizia la ricetta rivestimento. </li><li> Ripetere il processo di rivestimento per photoresist NFR-negativo. </li><li> Cuocere la diapositiva a 95 ° C per 60 s e attendere che si raffreddi fino a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> fotolitografia <ol><li> Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato modello sia rivolto verso lo scivolo. </li><li> Impostare la ricetta fotolitografia al modo di esposizione disco con 9 s di esposizione UV e rapidamente allineare il substrato di vetro con la maschera. </li><li> Dopo aver effettuato l&#39;esposizione UV, cuocere la diapositiva a 956; C per 1 minuto, e poi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Sviluppo <ol><li> Sviluppare il modello sul vetrino in soluzione di sviluppo per 60 s. </li><li> Rimuovere il vetrino da parte dello sviluppatore, lavare con acqua deionizzata e asciugarlo con il flusso di N 2. </li><li> Controllare la geometria modello sotto un microscopio, e misurare e registrare la dimensione del tratto. </li></ol></li><li> Deposizione di oro (e-beam evaporazione) e decollo <ol><li> Cuocere la diapositiva a 120 ° C per 5 minuti, e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Pulire il vetrino con il plasma nella macchina reattiva attacco con ioni (RIE) per 90 s a 500 Torr e 100 W. </li><li> Deposito 5 nm di Ti e 15 nm di Au sul vetrino utilizzando un evaporatore a fascio 17. </li><li> Immergere il vetrino notte in un bicchiere di vetro contenente rimozione fotoresist solvente per rimuovere l&#39;appoggio oro sulla parte superiore della NFR resistere. </li><li> Recuperare la slitta, i flusht con acetone seguito da IPA, e asciugare con il flusso di N 2. </li><li> Asciugare il vetrino su una piastra calda a 115 ° C prima di pulirlo nel Asher plasma di ossigeno a 100 W per 90 s. </li></ol></li></ol></li><li> Molecular-assemblaggio patterning dal lift-off (MAPL) Nota: L&#39;area di ogni isola fibronectina rivestite è impostato per essere all&#39;interno di 700-900 micron 2 per facilitare un adeguato cellule HeLa diffondendo in una regione quadrata, riducendo al minimo le probabilità di più celle aggregano sull&#39;isola. Un diagramma schematico per la preparazione di isole cell-patterning è mostrato in Figura 3b. <ol><li> spin coating <ol><li> Ripetere passaggio 1.1.2, ma utilizzare photoresist S1813-positivi e una temperatura di 115 ° C. </li></ol></li><li> fotolitografia allineato <ol><li> Montare la maschera cromata sul allineatore maschera e fare in modo che il lato con il modello sia rivolta verso lo scivolo con ilpunti d&#39;oro. </li><li> Impostare la ricetta fotolitografia per modalità di esposizione duro con 9 s di esposizione ai raggi UV. </li><li> Allineare la maschera superiore con la slitta inferiore utilizzando segni di allineamento, situati intorno al bordo della maschera, come riferimento spaziale. </li><li> Controllare la porzione centrale della maschera e verificare che le funzioni di ripetizione sono allineate. </li><li> Completa l&#39;esposizione ai raggi UV, senza un post-cottura. </li></ol></li><li> Sviluppo <ol><li> Ripetere il passaggio 1.1.3, ma con 45 s di sviluppo prima di asciugare su una piastra e la conservazione in N 2 di stoccaggio. </li></ol></li></ol></li><li> trattamento chimico <ol><li> Preparare la soluzione passivante: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 tampone HEPES mM. </li><li> Recuperare il vetrino da N 2 stoccaggio e pulirlo con RIE con l&#39;impostazione del parametro: 500 Torr pressione, potenza 100-W, e 90-s durata. </li><li> Pipettare una goccia di passivazione soluzione su una porzione di pellicola di paraffina. &lt;/ Li&gt; <li> Sandwich la soluzione con il film e la slitta, assicurandosi che il lato con il modello caratteristiche sia rivolta verso il film; evitare la formazione di bolle. </li><li> Attendere 45 minuti prima di rimuovere il vetrino dal film. </li><li> Immergere il vetrino consecutivamente in rimozione fotoresist, rimozione fotoresist e acqua deionizzata (1: 1), e acqua deionizzata, e agitarsi in un bagno a ultrasuoni per 90 s per ogni ammollo. </li><li> Essiccare il vetrino su una piastra per rimuovere l&#39;umidità prima di sigillare in un essiccatore e riporlo in frigorifero. </li></ol></li><li> assemblaggio di chip <ol><li> Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.4, ma con photoresist SU8-2025-negativo e l&#39;impostazione dei parametri di cui ha chiamato il protocollo Microchem 18, per preparare uno stampo in silicone con un fotomaschere. </li><li> Realizzare un microchannel PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm L x P x A) e una lastra PDMS piccola (800 micron a livello di struttura di scanalatura) utilizzando la litografia soffice. </li><li> Punch il microchannel per porte di accesso fluido e pulirlo con del nastro adesivo e poi con IPA. </li><li> Schermare la zona modellata del substrato di vetro con la lastra PDMS, e applicare RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) per rimuovere PLL-g-PEG dalla zona periferica. </li><li> Trattare il microcanali con una dose ridotta di RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s) e quindi allinearla al substrato di vetro modellata (con la piccola lastra PDMS rimossa); portare il microcanali e il substrato di vetro modellato a contatto conformazionale sotto uno stereoscopio. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig3.jpg" /> Figura 3: Schemi di microfabbricazione e chip di assemblaggio. a) Modello di punti d&#39;oro sul substrato di vetro. b) Preparazione del substrato di vetro per patterning cellulare tramite MAPL. c) Montaggio del canale microfluidica con incollaggio al plasma. Vedere l&#39;elenco dei materiali per le definizioni of le abbreviazioni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> adesione cellulare NOTA: cellule HeLa sono normalmente mantenute in DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di antibiotici soluzione / antimitotici in un incubatore di coltura cellulare. Un diagramma schematico per il fissaggio assemblaggio di chip e la cella è mostrato in figura 3c. <ol><li> Prime il chip con PBS per 30 minuti a 1 ml / min, e quindi infusione soluzione fibronectina (50 mg / ml in PBS, 1 ml / min) per 45 min. </li><li> Durante l&#39;attesa, trypsinize coltura cellulare con 0,25% tripsina-EDTA, lavarli in terreno di coltura, le cellule individuali centrifuga, e ricostituire la sospensione cellulare in pre-riscaldato (37 ° C) al mezzo di coltura 5x10 6 cellule / ml. </li><li> Sostituire la soluzione fibronectina con PBS e lavare il chip a 10 microlitri / min per 5 min. </li><li> Iniettarela sospensione cellulare preparata nel chip, fermare il flusso, morsetto presa, e mantenere il chip in un incubatore di coltura cellulare per 30 min. </li><li> Rilasciare la presa e lavare il chip con mezzo di coltura cellulare a 10 microlitri / min per 5 min. Ridurre la portata perfusione del mezzo di coltura a 0,75 ml / min e mantenere la coltura cellulare per 2 ore in incubatore. </li></ol></li></ol> 2. Generazione Bubble e visualizzazione del flusso NOTA: Uno schema del setup sperimentale è mostrato in figura 4a per la generazione di bolle tandem e l&#39;interazione flusso risultante con una singola cellula coltivata vicino in un canale microfluidico. <ol><li> Generazione di tandem bolle con due laser e di controllo di temporizzazione <ol><li> Posizionare il chip microfluidica sul palcoscenico di un microscopio invertito e allineare il foci di due Nd pulsati: YAG (λ = 532 nm, 5 ns durata impulso) su un paio di punti d&#39;oro fantasia separati By 40 micron. </li><li> Utilizzare un generatore di ritardo digitale per far scattare i due laser con un ritardo di circa 2,5 ms per la produzione di due bolle avviate presso i punti d&#39;oro. </li><li> Regolare l&#39;energia di uscita del laser (~ 10 μJ) per produrre un diametro massimo delle bolle a meno di 50 ± 2 micron. </li><li> Sincronizzare una macchina fotografica ad alta velocità (esposizione di 200 ns e 2 milioni di fotogrammi al secondo (fps)) per i laser e catturare le dinamiche di espansione della bolla, il collasso, l&#39;interazione bolla-bolla, e la formazione del getto. </li></ol></li><li> La quantificazione della velocità del getto <ol><li> Registrare la posizione della punta jet (J 1) all&#39;estremità prossimale della prima bolla (B 1) e l&#39;estremità distale di B 1, a partire dalla generazione della bolla secondo (B 2) e termina con l&#39;atterraggio di J 1 verso l&#39;estremità distale del B 1; vedi lo schema in figura 5a. </li><li> Linearmente adattare il periodo di tempo della posizione per Both prossimale (jet punta) e le estremità distali. Calcolare la pendenza della posizione della punta rispetto alla curva tempo per l&#39;estremità prossimale per determinare la velocità del getto. L&#39;intersezione delle due linee indica il tempo jet atterraggio. Maggiori dettagli possono essere trovati in riferimento 19. </li></ol></li><li> Visualizzazione del campo di moto bolla indotta tandem <ol><li> Preparare 1 micron di polistirolo (PS) la sospensione delle sferette in acqua deionizzata (2,6% w / v) e iniettare le perline nel chip microfluidica. </li><li> Genera bolle tandem come descritto al punto 2.1.1-2.1.3. </li><li> Registrare le dinamiche bolle in tandem con una videocamera ad alta velocità ad una velocità di 5 fps M con un tempo di esposizione di 100 ns. </li><li> Carica la sequenza di immagini acquisite in un software PIV commerciale. </li><li> Dividere ogni immagine in piccole finestre di interrogatorio di 16 x 16 pixel (px) con una sovrapposizione del 75%. </li><li> Applicare iterazione multi-pass e filtri regionali di ridurre gli errori in campo di velocità di calcolo, euscita i risultati in una mappa vettore velocità. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig4.jpg" /> Figura 4: Schema del setup sperimentale e registrazione delle immagini. a) messa a punto sperimentale per la generazione di bolle in tandem. b) Sequenza temporale utilizzata per diversi tipi di acquisizioni di imaging. FL: microscopia a fluorescenza, BF: campo chiaro, IFT: tempo di interframe. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Single-cella di analisi e di effetti biologici NOTA: La bolla tandem è prodotto vicino alle cellule bersaglio, e gli effetti biologici risultanti sono studiati in maniera distanza dipendente dalla situazione di stallo. La sequenza temporale per i diversi tipi di acquisizioni d&#39;immagine è mostrata in Figura 4b. <ol><li>Poration membrana e l&#39;assorbimento macromolecolare NOTA: L&#39;assorbimento di macromolecole extracellulari nella cellula bersaglio è caratterizzata dalla progressiva diffusione di membrana impermeant ioduro di propidio (PI) attraverso il sito tion sulla membrana cellulare. <ol><li> Seguendo passo 1.5, sostituire il terreno di coltura regolare (cioè, DMEM) con la soluzione PI (100 mg / ml in DMEM) con almeno una portata di perfusione di 0,5 microlitri / min per tutto l&#39;esperimento. </li><li> Programmare il software di controllo del microscopio per selezionare automaticamente il cubo fluorescente PI sulla torretta girevole e sincronizzare la temporizzazione della camera CCD con l&#39;eccitazione di fluorescenza PI per catturare immagini di fluorescenza con un tempo di esposizione di 200 ms. </li><li> Dopo i due fuochi laser sono allineati ad una coppia di punti d&#39;oro accanto a una cellula bersaglio, registrare sia in campo chiaro (BF) e le immagini di fluorescenza (FL) prima del trattamento bolla tandem. </li><li> Utilizzare un software di controllo del microscopio a subitoavviare un time-lapse registrazione delle immagini di fluorescenza della cellula bersaglio subito dopo la fase 2.1 per catturare la storia del PI assorbimento. </li></ol></li><li> deformazione Membrane <ol><li> Preparare 1-micron perline (1% w / v, attivati ​​con carbodiimide solubile in acqua) e funzionalizzare con Peptide-2000 (100 mg / ml in PBS). </li><li> Seguendo passo 1.5, incubare le cellule attaccate con le perline funzionalizzati ad una densità di 1x10 9 perline / ml a 37 ° C per 30 min. </li><li> Ripetere il passaggio da 2.1 a produrre le bolle tandem accanto alla cella di destinazione e registrare la deformazione cellulare con una fotocamera ultra-alta velocità in esecuzione a una velocità di 5 milioni di fps. </li><li> Identificare una triade di 3 perline che rimangono sul piano di imaging tutto l&#39;esperimento e compilare le loro posizioni come (x 1, y 1) (x 2, y 2) e (3 x, y 3) nell&#39;esperimento coordinate. </li><li> Calcolare l&#39;area della triade prima e afIl TER trattamento bolla tandem con la formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq1.jpg" /></li><li> Calcolare il ceppo zona come: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq2.jpg" /></li><li> Sulla base delle coordinate dei tre vertici prima e dopo il trattamento bolla tandem, calcolare il principale sforzo e deformazione locale zona seguendo protocolli stabiliti 20,21. </li></ol></li><li> Viabilità e apoptosi NOTA: FITC annessina V etichette cellule, comprese quelle apoptotico, attraverso l&#39;esternalizzazione della fosfatidilserina (fluorescenza verde). PI etichette nuclei delle cellule necrotiche (fluorescenza rossa). immagini campo luminoso è usato per documentare la morfologia cellulare e per aiutare con l&#39;identificazione di vitalità cellulare e apoptosi. <ol><li> Registrare la posizione di ciascuna cella trattata nel canale microfluidica (facilitata dalle etichette di indirizzo del canale, vedere figura 2b </strong&gt;), mentre ripetendo il punto 3.1. </li><li> Incubare le cellule trattate nel mezzo di coltura cellulare per altre 2 h prima di perfusione del chip con soluzione FITC annessina V per 15 min. cellule positive mostrano fluorescenza verde. </li><li> Ripetere il punto 3.3.2 24 ore dopo il trattamento bolla tandem per studiare le bioeffetti a lungo termine delle cellule bersaglio. </li></ol></li><li> risposta di calcio <ol><li> Mescolare 3 ml di Fura-2 Am stock soluzione (1 mg / ml in DMSO) con 3 ml di 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ml di mezzo di siero ridotta per preparare la soluzione di etichettatura finale (6 mM). </li><li> Seguendo passo 1.5, sostituire il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di etichettatura e incubare a temperatura ambiente al buio per 40 minuti (1 ml / min di perfusione). </li><li> Riempire il canale con il mezzo di siero ridotto (0,75 ml / min di perfusione) prima di iniziare l&#39;esperimento cella. </li><li> Inizia l&#39;imaging raziometrico (lunghezza d&#39;onda: 340/380 nm, l&#39;esposizione di 50 ms)della cellula bersaglio utilizzando il sistema PTI commerciale. </li><li> Dopo 10 s dell&#39;imaging raziometrica della cella a livello di riposo, produrre le bolle tandem come al punto 2.1; primo record con un tempo interframe (IFT) di 0,1 s per 1 minuto, quindi aumentare l&#39;IFT di 1 s per un altro minuto, e l&#39;ulteriore incremento di 5 s dopo 2 min. </li><li> Utilizzare il software PTI per calcolare il rapporto R = F340 / F380 nella regione di interesse (ROI), che è proporzionale alla concentrazione di calcio intracellulare. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Analisi cella singola, in combinazione con il live-cell imaging, ha notevolmente migliorato la nostra comprensione dei processi dinamici e spesso variabile in singole cellule, come lo sviluppo del fenotipo e la risposta immunitaria 23. In contrasto con la coltura cellulare convenzionale piatti o flaconi, sistemi microfluidici permettono un controllo preciso del microambiente, fino al livello di singola cellula, in tempo reale. Di conseguenza, i progressi nella tecnologia microfluidica e tecniche sono in gran ...

Vi è una crescente consapevolezza che eterogeneità cellulare, derivanti dall&#39;espressione stocastico di geni, proteine e metaboliti, esiste all&#39;interno di una vasta popolazione cellulare e serve come un principio fondamentale in biologia per consentire l&#39;adattamento delle cellule ed evoluzione 1. Pertanto, è spesso imprecisi e inaffidabili utilizzare misurazioni di massa di popolazione comprendere la funzione delle singole cellule e le loro interazioni. Lo sviluppo di nuove tecnologie per l&#39;analisi singola cellula è pertanto di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, e può essere utilizzato, ad esempio, per meglio comprendere le vie di segnalazione e processi chiave in biologia delle cellule staminali e la terapia del cancro 2-4. Negli ultimi anni, l&#39;emergere di piattaforme microfluidici ha notevolmente facilitato l&#39;analisi singola cellula, in cui il posizionamento, il trattamento, e l&#39;osservazione della risposta da singole cellule sono state eseguite con strategie analitiche innovative 5. La cavitazione svolge un ruolo importante in una vasta gamma di applicazioni biomediche, compreso il trattamento di tumori di High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) 6, la frammentazione non invasivo di calcoli renali con onda d&#39;urto litotripsia (SWL) 7, droga o gene consegna da sonoporazione 8, e la distruzione recentemente riportato di cellule o tessuti da idrodinamica 9,10 bolla di cavitazione. Nonostante ciò, i processi dinamici della bolla di cavitazione (s) interazioni con tessuti e le cellule biologiche non sono state ben comprese. Ciò è dovuto alla casualità in cavitazione iniziazione e bolle dinamiche prodotte dagli ultrasuoni, onde d&#39;urto, e la pressione idraulica locale; Inoltre, vi è una mancanza di permettere tecniche per risolvere le risposte intrinsecamente complesse e veloci di cellule biologiche, in particolare a livello di singola cellula. A causa di queste sfide, non è sorprendente che pochissimi studi hanno apen segnalato per indagare le interazioni bolla-cellula in condizioni sperimentali ben controllate. Ad esempio, poration membrana delle cellule individuali intrappolato in sospensione 11 e la grande deformazione impulsiva di globuli rossi umani 12 è stata dimostrata utilizzando laser generato singole bolle in canali microfluidica. Quest&#39;ultima tecnica, tuttavia, può produrre solo molto piccola deformazione in cellule eucariotiche per la presenza del nucleo 13. Inoltre, è difficile controllare bioeffetti valle quando trattando le cellule in sospensione. In altri studi, gli ultrasuoni l&#39;eccitazione di un (o mezzo di contrasto ecografico) microbolle cellule-bound per la produzione di membrane poration e / o risposte intracellulari di calcio in singole cellule aderenti stato segnalato 8. All&#39;incorporazione membrana di singole cellule aderenti può essere prodotto utilizzando bolle tandem laser generato in un sottile strato liquido contenente Trypan blue soluzione che assorbe la luce 14, oda una bolla di gas oscillante generato da impulsi laser microsecondo che irradiano attraverso un substrato otticamente assorbente in microchambers 15. Rispetto, il substrato otticamente assorbente ha un vantaggio rispetto alla soluzione Trypan blu laser assorbente perché quest&#39;ultimo è tossico per le cellule. Ancora più importante, le bolle laser generati sono più controllabili in termini di dimensioni e la posizione della bolla di bolle acusticamente eccitati. Tuttavia, in tutti questi studi precedenti, la forma delle cellule, l&#39;orientamento e condizioni di aderenza non erano controllati, che possono influenzare sostanzialmente la risposta cellulare e effetti biologici prodotti dalle sollecitazioni meccaniche 16. Per ovviare a questi inconvenienti in studi precedenti, abbiamo recentemente sviluppato un sistema sperimentale per la generazione di bolle, patterning cella, interazioni bubble-bubble-cellulari, e in tempo reale biosaggi di risposta delle cellule in un chip microfluidico costruita utilizzando una combinazione unica di microfabbricazione tecniques. Tre caratteristiche principali che contraddistinguono il nostro sistema sperimentale da altri nel campo sono: 1) il patterning di punti d&#39;oro micron dimensioni sul substrato di vetro per consentire l&#39;assorbimento laser localizzato per la generazione della bolla 17; 2) il patterning di isole micron di dimensioni di matrice extracellulare (ECM) per l&#39;adesione cellulare sullo stesso substrato di controllare sia la posizione e geometria delle singole celle; e 3) la compressione della dimensione del dominio di interazione bubble-bubble-cellulare da 3D a uno spazio quasi-2D per facilitare la visualizzazione nel piano di interazioni bolla bolle, getto campi di flusso, deformazioni cella, e bioeffetti, tutti catturati in una sequenza di immagini snella (Figura 1d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig1.jpg" /> Figura 1: Il chip microfluidica e schemi di saggi differenti. a) Un chip microfluidica assemblato con canali riempito con inchiostro blu<html> per la visualizzazione. b) Una regione all&#39;interno del chip microfluidico con celle motivi geometrici e punti d&#39;oro (la distanza tra i due punti d&#39;oro in prossimità è 40 micron). Molte coppie di unità di lavoro possono essere disposti in un canale. c) Immagine del primo piano di una singola unità di lavoro costituito da una coppia di punti d&#39;oro e una cellula HeLa aderito alla regione cellula-patterning. d) Schema del funzionamento del dispositivo. Una singola cellula aderisce e si diffonde sulla &quot;H&quot; isola a forma rivestito con fibronectina. Un paio di bolle di cavitazione (bolle tandem) con oscillazione anti-fase viene prodotta illuminando raggi laser pulsati sui punti d&#39;oro (vedi figura 4a), che porta alla generazione di un getto veloce e localizzato muovendo verso la cellula bersaglio vicina. La cella può essere deformata, porata per l&#39;assorbimento macromolecolare, e / o stimolato con una risposta di calcio, a seconda della distanza distanziatore (S d) della cella alla bolla tandem.f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Questa piattaforma può essere ulteriormente combinato con saggi di fluorescenza e perline funzionalizzati attaccati alla superficie cellulare per bioeffetti cavitazione indotta. In particolare, questa piattaforma apre la strada a test affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l&#39;analisi di tandem bolla indotta deformazione della membrana cellulare, poration cellulare e captazione intracellulare, la vitalità, apoptosi, e la risposta del calcio intracellulare. Nella seguente protocollo, si descrive il processo di fabbricazione di chip e la procedura per analizzare i vari effetti biologici sopra menzionati. Inoltre, sono anche descritti operazioni del chip.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente/Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 mm x 38 mm Vetrini per microscopio semplici</td><td>Corning</td><td>2947-75X38</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>Reagente ACS, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>di alcol isopropilico</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>W292907</td><td>&ge; 99,7%, FCC, FG</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320501</td><td>Reagente ACS, 95,0-98,0%</td></tr> <tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30% in peso in H2O</td></tr><tr><td>Primer P-20</td><td>Microchem</td><td>MCC Primer 80/20</td><td></td></tr><tr><td>NFR Photoresist</td><td>JSR</td><td>NFR016D2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Photomask Photoplotstore</td><td>N/A</td><td>4x4 Maschera a scrittura diretta</td></tr><tr><td>MF-319 Sviluppatore</td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>Microposit MF-319</td><td></td></tr><tr><td>1165 Photoresist Remover</td><td>Dow Chemical, Co. </td><td>DEM-10018073</td> Fotoresist S1813 <td>a base di 1-metil-2-pirrolidinone</td></tr><tr><td></td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>S1813</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Film di paraffina</td><td>HACH</td><td>251764</td><td></td></tr><tr><td>SU-2025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Microbore Tubo</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>Perni in metallo</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>Tubo tagliato (dritto), 0,025 " OD x 0,017" ID x 0,50" Celle HeLa lunghe</td></tr><tr><td></td><td>Duke Cell Culture Facility</td><td>(307-CCL-2) HeLa, p.148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) tampone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteina bovina, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21493</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere carbossilate 1.00&nbsp; &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>08226-15</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere carbossilate 2.00&nbsp; &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18327-10</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Peptite-2000</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5020-5MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13199</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>F-127</td><td>invitrogen</td><td>P6866</td><td>0.2 &micro; m filtrato (soluzione al 10% in acqua)</td></tr><tr><td>Terreni sierici ridotti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma asher</td><td>Emitech</td><td>K-1050X</td><td>O2 / Ar incenerimento al plasma di fotoresist e altri materiali organici</td></tr><tr><td>Allineatore maschera</td><td>SUSS MicroTec&nbsp;</td><td>Karl Suss MA6 / BA6</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore a fascio di energia CHA</td><td>Industries CHA Industries</td><td>Soluzione E-Beam</td><td></td></tr><tr><td>RIE</td><td>Trion Technology&nbsp;</td><td>Trion Technology Phantom II</td> <td>(ossido/nitruro/polimero) etching</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>AmScope</td><td>American Scope SM-4TZ-FRL</td><td>Stereomicroscopio</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Chemyx Inc</td><td>NanoJet</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>NuAire</td><td>AutoFlow NU-8500 Camicia d'acqua CO2 Incubatore</td><td></td></tr><tr><td>Armadi di sicurezza biologica</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>1122s</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>IEC</td><td>Centra CL2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser&nbsp; (laser 1)</td><td>Laser New Wave Research</td><td>Tempest</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG (laser 2)</td><td>New Wave Research</td><td>Orion</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di ritardo</td><td>Berkeley Nucleonics</td><td>BNC 565-8c</td><td></td></tr><tr><td>Lampada flash</td><td>Dyna-Lite</td><td>ML1000 tubo flash</td><td></td>accoppiato</tr><tr><td>a fibra fotocamera ad alta velocità</td><td>DRS Hadland</td><td>&nbsp; Telecamera ad alta velocità Imacon 200</td><td></td></tr> Telecamera ad alta velocità <tr><td></td><td>Shimadzu</td><td>HPV-X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vision Research</td><td>Phantom V7.3</td><td></td></tr><tr><td>Software PIV</td><td>LaVision</td><td>DaVis 7.2</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc 5</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>PTI System</td><td>Horiba</td><td>S/N: 1705 RAM-X</td><td></td></tr><tr><td>EasyRatio software</td><td>Horiba</td><td>Easy Ratio Pro 2</td><td>versione 2.3.125.86</td></tr><tr><td>63&volte; obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>LD Plan Neofluar</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema microfluidic con patterning superficie per indagare cavitazione bubble (s) interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In questo manoscritto, abbiamo prima descriviamo il protocollo fabbricazione di un chip microfluidico, con punti d&#39;oro e regioni fibronectina rivestite sullo stesso substrato di vetro, che controlla appunto la generazione di bolle tandem e cellule individuali modellata nelle vicinanze con sedi e forme ben definite. Abbiamo poi dimostrare la generazione di bolle tandem utilizzando due laser pulsati illuminanti un paio di punti d&#39;oro con un ritardo di tempo alcuni microsecondi. Visualizziamo l&#39;interazione bolla-bolla e la formazione di jet da immagini ad alta velocità e caratterizzano il campo di moto risultante utilizzando l&#39;immagine di particelle velocimetria (PIV). Infine, vi presentiamo alcune applicazioni di questa tecnica per l&#39;analisi singola cellula, tra cui poration cella a membrana con l&#39;assorbimento macromolecola, deformazioni della membrana localizzata determinato dagli spostamenti di perline integrine vincolante attaccati, e la risposta di calcio intracellulare dalle immagini raziometrico. I nostri risultati mostrano che un flusso di getto veloce e direzionale è proprodotta dall&#39;interazione bolla tandem, che può imporre una sollecitazione di taglio altamente localizzata sulla superficie di una cellula coltivata in prossimità. Inoltre, diversi effetti biologici possono essere indotti alterando la forza del flusso di getto regolando la distanza standoff dalla cella alle bolle tandem.

La piattaforma microfluidica descritto in questo lavoro può essere usato per studiare le interazioni bolla-bolla e per analizzare una varietà di effetti biologici cavitazione indotta a livello di singola cellula. Qui, presentiamo alcuni esempi per dimostrare una varietà di studi sperimentali e saggi biologici che possono essere eseguite nel nostro sistema sperimentale. Per prima illustrare le interazioni transienti di bolle tandem con la formazione del getto, la visualizzazione del campo...

Un chip microfluidico è stato fabbricato per produrre coppie di punti d'oro per la generazione di bolle tandem e isole rivestite di fibronectina per il patterning di singole cellule nelle vicinanze. Il campo di flusso risultante è stato caratterizzato dalla velocimetria dell'immagine delle particelle ed è stato impiegato per studiare vari bioeffetti, tra cui la porzione della membrana cellulare, la deformazione della membrana e la risposta intracellulare del calcio.

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è studiare gli effetti biologici indotti dalla cavitazione in un ambiente microfluidico confinato, utilizzando un patterning superficiale per controllare con precisione la generazione di bolle in serie e la posizione e la forma delle singole cellule bersaglio. Questo sistema microfluidico consente di sperimentare su bolle di cavitazione transitorie e cellule, un approccio rilevante per applicazioni terapeutiche e per la pubblicazione e l'uso di ultrasuoni. Il principale vantaggio di questa tecnica deriva dal miglioramento della precisione ottenuto grazie al patterning superficiale.Consente di studiare gli effetti biologici su singole cellule ed è caratterizzato da un elevato carico del flusso grazie a un'affidabile interazione tra bolla e bolla. La dimostrazione visiva delle procedure è fondamentale poiché la definizione dei modelli superficiali e la preparazione delle cellule nei passaggi del chip sono operazioni complesse che richiedono diverse tecniche e accorgimenti. Eseguire tutte le procedure di microfabbricazione in una stanza pulita indossando l'apposita tuta da camera bianca.Progettare l'area di ciascun punto in oro compresa tra 25 e 30 micrometri quadrati, in modo che sia sufficientemente grande da assorbire l'energia laser per la generazione di bolle, ma abbastanza piccola da evitare l'adesione di singole cellule. Pulire il vetrino in una cappa chimica seguendo il protocollo descritto nel testo, quindi procedere sotto la cappa per la deposizione mediante centrifugazione. Programmare il dispositivo di spin coating in modo che acceleri a 1000 giri al minuto in due secondi e mantenga tale velocità per cinque secondi, quindi aumenti a 3000 giri al minuto in tre secondi e mantenga tale velocità per 30 secondi.Successivamente, fissare la lametta di vetro al spin coater utilizzando il vuoto. Poi, ricoprire la lametta con P20 e avviare il ciclo di centrifugazione. Successivamente, applicare il photoresist negativo NFR utilizzando lo stesso ciclo.Ora, cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 95 gradi Celsius per 60 secondi. Dopo averlo raffreddato a temperatura ambiente, eseguire la litografia a luce. Montare la maschera al cromo sul allineatore di maschere e assicurarsi che il lato con il disegno sia rivolto verso il basso, in direzione del vetrino.Successivamente, impostare la ricetta di fotolitografia sulla modalità di esposizione dura con nove secondi di esposizione ai raggi UV e allineare il substrato di vetro alla maschera. Dopo l'esposizione ai raggi UV, cuocere la lametta a 95 gradi celsius per un minuto, quindi farla raffreddare come in precedenza. Per sviluppare il pattern sulla lametta, immergerla nella soluzione sviluppatrice per 60 secondi, poi risciacquare la lametta con acqua distillata e asciugarla con gas azoto.Dopo aver confermato il pattern mediante ispezione al microscopio, cuocere il vetrino a 120 gradi celsius per cinque minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. A questo punto, pulire il vetrino con plasma nella macchina di incisione a ioni reattivi per 90 secondi a 500 tor e 100 watt. Utilizzando un evaporatore a fascio elettronico, fissare il campione al supporto della piastra con del nastro.Programmare la macchina per depositare uno strato di titanio di 5 nanometri, seguito da uno strato d'oro di 15 nanometri. Al termine di questa operazione, aerare la macchina. Successivamente, immergere la lametta per tutta la notte in un becher contenente solvente per la rimozione del photoresist, al fine di eliminare l'oro depositato sulla parte superiore del resist NFR.Il giorno successivo, lavare la lametta con acetone, seguito da IPA e quindi asciugarla con azoto. Sciacquare la lametta con acqua deionizzata e asciugarla nuovamente con azoto. A questo punto, riscaldare la lametta a 115 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi, pulire la lamella con il pattern di punti d'oro utilizzando un asher a plasma di ossigeno a 100 watt per 90 secondi. Impostare l'area di ciascun isolotto codificato per la fibronectina compresa tra 700 e 900 micrometri quadrati per favorire un adeguato appiattimento delle cellule HeLa in una regione quadrata, minimizzando al contempo la probabilità che più cellule si aggreghino sull'islotto. La fabbricazione è molto simile a quella del pattern d'oro.Centrifugare la lastrina come in precedenza utilizzando il fotoresist positivo S18 e cuocere la codifica a 115 gradi Celsius. Successivamente, eseguire la fotolitografia, allineando i segni sulla maschera con quelli sul substrato. Verificare il pattern nella porzione centrale per confermare l'angolo corretto e regolare la distanza tra i punti d'oro e il pattern ad H.Eseguire l'esposizione UV per nove secondi senza post-cottura. La successiva differenza consiste nel fatto che il passaggio di sviluppo richiede soltanto 45 secondi. Per l'incisione con ioni reattivi, impostare i parametri a 500 tor, 100 watt e 90 secondi.Quindi, applicare una goccia di soluzione passivante PLLG peg su un pezzo di pellicola di paraffina e porre a sandwich la soluzione sul lato con il motivo del vetrino. Evitare di intrappolare bolle d'aria. Dopo 45 minuti, rimuovere il vetrino dalla pellicola.Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata e quindi asciugarlo con azoto. Successivamente, immergere il vetrino consecutivamente nel rimuovitore di fotoresist 1165, seguito da una soluzione al 50 percento di 1165 in acqua deionizzata.Poi solo acqua distillata. Durante ogni bagno, agitare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni per 90 secondi. Ora, asciugare il vetrino su una piastra riscaldata, quindi sigillarlo in un essiccatore e conservarlo a 4 gradi Celsius.Assemblare i vetrini in un chip a microcanale come descritto nel protocollo testuale. Prestare particolare attenzione a schermare l'area strutturata del substrato di vetro con la piccola lastrina di PDMS prima di utilizzare l'incisione ionica reattiva per rimuovere il PLLG peg dall'area periferica. Recuperare il vetrino strutturato dalla macchina RIE e rimuovere la piccola lastrina di PDMS.Dopo aver trattato il microcanale in PDMS con una dose ridotta di plasma di ossigeno, allinearlo al substrato di vetro stampato sotto uno stereomicroscopio. Portare il PDMS del microcanale e il substrato di vetro stampato a contatto conformale. A questo punto, procedere all'utilizzo del chip.Prima, preparare il chip facendo scorrere PBS nel microcanale per 30 minuti a un flusso di un microlitro al minuto. Successivamente, infondere il chip con soluzione di fibronectina per 45 minuti allo stesso flusso. Nel frattempo, preparare le cellule a una concentrazione di cinque milioni di cellule per millilitro.Lo stato di salute e l'elevata confluenza sono fondamentali per questa procedura. Successivamente, sostituire la soluzione che scorre attraverso il chip con PBS e aumentare la velocità di flusso a dieci microlitri al minuto. Lasciare scorrere il PBS per cinque minuti.Successivamente, iniettare le cellule preparate nel chip mediante una siringa. Quando una goccia è fuoriuscita dal tubo, interrompere l'iniezione e chiudere l'uscita con una pinza. Quindi, posizionare il chip in un incubatore per 30 minuti.In seguito, rilasciare l'uscita e lavare il chip con mezzo di coltura cellulare a dieci microlitri al minuto per cinque minuti. Dopo cinque minuti, ridurre il flusso a 0,75 microlitri al minuto e trasferire il chip e la pompa in un incubatore per due ore. Dopo due ore, procedere con la generazione in serie di bolle osservando il chip al microscopio invertito con due laser NDI a impulsi sotto controllo temporale indirizzati sul pattern di puntini d'oro e con una telecamera ad alta velocità pronta a catturare i risultati.Per bolle di 50 micron, impostare il ritardo tra i due laser su 2,5 microsecondi e regolare la loro potenza a dieci microjoule. Successivamente, sincronizzare la registrazione della telecamera ad alta velocità con i laser ed effettuare registrazioni a due milioni di fotogrammi al secondo con esposizioni di 200 nanosecondi. In questo modo, vengono registrate le dinamiche di espansione della bolla, di interazione tra bolle durante il collasso e di formazione del getto.Sono stati studiati a livello di singola cellula le interazioni tra bolle e una varietà di bioeffetti indotti dalla cavitazione mediante la tecnica descritta, come le interazioni transitorie di bolle in serie con la formazione di getti, la visualizzazione del campo di flusso risultante e il calcolo della velocità del getto. Il flusso direzionale a getto attorno alla bolla in serie è di circa dieci metri al secondo, ha una larghezza di circa dieci micron ed è quindi in grado di generare uno sforzo di taglio impulsivo e localizzato e un gradiente di sforzo su cellule bersaglio vicine. È stata inoltre studiata la deformazione della membrana cellulare indotta da bolle in serie.La deformazione e il recupero della membrana sono evidenziati dallo spostamento di microsfere funzionalizzate attaccate al margine anteriore della membrana cellulare. A partire dalle coordinate di una terna di microsfere adiacenti, è stata calcolata la deformazione locale dell'area. Questo schema mostra la variazione massima dell'area in diverse posizioni sulla superficie della cellula.Il bordo anteriore è principalmente stirato, mentre il bordo posteriore o i lati laterali della cellula sono compressi, indicando un'eterogeneità e una deformazione cellulare prodotta dal flusso a getto indotto da bolle in serie. La variazione temporale della deformazione superficiale al bordo anteriore della cellula è composta da alcune rapide oscillazioni seguite da un allungamento intenso e prolungato per circa 100 microsecondi, e da un successivo recupero graduale su una scala temporale di alcuni millisecondi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare un'interazione controllabile tra bolle per studiare gli effetti biologici su singole cellule con forma e posizione controllate mediante patterning superficiale.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire ulteriori misurazioni, come l'assottigliamento del citoscheletro e l'imaging coniugale, per studiare il riarrangiamento del citoscheletro cellulare indotto dal trattamento con bolle in serie. Una volta sviluppata, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'ultrasuono subcritico per esplorare gli effetti biologici indotti dalla cavitazione a livello singola cellula. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di mantenere un'adeguata confluenza e condizione cellulare per garantire il successo del patterning cellulare.Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche per ambienti puliti e laser può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti e occhiali protettivi per laser devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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