Name: Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri l'elettroporazione microfluidica assistita da vortice per la consegna sequenziale di molecole in popolazioni cellulari identiche con controllo preciso del dosaggio.

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Questo lavoro è supportato dal programma Rowland Junior Fellow. Gli autori desiderano esprimere gratitudine ai ricercatori e al personale presso l&#39;Istituto Rowland ad Harvard: Chris Stokes per il suo aiuto nello sviluppo della, configurazione controllo della pressione custom-built computer-assistita, Diane Schaak, Ph.D. per il suo ingresso per la manipolazione dei campioni biologici, Winfield Hill per sviluppare l&#39;installazione elettrica, Alavaro Sanchez, Ph.D. per concedere l&#39;accesso al citofluorimetro, Scott Bevis, Kenny Spencer e Don Rogers per la lavorazione di componenti idraulici meccanici necessari per l&#39;installazione di pressione. Maestri microfluidica sono stati realizzati presso il Centro per Nanoscale Systems (CNS) presso la Harvard University.

1 Cella Preparazione <ol><li> Tavola 1 × 10 5 cellule / ml di metastatico linea di cellule di cancro al seno MDA-MB-231 in un volume di 10 ml per tessuti pallone di coltura T75 a Leibovitz L-15 Medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 1 % di penicillina-streptomicina. </li><li> Incubare MDA-MB-231 cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C con 0% di CO 2 ambiente. </li><li> Celle di raccolta per esperimenti di 2 giorni dopo la semina trattando le cellule con il 0,25% tripsina-EDTA per 2 min e inattivano l&#39;attività enzimatica di tripsina con l&#39;aggiunta di 8 ml di terreno di coltura. </li><li> Cellule pellet di centrifugazione per 5 minuti a 200 × g e risospendere in tampone fosfato di Dulbecco (DPBS, 1x senza Ca 2 + e Mg 2 +) ad una concentrazione finale di 5 × 10 5 cellule / ml. </li></ol> 2. Dispositivo progettazione e fabbricazione NOTA: La maschera, invenzioni stampo master e ilprocesso di inclusione a microcanali devono essere condotte all&#39;interno di una stanza pulita mentre il polidimetilsilossano (PDMS) processo di fusione a microcanali può essere eseguito su un normale banco di laboratorio. <ol><li> Progettare un dispositivo di microfluidica, come illustrato nella figura 1 con AutoCAD. Il dispositivo deve essere composto da un ingresso con porte multiple di iniezione, filtri grossolani e due inerziali concentrandosi canali rettangolari parallele (L = 7 mm, L = 40 micron, e H = 70 micron). Canale rettilineo individuale si compone di 5 camere di elettroporazione, che sono posti a 800 micron a parte (W C = 400 micron), con due fori per il tramite elettrodi di alluminio. Due camere elettroporazione trasversalmente adiacenti condividono il foro per l&#39;elettrodo negativo. Due canali semplici si fondono in una presa a valle della regione elettroporazione. </li><li> Convertire il file CAD con micro-modelli in un file GDSII utilizzando LinkCAD. Scrivere le micro-pattern su un 5 &quot;x 5&quot; fotomaschera vuotoutilizzando uno scrittore maschera laser. Sviluppare la maschera seguendo il protocollo del produttore. NOTA: Il processo di sviluppo di fotoresist maschera comprende sviluppo, cromo incisione e resistere rimozione. In alternativa, micro-disegni stampati su una elevata trasparenza risoluzione (&gt; 20.000 dpi) può essere acquistato da un produttore di terze parti e utilizzato come fotomaschera. Caratteristiche microscala finale su una fotomaschera devono essere trasparenti per abbinare la polarità di un photoresist negativo. </li><li> Realizzare lo stampo colata del disegno dispositivo utilizzando tecniche di litografia soffice standard di 23 con un cappotto photoresist negativo filata su un wafer di silicio da 4 pollici a 2.000 giri per avere lo spessore finale di 70 micron. </li><li> Precottura il wafer con photoresist negativo per 20 min a 95 ° C. </li><li> Contatta l&#39;maschera con la cialda ed esporre ad una sorgente UV (17,4 mJ / cm 2) per 80 secondi usando un allineatore maschera. </li><li> Sviluppare il wafer esposto per 4 min in uno sviluppatore SU-8. </li><li> Misurare ilspessore fotoresist sviluppato utilizzando un profilometro di superficie. </li><li> Rigorosamente mescolare un rapporto 10: 1 di elastomero di agente (kit elastomero di silicone) curare e versare il composto nello stampo di fusione per generare repliche PDMS. Degasare il elastomero casting per 30 min e curare lo stampo di colata con elastomero degasata in stufa a 70 ° C per 2 ore. </li><li> Sfalda curato replica PDMS con modelli a microcanali dallo stampo e punzonatura fori per insenature, outlet e elettrodi inserimenti utilizzando una morsa pin. NOTA: Il normale diametro tagliente della morsa perno dovrebbe essere 0,76 millimetri, sufficiente per ben tenendo tubo PEEK (OD di 1/32 &quot;) ed elettrodi di alluminio (OD di 0,029&quot;) al posto. </li><li> Creare canali microfluidici racchiuso da incollaggio PDMS repliche di un vetrino trattato in un pulitore di ossigeno-plasma per 7 secondi ad una frequenza radio di potenza e pressione parziale di ossigeno di 75 W e 500 mTorr rispettivamente. </li></ol> 3. Esperimenti di flusso <ol><li> Inseriscielettrodi di alluminio (0.029 &quot;OD) e di un tubo di uscita PEEK (1/32&quot; OD) in luoghi designati attraverso fori nei microcanali (vedi Figura 3B). </li><li> Collegare l&#39;apparecchiatura elettrica 18 responsabili per la generazione di alta tensione impulsi di breve onda quadra agli elettrodi di alluminio (vedi Figura 3C) che sono a contatto con soluzioni che scorre nello stampo PDMS. NOTA: L&#39;apparecchiatura deve essere costituito da un generatore di impulsi e di un amplificatore ad alta tensione in-casa costruita 18. </li><li> Preparare quattro 50 ml provette contenenti singolarmente DPBS, soluzioni con le cellule e biomolecole, e collegare ogni tubo al suo rispettivo titolare flaconcino collegato al sistema di controllo di flusso pneumatico (Figura 3A). 18 </li><li> Collegare il tubo PEEK ingresso dai titolari delle fiale nei rispettivi fori di ingresso del dispositivo di microfluidica. </li><li> Impostare l&#39;ampiezza di impulsi ad onda quadra, V a 100 V per avere la fie elettricoforza ld, E = V / L e, attraverso la camera di elettroporazione essere equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Qui, L e è la distanza tra due punti in cui gli elettrodi positivi e negativi sono in contatto con la soluzione scorrevole (vedi Figura 1). </li><li> Impostare il regolatore di pressione a 40 psi. NOTA:. Una singola fonte di azoto regolabile manualmente viene utilizzata per pressurizzare in modo uniforme tutti i vial di campioni e di un collettore ad alta velocità è utilizzata per attivare tempestivamente porte di soluzioni individuali utilizzando il software LabVIEW custom-built 18 </li><li> Per il controllo della valvola, aprire il software LabVIEW custom-built marcato Valve Runner, e fare clic su Esegui dal menu a discesa dal titolo operano. </li><li> Attivare le valvole facendo clic su ciascuna icona valvola corrispondente. NOTA: L&#39;icona valvola dovrebbe diventare verde quando viene attivata. Facendo clic sull&#39;icona attiva si disattiva e chiudere la valvola. L&#39;icona valvola chiusa dovrebbe diventare grigio. </li><li> Aprire la valvola per il serbatoio DPBS (cioè., soluzione di lavaggio) per innescare la velocità di flusso necessario per la generazione di vortice cella-trapping stabile per 1,5 min. </li><li> Passare il porto soluzione attiva dalla soluzione di lavaggio alla soluzione cella per intrappolare le cellule nella camera di elettroporazione per 30 sec (cioè, la fase cellula-trapping). </li><li> Flusso entrambe le soluzioni di lavaggio e di cella attraverso il dispositivo contemporaneamente per 10 secondi prima della fase cellula-trapping per garantire flusso undisrupted durante la fase di soluzione di commutazione. NOTA: Questa breve fase di co-flusso dovrebbe essere ripetuto ad ogni passo-soluzione di commutazione. </li><li> Accendere il porto di lavaggio e lavare il dispositivo per 20 secondi al fine di rimuovere le cellule contaminanti non intrappolati. </li><li> Iniettare la soluzione contenente la prima molecola di interesse (0,2 mg / ml di 3.000 Da molecole di destrano neutro e anionico o 1,5 mg / ml di 70.000 Da molecola destrano neutro) nel dispositivo. </li><li> Applicare cinque impulsi brevi (Dt = 30 msec, con intervalli di 2 sec) subito dopo l&#39;iniezione delsoluzione molecolare e monitorare l&#39;entità e la durata degli impulsi elettrici applicati in tempo reale con un oscilloscopio. </li><li> Ripetere passo 3.10 tante volte quanto il numero di molecole aggiuntive da consegnare. Per ogni consegna molecolare, incubare le cellule per 100 s nella soluzione molecolare poi sciacquare il dispositivo con la soluzione di lavaggio per 100 s per rimuovere le molecole in eccesso. </li><li> Rilasciare le cellule in una piastra a 96 pozzetti per l&#39;analisi a valle abbassando la pressione di esercizio inferiore a 5 psi. NOTA: Circa 100 ml di soluzione con 100 cellule sono raccolti da ogni release. </li><li> Eseguire sperimentale passi 3.9 tramite 3.16 tre volte a raccogliere abbastanza cellule per citometria a flusso. </li><li> Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenenti cellule lavorati per 5 min a 228 × g. </li><li> Rimuovere il surnatante che contiene molecole fluorescenti in eccesso. </li><li> Risospendere le cellule in DPBS per citometria a flusso. </li><li> Le celle di carico nel citometro a flusso per u molecolareptake analisi di efficienza. </li></ol>

<ol><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Past+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li>
<li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li>
<li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li>
<li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li>
<li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li>
<li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanofluidics+based+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li>
<li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li>
<li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-assisted+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li>
<li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li>
<li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem-Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li>
<li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li>
<li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li>
<li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con la nuova piattaforma elettroporazione parallelizzati, aumento di 10 volte in velocità e l&#39;efficienza della consegna multi-molecola è stata ottenuta in aggiunta a tutti i meriti che il sistema monocamerale precedentemente sviluppato fornisce. Meriti 18 Precedentemente disponibili includono (i) pre-purificazione della colpire le cellule con distribuzione uniforme di formato per la valorizzazione vitalità, (ii) un controllo preciso e individuale dosaggio molecolare, e (iii) a bassa corrente elettrica ope...

Negli ultimi anni, l&#39;uso di impulsi elettrici per facilitare l&#39;erogazione citosolico di molecole extracellulari è diventato un dispositivo interessante per manipolare cellule di mammifero. 1 Questo processo, noto anche come elettroporazione, permeabilizes reversibilmente la membrana cellulare, permettendo membrana intrinsecamente molecole impermeabili per accedere di ambiente intracellulare delle cellule. Perché praticamente qualsiasi molecola può essere introdotto nel citoplasma tramite i pori temporanei creati nella membrana di qualsiasi tipo di celle utilizzando elettroporazione, la tecnica è stata segnalata come più riproducibile, universalmente applicabile, e più efficiente rispetto ad altri metodi, tra cui virus-mediata, chimica e gli approcci ottici. 2-3 Questa tecnica è stata utilizzata per introdurre molecole fluorescenti, 4 farmaci 5 e acidi nucleici 6-7, mantenendo le cellule vitali e intatto. Alla luce di questi vantaggi, l&#39;elettroporazione è stato adottato come un lavoro comunetorio tecnica per la trasfezione del DNA, in vivo terapia genica 8 e studi di vaccinazione cella. E &#39;, tuttavia, ancora difficile per i sistemi di elettroporazione convenzionali per ottenere contemporaneamente l&#39;efficienza pratica e la redditività per i campioni con grande eterogeneità in termini di dimensioni, perché la forza del campo elettrico necessario per l&#39;elettroporazione di successo è strettamente correlata con il diametro della cellula. Inoltre, tali sistemi non consentono un controllo preciso delle somme molecolari multipli consegnato a causa di affidamento sulle bulk processo stocastico consegna molecolare. 9 Al fine di risolvere questi problemi, molti gruppi hanno sviluppato piattaforme di elettroporazione microfluidica, offrendo il vantaggio di tensioni poration inferiori, migliore efficienza di trasfezione, una forte riduzione della mortalità delle cellule, e la capacità di fornire più molecole. 10-13 Tali vantaggi sono stati resi possibili grazie alle piccole orme dei sistemi di elettroporazione microscala il cui elettrodo passolunghezze sono sub-millimetri, drammaticamente diminuendo le tensioni necessarie per la consegna di successo. Inoltre, questi sistemi di elettroporazione microscala possono raggiungere una distribuzione uniforme del campo elettrico e rapidamente dissipare il calore generato, producendo una ridotta mortalità cellulare, migliorando l&#39;efficienza di consegna. L&#39;utilizzo di materiali trasparenti per questi microchip ulteriori permette osservazione in situ del processo di elettroporazione per la modifica dei parametri del prompt. 2,12 Tuttavia, il controllo preciso dosaggio e controllo molecular- e cellulare-dipendenti dei parametri, necessari per la ricerca e le applicazioni terapeutiche, 6 emergenti, 14-16 rimangono ancora irrisolti. Questo lavoro presenta un sistema di elettroporazione microfluidica vortice assistita, in grado di erogare più molecole sequenzialmente in una popolazione preselezionata identica di cellule bersaglio. Celle con distribuzione granulometrica uniforme sono isolati prima di elettroporazione utilizzando riportato in precedenza SImeccanismo ze-selettivi di cattura. 17-18 Avendo una distribuzione uniforme dimensioni, meno variazione di efficienza elettroporazione e una maggiore redditività per data intensità di campo elettrico sono stati raggiunti. 19 Inoltre, agitando continuamente cellule intrappolate utilizzando vortici microscala permesso per la consegna uniforme di molecole attraverso la intero citosol, in accordo con i risultati riportati in precedenza con un&#39;altra piattaforma elettroporazione vortice-assistita. 20 Per dimostrare che questo sistema sarebbe applicabile a una vasta gamma di molecole comunemente utilizzati in applicazioni biologiche, macromolecole con una vasta gamma di pesi molecolari sono state consegnate a cellule del carcinoma mammario metastatico. Inoltre, con l&#39;aiuto di monitoraggio del processo in tempo reale, questo lavoro fornisce ulteriori prove per mettere fine al lungo dibattito in piedi per quanto riguarda il meccanismo di consegna molecolare durante electrporation, essendo prevalentemente elettroforesi-mediata contro la diffusione mediata. 14 </sup&gt; A differenza di altri sistemi di elettroporazione, questa piattaforma offre unicamente i vantaggi combinati di preciso consegna multi-molecola, ad alta efficienza di consegna molecolare, mortalità cellulare minimale, per un&#39;ampia gamma di dimensioni e accuse di molecole consegnato, così come la visualizzazione in tempo reale della elettroporazione processo. Date queste funzionalità, il sistema di elettroporazione sviluppato ha un potenziale pratico come uno strumento versatile per gli studi di riprogrammazione cellulare, applicazioni di consegna della droga 6,14,21-22 10,19 e le applicazioni che richiedono per la comprensione approfondita dei meccanismi di erogazione di elettroporazione molecolari.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 linea cellulare tumorale</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15</td><td>Medium Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Detergente al plasma di ossigeno</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M profilatore di superficie</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ELASTOMERO SILICONICO KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto compresso gassoso</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore ad alta pressione</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore a valle</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>Collettore di valvole ad alta velocità 3/2 vie-8</td> Valvola di ritegno in linea <td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32" OD x 3/32" ID Tubi in poliuretano</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4" OD X 0,17" ID Tubi in poliuretano</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16" Tubi in PEEK</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32" Tubi in PEEK</td><td>Idex Salute e Scienza</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi per tubi in PEEK</td><td>Idex Salute e Scienza</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di impulsi</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Filo di alluminio</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga da 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di coltura T75</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Destrano, Tetrametilrodamina, 3.000 MW, Gibco anionico</td><td>, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Destrano, Tetrametilrodamina, 70.000 MW, Neutro</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3.000 MW, Gibco neutro</td><td>, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscala vortex-assistita elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Elettroporazione ha ricevuto crescente attenzione negli ultimi anni, perché è una tecnica molto potente per introdurre fisicamente non permeanti sonde molecolari esogeni in cellule. Questo lavoro riporta una piattaforma elettroporazione microfluidica in grado di effettuare la consegna molecola multiplo per cellule di mammifero con un controllo preciso e molecolare-dipendente parametro. La capacità del sistema di isolare le cellule con distribuzione di dimensione uniforme permette per meno variazione di efficienza elettroporazione per data intensità di campo elettrico; quindi una maggiore redditività del campione. Inoltre, la sua funzione di visualizzazione di processo consente di osservazione del processo di assorbimento molecolare fluorescente in tempo reale, che permette rapide regolazioni dei parametri consegna molecolari in situ per il miglioramento dell&#39;efficienza. Per mostrare le vaste funzionalità della piattaforma segnalati, macromolecole con diverse dimensioni e cariche elettriche (ad esempio, Destrano con MW di 3.000 e 70.000 Da) sono staticonsegnato alle cellule del cancro al seno metastatico con elevate efficienze di consegna (&gt; 70%) per tutte le molecole testate. La piattaforma sviluppata ha dimostrato il suo potenziale per l&#39;uso nella espansione dei campi di ricerca in cui on-chip tecniche di elettroporazione può essere utile.

Il elettroporatore microfluidica parallelo sviluppato consegnato macromolecole con dimensioni diverse e cariche elettriche nelle cellule viventi con carcinoma mammario metastatico. Consegna molecolare di successo è stato qualitativamente determinata monitorando i cambiamenti di intensità di fluorescenza delle cellule orbitanti elettroporate in situ e confermato da misurazioni quantitative mediante citometria a flusso. Figura 4A mostra che il 90% delle cellule trattate uptake 70.000 Da destrano ...

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l&#39;efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consegnare diversi tipi di molecole biologicamente significative in modo sequenziale e con controllo della dose, con elevata efficienza, utilizzando il poratore microfluidico assistito da vortice. Questo viene realizzato preparando innanzitutto quattro provette centrifughe da 50 millilitri contenenti ciascuna soluzioni DPBS con cellule e biomolecole, e collegando ogni provetta al relativo supporto per flaconi connesso al sistema di controllo pneumatico del flusso. Il secondo passaggio consiste nell'inserire i tubi di ingresso provenienti da ciascun flacone nel dispositivo microfluidico dotato di 15 elettrodi integrati. Successivamente, le cellule vengono fatte fluire nel dispositivo, dove rimangono intrappolate in vortici su scala microscopica formati nelle camere di elettroporazione.L'ultimo passaggio consiste nell'applicare impulsi elettrici brevi alle cellule intrappolate, seguito immediatamente dall'iniezione delle soluzioni contenenti le biomolecole da consegnare nel citosol. Alla fine, le cellule ottenute da questo processo possono essere rilasciate e raccolte per analisi successive. Il vantaggio principale di questa tecnic

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Un nuovo sistema di microfluidica è stato sviluppato utilizzando il fenomeno del pompaggio passiva e di un controllo utente del sistema di consegna del fluido. Questo sistema di microfluidica ha il potenziale per essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni biologiche dato il suo basso costo, facilità d'uso, precisione volumetrica, alta velocità, ripetibilità e automazione.

Alta velocità Droplet basato Delivery System per pompaggio passiva in dispositivi microfluidici

Uno strumento e chimici sono descritti per isolare sequenzialmente acidi nucleici seguite da proteine ​​da un campione senza la necessità di energia elettrica. Lo strumento consiste in un assorbente tenersi entro una pipetta di trasferimento, mentre le caratteristiche chimiche di isolamento si basano su una solida fase di estrazione dei principi. Le macromolecole isolati possono essere analizzati mediante saggi immuno-based e basato su PCR.

Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Viene descritto il protocollo per la fabbricazione e il funzionamento dei dispositivi di deumidificazione sul campo (Field-DW), così come gli studi preliminari sugli effetti dei campi elettrici sul contenuto delle goccioline.

Approfittando di ridotta interazione Droplet-superficie per ottimizzare il trasporto di Bioanalytes in microfluidica digitale

Questo protocollo descrive un'architettura di sistema per l'esecuzione di separazioni automatizzate di particelle di piccolo volume (0,15-1,5 ml) utilizzando un dispositivo microfluidico e discute i metodi per ottimizzare le prestazioni e il funzionamento del dispositivo acustofluidico.

Una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

Cella singola sequenza rivela eterogeneità genotipica nei sistemi biologici, ma le attuali tecnologie mancano la velocità effettiva necessaria per la profonda analisi della funzione e della composizione della Comunità. Qui, descriviamo un workflow di microfluidica per sequenziamento &gt; 50.000 unicellulare genomi da diverse popolazioni cellulari.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

I saggi di goccioline acqua-in-olio sono utili per la chimica analitica, l'evoluzione enzimatica e l'analisi di singole cellule, ma in genere richiedono microfluidica per formare le goccioline. Qui, descriviamo l'emulsificazione modellata con particelle, un approccio privo di microfluidi per eseguire saggi di goccioline.

L'emulsione con modellazione di particelle consente saggi di goccioline prive di microfluidi

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

Scopri l'elettroporazione microfluidica assistita da vortice per la consegna sequenziale di molecole in popolazioni cellulari identiche con controllo preciso del dosaggio.

Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

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