Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le goccioline lipidiche dal tessuto. Ciò si ottiene sezionando e separando prima il tessuto placentare. Successivamente, le cellule dell'oleina vengono omogeneizzate.

Quindi gli organelli vengono separati da diverse fasi di centrifugazione. Infine, viene raccolto lo strato galleggiante contenente le goccioline lipidiche e vengono caratterizzate le gocce lipidiche. In definitiva, la microscopia a fluorescenza e l'analisi del sangue occidentale vengono utilizzate per mostrare la purezza della frazione di goccioline lipidiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile isolare le goccioline lipidiche dalla maggior parte delle cellule aortiche. Si noti che in alcuni tessuti, il numero di goccioline può essere inferiore a quello riducendo lo strato G fluttuante e il numero di goccioline. Le placente sono state raccolte da donne sane con gravidanze singole sottoposte a parto cesareo elettivo prima dell'inizio del travaglio spontaneo a termine, i soggetti hanno dato il consenso informato scritto per la raccolta della loro placenta.

La raccolta e il successivo utilizzo della placenta sono stati eseguiti con l'approvazione dell'Università del Tennessee e della University of Tennessee Graduate School of Medicine di Knoxville. Nella cappa di sicurezza biologica, trasferire la placenta in un contenitore sterile autoclavabile e lavare accuratamente il sangue dalla placenta e dalle membrane utilizzando soluzione fisiologica sterile. Gettare la soluzione salina sanguinante in un becher da un litro come rifiuto biologico liquido.

Posiziona la placenta su un campo sterile con questa superficie liscia che sostiene il cordone ombelicale rivolto verso l'alto con forbici e pinze affilate e a punta fine. Rimuovere il cordone ombelicale e le membrane fetali. Quindi, capovolgi la placenta in modo che la superficie materna sia rivolta verso l'alto.

Quindi rimuovere il tessuto della placca basale sovrastante a circa tre millimetri dalla superficie. Sezionare un elettrocatetere COTA alla volta, evitando la placca coriale, e raccogliere il tessuto villoso in un becher da 250 millilitri con soluzione fisiologica. Quindi utilizzare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% e una pinza per sciacquare il tessuto più volte in un becher separato facendo roteare utilizzando il becher da un litro per i rifiuti liquidi.

Trasferire un piombo di codi alla volta in una piastra di Petri da 150 millimetri. Tenere con una pinza e utilizzare una lama di rasoio per raschiare il tessuto dai vasi su una capsula di Petri. Posizionare il fazzoletto raschiato in un becher separato contenente soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.

Ripetere per tutti i pezzi di tessuto. Dopo aver risciacquato il tessuto raschiato, drenarlo dal liquido e dal peso in eccesso per digerire il tessuto placentare. Dopo aver preparato la miscela per la digestione dei tessuti, dividere il tessuto trasferendo 60 grammi dal tessuto totale raccolto in un pallone sterile Helen Meyer da 500 millilitri.

Aggiungere la miscela per la digestione dei tessuti al pallone contenente il fazzoletto e incubare a 37 gradi Celsius in uno shaker per 45 minuti. A 150 giri/min per raccogliere le cellule dissociate dopo l'incubazione e inclinare il pallone per consentire al tessuto di depositarsi. Raccogli il super natin.

Facendo attenzione a non raccogliere il tessuto dissociato dall'UND. Aggiungere una quantità uguale di HBSS al surnatante prima di trasferirlo in provette da centrifuga sterili da 15 millilitri. Ripetere la dissociazione e la raccolta del surnatante con le restanti porzioni di tessuto associato all'UND per ogni lotto dopo la centrifugazione per 1000 volte.

Gravity per 15 minuti a quattro gradi Celsius aspira il surnatante senza disturbare il pellet. Le cellule dei villi placentari si trovano prevalentemente nella porzione bianca del pellet che sovrasta i globuli rossi. Trasferire le cellule dei villi nella parte bianca del pellet in una provetta da centrifuga conica sterile da 50 millilitri e conservare in ghiaccio.

Dopo aver raccolto le cellule da tutte e tre le fasi di digestione, utilizzare un filtro cellulare in nylon da 100 micron inserito nella parte superiore di una provetta da centrifuga conica sterile da 50 millilitri per filtrare la sospensione. Se la filtrazione della cella rallenta, sollevare verso l'alto il filtro per aspirare un vuoto all'interno della centrifuga a provette a quattro gradi Celsius e 1000 volte la gravità per 10 minuti. Rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet per omogeneizzare le cellule dei villi placentari utilizzando un mezzo di lisi ipotonica appena preparato o HLM in una cappa di sicurezza biologica, aggiungere alle cellule quattro volte il volume del pellet cellulare di HLM ghiacciato.

Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risussare delicatamente e accuratamente. Sospendi le cellule pipettandole su e giù. Dopo aver incubato le cellule sul ghiaccio per 10 minuti, trasferitele in un omogeneizzatore ghiacciato e omogeneizzate lentamente le cellule con il pestello largo applicando da 20 a 25 colpi delicati.

Centrifugare il lisato a 3000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere le cellule integre. Quindi raccogliere il surnatante in un nuovo tubo prima di girare di nuovo a 25.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Per rimuovere i mitocondri per isolare le goccioline lipidiche mediante ultracentrifugazione, raccogliere la super natina in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Regolare al 20% di saccarosio e trasferire sul fondo di una provetta per ultracentrifuga per un rotore S SW 28 o equivalente sovrapporre il super natin regolato per densità con circa 10 millilitri di ghiaccio freddo, 100 millimolare di tampone carbonato di sodio e da 0,5 a un millilitro di HLM ghiacciato per riempire la provetta utilizzando una centrifuga a rotore a secchio oscillante S SW 28 a 130, 000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 45 minuti. Quindi raccogliere lo strato galleggiante, regolare al 10% di saccarosio e trasferirlo sul fondo di una provetta per ultracentrifuga da 13,2 millilitri per un rotore SW 41 TI o equivalente sovrapporre il surnatante regolato per densità con circa cinque millilitri di ghiaccio freddo, 100 millimolari di tampone carbonato di sodio e 0,5 millilitri di HLM ghiacciato dopo la centrifugazione a 274, 000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 60 minuti. In un rotore SW 41 TI, utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere con cura lo strato galleggiante superiore contenente goccioline lipidiche.

Regolare il volume al 10% di saccarosio e trasferire nuovamente in una provetta per ultracentrifuga da 13,2 millilitri prima di sovrapporlo con cinque millilitri di tampone di carbonato di sodio ghiacciato freddo da 100 millimolari e 0,5 millilitri di HLM ghiacciato. Dopo la centrifugazione per 30 minuti, utilizzare una pipetta in PE piegata per raccogliere con cura lo strato galleggiante superiore di colore bianco contenente le goccioline lipidiche in tre provette da 1,5 millilitri contenenti 100 microlitri di HLM. Caratterizzare le goccioline lipidiche secondo il protocollo di testo Come si vede in questa figura, la presenza di goccioline lipidiche isolate da cellule dei villi placentari a termine umano è stata verificata mediante colorazione con un colorante a fluorescenza neutro lipide specifico boda P 4 93 5 0 3 e visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Qui mostrato, la purezza delle frazioni di goccioline lipidiche isolate è stata valutata mediante western blotting con proteine marcatrici per goccioline lipidiche che includevano para lippina due calnexina per l'er, il marcatore goi, GM uno 30 CO X quattro per i mitocondri e membrana plasmatica, MEK uno. Dopo la decomposizione, le goccioline lipidiche con acetone freddo e le proteine estratte. Le frazioni sono state sottoposte a Western blotting para lipin.

In secondo luogo, la proteina gocciolina lipidica è stata rilevata nel surnatante post-nucleare e nello strato galleggiante bianco isolato contenente goccioline lipidiche. Le proteine specifiche per le membrane plasmatiche come MK one e GM one 30 non sono state rilevate nelle frazioni di goccioline lipidiche in nessuno degli strati sotto lo strato galleggiante per spin quattro e spin cinque. Come precedentemente riportato, la proteina calnexina e una debole colorazione della proteina di membrana mitocondriale CO X four sono state rilevate altrove nella frazione di goccioline lipidiche.

Questi risultati sono coerenti con i rapporti precedenti che mostrano che le goccioline lipidiche interagiscono con i mitocondri nelle cellule di mammifero e con l'ER r. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i metodi proteomici e lipidomici per studiare ulteriori domande come quali fattori sono legati alle goccioline.