Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di erogare vari tipi di molecole biologicamente significative in modo sequenziale e controllabile in modo dosabile con alta efficienza utilizzando il porer microfluidico assistito da Vortex, questo si ottiene preparando prima quattro provette da centrifuga da 50 millilitri contenenti singolarmente soluzioni DPBS con cellule e biomolecole e collegando ciascuna provetta al rispettivo portafiale collegato al sistema di controllo del flusso pneumatico. Il secondo passaggio consiste nell'inserire i tubi di ingresso di ciascuna rispettiva fiala nel dispositivo microfluidico con gli elettrodi a 15 pin incorporati. Successivamente, le cellule vengono fatte fluire nel dispositivo dove vengono intrappolate in vortici su microscala formati nelle camere di elettroporazione.

Il passaggio finale consiste nell'applicare brevi impulsi elettrici alle cellule intrappolate, seguiti dall'iniezione delle soluzioni contenenti le biomolecole da somministrare nel citosol. In definitiva, le cellule ottenute da questo processo possono essere rilasciate e raccolte per l'analisi a valle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la tecnica proposta è in grado di fornire in sequenza una quantità controllata di più molecole in una popolazione cellulare identica preselezionata con elevata efficienza e vitalità.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di scambio dei fluidi sono difficili da apprendere a causa della tempistica della fase del flusso freddo in ogni soluzione. La fase di commutazione determina la stabilità dell'intrappolamento cellulare. In questa piastra sperimentale verrà utilizzata una linea cellulare metastatica di carcinoma mammario M-D-A-M-B 2 31 una volta da 10 a 5 cellule per millilitro in un volume di 10 millilitri per T 75 Pallone di coltura tissutale nel terreno L 15 di Leibovitz integrato con il 10% di volume per volume, siero fetale bovino e 1% di penicillina.

La streptomicina incuba le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un ambiente di anidride carbonica allo 0%. Due giorni dopo la semina, raccogli le cellule per gli esperimenti. Dopo aver lavato le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato bukos o DPBS, trattare le cellule con EDTA allo 0,25% di tripsina per due minuti.

Aggiungere otto millilitri di terreno di coltura per inattivare le cellule pellet ad attività enzimatica mediante centrifusion per cinque minuti a 200 volte G e il terreno risospeso fino a una concentrazione finale di cinque volte 10 per la quinta cellula per millilitro. La progettazione e la fabbricazione del dispositivo di elettroporazione microfluidica non saranno mostrate in questo video, ma sono descritte nel manoscritto di accompagnamento. Il sistema è costituito da ingressi per cellule, molecole e una soluzione a filo.

Due canali rettilinei dove avviene la focalizzazione inerziale. 10 camere di elettroporazione con elettrodi e un'uscita da allestire per gli esperimenti di flusso. Inserire una presa, un tubo in polietere, etere chetone o picco e l'elettrodo in alluminio a 15 pin per l'applicazione ad alta tensione a impulsi brevi nei punti designati attraverso i fori nel microcanale.

L'elettrodo a 15 pin è composto da 10 elettrodi positivi e cinque negativi. Ogni elettrodo positivo è distanziato di 1,5 millimetri da un elettrodo negativo e ogni elettrodo della stessa polarità è distanziato di 1,35 millimetri l'uno dall'altro. Collegare l'apparecchiatura elettrica per la generazione di impulsi a onda quadra corta ad alta tensione agli elettrodi di alluminio che sono a contatto con le soluzioni in movimento.

Nello stampo PDMS, l'apparecchiatura dovrebbe essere costituita da un generatore di impulsi e da un amplificatore ad alta tensione costruito internamente. Preparare quattro provette da centrifuga da 50 millilitri contenenti singolarmente DPBS e soluzioni con cellule e molecole. Collegare ciascuna provetta al rispettivo portafiala collegato al sistema di controllo pneumatico del flusso.

Collegare il tubo di ingresso del picco dai supporti della fiala ai rispettivi fori di ingresso nel dispositivo microfluidico. Quindi, imposta. L'ampiezza degli impulsi a onda quadra va da volt a 100 volt.

Per fare in modo che l'intensità del campo elettrico attraverso la camera di elettroporazione sia equivalente a 0,7 kilovolt per centimetro. Impostare il regolatore di pressione su 40 PSIA La singola fonte di azoto regolabile manualmente viene utilizzata per pressurizzare uniformemente tutte le fiale di campioni e utilizza un collettore ad alta velocità per attivare tempestivamente le singole porte della soluzione. Utilizzo del software lab view personalizzato per il controllo delle valvole.

Aprire il software di visualizzazione laboratorio etichettato valve runner e fare clic su Esegui dal menu a discesa intitolato Opera. Fare clic sull'icona della valvola corrispondente valvola uno per aprire la valvola per il serbatoio DPBS per innescare la velocità del flusso richiesta per la generazione stabile di vortice di intrappolamento delle celle per 1,5 minuti. L'icona della valvola dovrebbe passare da grigia a verde quando viene attivata il flusso, sia il lavaggio che le soluzioni cellulari attraverso il dispositivo contemporaneamente per 10 secondi prima della fase di intrappolamento delle celle.

Per garantire un flusso ininterrotto durante la fase di commutazione della soluzione, questa breve fase di coflusso deve essere ripetuta ad ogni fase di commutazione della soluzione. Commutare la porta della soluzione attiva dalla soluzione di lavaggio alla soluzione cellulare per intrappolare le celle nella camera di elettroporazione per 30 secondi. In questo filmato, i segnali fluorescenti blu rappresentano ganci praticabili.

Celle a 3, 3, 3, 4, 5 stadi. Accendere la porta di lavaggio e sciacquare il dispositivo per 20 secondi. Al fine di rimuovere le cellule contaminanti non intrappolate, fluisce la soluzione contenente la prima molecola di interesse.

Ioduro di propidio nel dispositivo per scopi di visualizzazione. In questa dimostrazione, i coloranti dell'acido nucleico vengono utilizzati al posto dei filamenti di DExT marcati in fluorescenza a causa del rapporto rumore/segnale superiore dei coloranti applicare cinque brevi impulsi prontamente dopo l'iniezione della soluzione molecolare, monitorare l'entità e il numero degli impulsi elettrici applicati in tempo reale utilizzando un oscilloscopio, i segnali fluorescenti delle molecole possono essere visualizzati al microscopio, Incubare le cellule per 100 secondi nella soluzione molecolare. Successivamente, la soluzione contenente la seconda molecola, il colorante dell'acido nucleico yo-yo uno nel dispositivo.

In questa dimostrazione, la seconda molecola viene erogata senza ulteriori applicazioni di impulsi elettrici. Questo filmato conferma che le cellule ora esprimono tutti e tre i segnali fluorescenti. Verde per lo yo-yo, uno, rosso per il propidio, lo ioduro e il blu per gli ami.

3, 3, 3, 4, 5. Rilasciare le celle in una piastra a 96 pozzetti per l'analisi a valle abbassando la pressione di esercizio al di sotto di cinque PSI. Da ogni rilascio vengono raccolti circa 100 microlitri di soluzione con 100 cellule.

La procedura di elettroporazione deve essere ripetuta almeno tre volte per raccogliere un numero sufficiente di cellule per la centrifuga di citometria a flusso. La piastra a 96 pozzetti contenente cellule trattate a 228 volte G per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il surnatante che contiene molecole fluorescenti in eccesso e risospendere le cellule in DPBS.

Se sono stati consegnati filamenti di DExT marcati in fluorescenza, le cellule vengono successivamente analizzate per l'assorbimento molecolare. Efficienza mediante citometria a flusso. Il successo della somministrazione molecolare è stato determinato qualitativamente monitorando i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza delle celle orbitanti elettroporate in C 2, che ha confermato che il 90% delle cellule trattate assorbe la molecola di filamento DExT ionico da 70.000 Dalton.

L'efficienza per ciascuna molecola di destrano trasferita, definita come il rapporto tra il numero di cellule che assorbono con successo la molecola di interesse e il numero totale di cellule processate, non variava sostanzialmente a seconda del peso molecolare o delle cariche elettriche. Tutte le molecole di destrano testate sono state erogate nel citosol con un'efficienza superiore al 70%Mostrati qui, i nostri profili di citometria a flusso rappresentativi per le cellule che non sono state trattate con elettroporazione. La soglia fluorescente che indica l'avvenuta somministrazione molecolare è impostata dai dati in modo tale che i segnali provenienti dai campioni di controllo si trovino al di sotto della soglia.

Questi dati rappresentativi della citometria a flusso per le cellule elettroporate in sequenza mostrano il grafico della citometria a flusso accanto alle immagini della striscia fluorescente, le caselle verdi rappresentano i segnali provenienti dalle cellule che ne assorbono 3000, solo il destrano neutro Dalton e le caselle rosse rappresentano i segnali provenienti dalle cellule. Assorbimento di 3000 Dalton, un filamento ionico di DExT, solo segnali fluorescenti dalle cellule, entrambe le molecole del filamento DExT mostrate in giallo indicano un'efficienza di consegna a doppia molecola del 56% dopo il suo sviluppo. Questa tecnica sarà utile ai ricercatori nel campo della medicina, delle biotecnologie e della farmacologia per esplorare la combinazione di reagenti terapeutici per ottenere effetti sinergici nel trattamento di malattie complesse.

Non dimenticare che lavorare con impulsi elettrici ad alta tensione può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come assicurarsi di essere collegati a terra.