Name: Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri un metodo rapido per isolare goccioline lipidiche dal fegato di topo usando un kit modificato per il reticolo endoplasmatico. Questa tecnica consente la purificazione simultanea di più organelli, rendendo accessibili studi avanzati sulla biologia lipidica.

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Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti su un banco di laboratorio con dispositivi di protezione individuale appropriati per livello di biosicurezza 1, compreso un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il disagio degli animali, e gli animali sono stati trattati con un'assistenza umana.
1. isolamento LD utilizzando un kit di isolamento ER
<ol><li>
Preparazione Nota: Gli importi elencati sono adatti per un singolo 1 g di fegato di topo.<ol>
<li>Preparare 10 mL di tampone di estrazione isotonica 1 x (buffer di IE, dal kit di isolamento ER) diluendo 2 mL di buffer di IE 5 x con 8 mL di acqua ultrapura. Raffreddare il buffer mettendo sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare 100 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare 10 mL di 5% polietilene glicole p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil etere (PGPE) diluendo 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Lasciare raffreddare tutte le provette posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.</li>
		<li>Fresco di tutte le necessarie centrifughe a 4 ° c: una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità per 15 mL provette, una centrifuga ad alta velocità per provette da 50 mL e un'ultracentrifuga.</li>
		<li>Sterilizzare in autoclave forbici pinze e dissezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione tessuto
	<ol>
<li>Eutanasia il mouse collocandolo in una camera piena di 100% CO2 per 10 min. Confirm eutanasia eseguendo dislocazione cervicale.</li>
		<li>Utilizzando pinze sterili e dissezione Forbici, tagliare gli strati di pelle e muscoli dell'addome sull'asse posteriore/anteriore per esporre il fegato.</li>
		<li>Tagliare i legamenti che collega il fegato al diaframma e intestino. Utilizzare pinze per tirare l'intestino dal fegato, verso il posteriore, per esporre i legamenti.</li>
		<li>Taglio tra il fegato e la gabbia toracica dorsale, lo spostamento dall'anteriore al posteriore fino a quando il fegato è liberato.</li>
		<li>Trasferire il fegato a un freddo 5cm Petri con 10 mL di PBS 1X freddo.</li>
		<li>Lavare il fegato 2 x su una piattaforma a dondolo in 10 mL di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri. Versa di PBS 1X dopo il lavaggio finale.</li>
		<li>Utilizzare una lama chirurgica sterile di dimensione-10 (Vedi la Tabella materiali) a dadi il fegato in pezzi di 3 – 5 mm nei 5 cm di Petri (Figura 1A).</li>
		<li>Lavare il fegato tagliato a dadini 2 x 10 ml di PBS 1X freddo per 5 min a 4 ° C ai 5 cm di Petri. Nota: Per l'isolamento del lisosoma, trasferire 0,5 g di fegato di un omogeneizzatore 45ml pulito e seguire le indicazioni fornite dall'estrazione lisosoma kit (vedere la Tabella materiali).</li>
		<li>Decantare 1X PBS e trasferire i pezzi di fegato a dadini al freddo 45 mL lisata omogeneizzatore. Garantire che tutti i pezzi vanno fino in fondo l'omogeneizzatore.</li>
		<li>Aggiungere 7 mL di tampone di IE 1x freddo (dal kit di isolamento ER) e omogeneizzare il ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Assicurarsi che il pestello vada fino in fondo l'omogeneizzatore durante ogni corsa.</li>
		<li>Trasferire l'omogeneizzato (Figura 1B) a una centrifuga a freddo 15 mL.</li>
		<li>Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di freddo 1x buffer di IE (dal kit di isolamento ER) e aggiungere questo al resto dell'omogenato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento di LD
	<ol>
<li>Rimuovere i nuclei mediante centrifugazione l'omogeneizzato in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C (Figura 1).</li>
		<li>Trasferire il surnatante postnuclear (PNS) a un nuovo, freddo 50ml centrifuga. Per evitare perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore del tubo da 15 mL sono risospeso prima di trasferire il PNS.</li>
		<li>Prendere un 100 µ l aliquota del PNS per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Per rimuovere i mitocondri, centrifugare il campione PNS, non l'aliquota, in una centrifuga refrigerata ad alta velocità a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.<ol>
<li>Optional: per grezzo LD (CLD) isolati (con contaminazione cytosol e membrana cellulare), raccogliere il mantello lipidico superiore utilizzando una pipetta di vetro e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga 1,7 mL. Continuare a sezione 1.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasferire il surnatante postmitochondrial (PMS) in una provetta ultracentrifuga. Per evitare la perdita di LD, assicurarsi che qualsiasi dei lipidi raccolti nella parte superiore sono risospeso prima di trasferire il PMS.</li>
		<li>Prendere un 100 µ l aliquota delle POM per analisi della purezza e inserirlo in un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Metterlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Riempire una provetta ultracentrifuga fino all'orlo con freddo 1x IE per evitare che il tubo di collassare durante ultracentrifugazione.</li>
		<li>Bilanciare i campioni e li centrifugare in un'ultracentrifuga a 100.000 x g per 60 min a 4 ° C (Figura 1).</li>
		<li>Per rimuovere lo strato di LD, inclinare il tubo ad angolo di 45° e utilizzare una pipetta di vetro per aspirare. Trasferire il pellet a un tubo del microcentrifuge freddo 1,7 mL. Nota: Il pellet contiene ER isolato. Utilizzare questa frazione a valle per l'isolamento di ER.</li>
		<li>Raccogliere 100 µ l del surnatante post-ER (PER) sotto lo strato lipidico per analisi della purezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavaggio di LD
	<ol>
<li>Aggiungere 1X PBS per la frazione di LD raccolta in un tubo del microcentrifuge 1,7, per un volume totale di 1,3 mL.</li>
		<li>Vortexare il campione.</li>
		<li>Centrifugare in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C a pellet eventuali detriti cellulari. Riscaldare il tubo delicatamente con le mani per aiutare Risospendere lo strato di LD. Trasferire il surnatante, compreso lo strato lipidico, ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.4.1–1.4.3 2x x-3, fino a che il pellet non è più visibile.</li>
		<li>Aggiungere 1X PBS per il LD privo di pellet surnatante ad un volume finale di 1,5 mL. Lavare la frazione lipidica mediante centrifugazione in una microcentrifuga alla massima velocità per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere 1 mL di 1X PBS (sotto lo strato lipidico) con una pipetta di vetro senza alterare lo strato lipidico.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.4.5 e 1.4.6 4x x-5, fino a quando il PBS 1X è visivamente trasparente con nessuna torbidità.</li>
		<li>Rimuovere tutti i PBS 1X sotto lo strato lipidico, utilizzando una pipetta di vetro (Figura 1E).</li>
		<li>Il risultato, una frazione pura di LD, utilizzato per l'analisi a valle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione della proteina LD di dosaggio acido bicinconinico Nota: Non utilizzare un dosaggio di acido bicinconinico (BCA) se morfologia LD deve essere valutata.<ol>
<li>Risospendere il LD in 500 μL di PGPE 5%.</li>
		<li>Bollire i campioni per 5 min a 95 ° C, vortice e incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti raffreddare.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.5.2 un addizionale x 2.</li>
		<li>Sottoporre ad ultrasuoni i campioni per 5 min con un 30 s on/off del ciclo, a media intensità.</li>
		<li>Normalizzare i campioni misurando la concentrazione nella proteina in tutti i campioni di analisi di purezza e nella frazione di LD dall'analisi di BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento LD mediante gradiente di densità di saccarosio
<ol><li>
Preparazione
	<ol>
<li>Fare 200 mL di buffer di TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Fai 100 mL di soluzione di saccarosio al 60% (p/v) in buffer di TE da sciogliere 60 g di saccarosio in buffer di TE, portando il volume finale a 100 mL. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 40% (p/v) con l'aggiunta di 4 mL di saccarosio al 60% a 2 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Fare 6 mL di soluzione di saccarosio al 25% (p/v) con l'aggiunta di 2,5 mL di saccarosio al 60% a 3,5 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Fai 4 mL di soluzione di saccarosio al 10% (p/v) aggiungendo 0,7 mL di saccarosio al 60% a 3,3 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Fai 10 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi aggiungendo una compressa di inibitori di proteasi e la fosfatasi a 10 mL di buffer di TE.</li>
		<li>Preparare buffer di omogenato di tessuto con l'aggiunta di 4 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di soluzione madre di 60% saccarosio. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare il tampone di sovrapposizione con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di inibitore di proteasi e fosfatasi a 50 mL di buffer di TE. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare 100 mL di 1X PBS diluendo 10 mL di PBS 1x 10 in 90 mL di acqua ultrapura. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare 10 mL di 5% PGPE di diluzione 500 µ l di PGPE in 9,5 mL di acqua ultrapura. Utilizzare una siringa da 1 mL per misurare fuori PGPE in quanto è viscoso. Raffreddarlo mettendolo sul ghiaccio.</li>
		<li>Raffreddare i seguenti provette da centrifuga posizionandoli sul ghiaccio: microcentrifuga 1,7 mL, provette per centrifuga da 15 mL, provette da 50 mL Centrifuga ad alta velocità e 13ml ultracentrifuga tubi.</li>
		<li>Raffreddare le centrifughe necessarie a 4 ° c: in una microcentrifuga, una centrifuga ad alta capacità (per provette da 15 mL), una centrifuga ad alta velocità (per provette da 50 mL) e un'ultracentrifuga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione tessuto
	<ol>
<li>Utilizzare 1.2.1–1.2.9 passaggi per preparare il tessuto per omogeneizzazione.</li>
		<li>Aggiungere 7 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e omogeneizzare esso su ghiaccio spostando il pestello su e giù per 20 volte. Durante i primi cinque tratti, garantire che il pestello va fino in fondo l'omogeneizzatore.</li>
		<li>Trasferire l'omogeneizzato a una centrifuga a freddo 15 mL.</li>
		<li>Sciacquare l'omogeneizzatore con 1 mL di tampone di omogenato di tessuto freddo e trasferirlo in provetta centrifugo 15ml utilizzato in precedenza.</li>
		<li>Portare il volume dell'omogenato fino a 10 mL con buffer di omogenato di tessuto.</li>
		<li>Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferimento 8 mL di surnatante in una provetta da centrifuga 50 mL.</li>
		<li>Trasferire 100 µ l del surnatante rimanente come campione PNS per analisi della purezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gradiente di saccarosio
	<ol>
<li>Inclinare la provetta da centrifuga 50 mL contenente 8 mL di PNS un'angolazione di 45°. Aggiungere con cautela 6 mL di soluzione di saccarosio al 40%, garantendo che le due fasi soggiorno separate.</li>
		<li>In modo simile, lentamente aggiungere 6 mL di soluzione di saccarosio al 25%; quindi, aggiungere 4 mL di soluzione di saccarosio al 10%; Infine, aggiungere 8 mL di tampone di sovrapposizione.</li>
		<li>Centrifugare il campione in una centrifuga ad alta velocità a 30.000 x g a 4 ° C per 30 min.</li>
		<li>Trasferire lo strato superiore contenente il LDs per un tubo del microcentrifuge 1,7 mL.</li>
		<li>Per il lavaggio di LD, attenersi alla procedura nella sezione 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
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<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
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</ol>

Dr. Carr riceve il sostegno alla ricerca da intercettare Pharmaceuticals.

Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all'interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell'omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l'isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l'us...

LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Sono presenti anche enzimi lipogenic, lipasi e proteine traffico di membrana che sono state collegate a parecchie malattie steatotic epatiche, tra cui la steatosi epatica, epatopatia alcolica e l'epatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs sono pensati per formare dalla membrana esterna dell'ER e contengono recentemente sintetizzato TG provenienti da ER-derivati di acidi grassi liberi11. Tuttavia, rimane sconosciuto se i lipidi in pool bud, rimanere connessi, o sono asportati dal ER6,11, rendendo l'isolamento di LDs esente da ER tecnicamente impegnativi. Gli acidi grassi liberi possono essere liberati da LDs dall'azione delle lipasi superficie per fornire per la produzione di energia o sintesi della membrana. Inoltre, LDs può essere degradata tramite lipophagy come un meccanismo di regolamentazione e di produrre acidi grassi liberi12.
Oltre alla ER e lisosomi, ci sono altri organelli — come i mitocondri, gli endosomi, peroxisomes e membrana plasmatica — che si trovano all'interno di stretta associazione di LDs11. Questa stretta poligamia rende difficile effettuare un'estrazione di LD pura. Tuttavia, densità bassa innata dei lipidi neutri può essere sfruttato tramite centrifugazione5.
Tradizionalmente, LDs sono state isolate utilizzando un saccarosio densità gradiente1,5,13. Tuttavia, questi metodi non sono stati progettati per isolare altri organelli. Inoltre, essi richiedono la preparazione che richiede tempo di reagenti. Questo protocollo si adatta un isolamento di ER disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) per consentire l'isolamento di LD. Usiamo il tampone di estrazione fornito dal kit, aggiunta di un passaggio di isolamento di LD. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato anche per ER e lysosomal isolamento utilizzando gli stessi campioni, permettendo per un'immagine più completa del ciclo di vita di LDs. Per convalidare questo nuovo metodo, analisi di rendimento LD, morfologia, dimensioni e purezza. Confrontiamo i risultati presentati qui a quelli ottenuti con un protocollo ampiamente utilizzato utilizzando un gradiente di saccarosio per l'isolamento di LD.
Abbiamo usato un 10 a 12-week-old, mouse C57BL/6 femminile 20g digiunato per 16 h (rimozione di cibo alle 17 per un periodo di isolamento di 9 LD) con libero accesso all'acqua. La resa tipica per TG è di 0,6 mg/g di fegato, e per la proteina di LD, è 0,25 mg/g di fegato. Questo fornisce abbastanza materiale per ~ 10 immunoblots di SDS PAGE. Il protocollo sotto i dettagli dei reagenti utilizzati e un protocollo adatto per un singolo 1 g di fegato. Il protocollo di isolamento gradiente di saccarosio è adattato da Sato14 e Wu15.

<table><tbody><tr><td>BioExpress Vortex Mixer</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Centrifuga Vortex Mixer</td></tr><tr><td>54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Refrigerato Counter Microcentrifuge Rotore: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6 +</td> <td>Centrifuga refrigerata ad alta velocità Rotore: F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Centrifuga refrigerata ad alta capacità Rotore: 75006445 Secchio: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete Proteasi Inibitore Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Compresse Inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>Sistema di sonicazione</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Use Pestello sciolto</td></tr><tr><td>Kit di isolamento del reticolo endoplasmatico tamponato con fosfato di Dulbecco (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>Per il kit ER Estrazione: Contiene: Tampone di estrazione isotonica 5X 100 mL Tampone di estrazione ipotonica 10 mL Cloruro di calcio, soluzione 2,5 M 5 mL OptiPrep Gradiente di densità Medium 100 mL Ago dal naso smussato 1 ea.</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa esterna per eccitazione fluorescente</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Acido cloridrico</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto modulante invertito Leica</td><td></td><td>DM IRB</td> Kit per arricchimento lisosomico Leica DM IRB <td></td></tr><tr><td>per tessuti e cellule in coltura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>Per microscopio per isolamento lisosomiale</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultracentrifuge Rotore: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Compresse di inibitore della fosfatasi</td></tr><tr><td>Lama chirurgica sterile #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td> Kit Liquicolor <td>cristallino/certificato ACS</td></tr><tr><td>Stanbio</td><td>&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Kit di trigliceridi colorimetrici</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Per tampone TE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Polietilenglicole p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil etere, Reagente per lisi proteica</td></tr><tr><td>EDTA ultrapuro (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Per tampone TE</td></tr></tbody></table>

protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un kit di isolamento organello ben consolidate

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all'interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l'isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l'isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l'isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.
Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.

Abbiamo effettuato l'isolamento di LD con il kit ER su circa 30 topi e confrontato i risultati con quelli che seguono il protocollo di isolamento del saccarosio su circa 40 topi. I risultati segnalati sono tipici per entrambi i protocolli. Topi sono stati tenuti a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua, per aumentare il rendimento di LD. Isolamento di LD utilizzando un gradiente di saccarosio è stato eseguito in parallelo con il kit di ER protocollo di isolamento del LD. Ca...

Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.

Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

La ricerca sulla biologia delle goccioline lipidiche è stata ostacolata dalla difficoltà di purificazione. Inoltre, lo studio del flusso lipidico cellulare richiede la purificazione simultanea di più organelli e al momento non erano disponibili protocolli semplici. Il principale vantaggio di questa tecnica è rendere più accessibile la purificazione delle goccioline lipidiche.Abbiamo modificato un kit disponibile in commercio per isolare simultaneamente goccioline lipidiche, reticolo endoplasmatico e lisosomi da un singolo campione. L'accumulo di goccioline lipidiche epatiche predispone i pazienti obesi e alcolici alla malattia epatica progressiva. Ciò ha spostato la visione delle goccioline lipidiche dai compartimenti di stoccaggio inerti agli organelli dinamici biologicamente importanti.Per iniziare, utilizzare forcep sterili e forbici di dissezione per tagliare la pelle e gli strati muscolari dell'addome del topo eutanasiato sull'asse posteriore anteriore, esponendo il fegato. Tagliare i legamenti che collegano il fegato all'intestino. Usando le forcep, allontanare l'intestino dal fegato, verso il posteriore.Tagliare il legamento che collega il fegato al diaframma. Quindi, tagliare tra il fegato e la gabbia toracica dorsale, passando da anteriore a posteriore, fino a quando il fegato non viene liberato. Trasferire il fegato in una piastra di Petri fredda di cinque centimetri con 10 millilitri di PBS freddo 1x e lavare il fegato due volte su una piattaforma a dondolo in 10 millilitri di PBS freddo 1x per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo il lavaggio finale, versare il PBS 1x e utilizzare una lama chirurgica sterile di dimensioni 10 per tagliare a dadini il fegato in pezzi da tre a cinque millimetri all'interno del piatto. Quindi, lavare il fegato a dadini due volte con 10 millilitri di PBS freddo 1x per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il PBS 1x e trasferire i pezzi di fegato a dadini in un omogeneizzatore Dounce freddo da 45 millilitri, assicurando che tutti i pezzi siano sul fondo.Aggiungere sette millilitri di tampone freddo 1x IE. Omogeneizzare sul ghiaccio spostando il pestello su e giù 20 volte, assicurandosi che il pestello vada sul fondo dell'omogeneizzatore durante ogni corsa. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga freddo da 15 millilitri.Risciacquare l'omogeneizzatore con un millilitro di tampone freddo 1x IE e aggiungerlo al resto dell'omogeneato. Per rimuovere i nuclei, centrifugare l'omogeneato in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Assicurarsi che tutti i lipidi raccolti nella parte superiore del tubo da 15 millilitri vengano rimorsi per evitare la perdita di LD.Assicurarsi che il pellet nucleare nella parte inferiore del tubo sia indisturbato, trasferire il supernatante post-nucleare contenente lipidi in un tubo di centrifuga fresco freddo da 50 millilitri. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri del supernatante post-nucleare in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri sul ghiaccio per una successiva analisi della purezza. Per rimuovere i mitocondri, centrifugare il campione di supernatante post-nucleare in una centrifuga refrigerata ad alta velocità a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Assicurarsi che tutti i lipidi raccolti nella parte superiore del tubo vengano rimescolati per evitare la perdita di LD, quindi trasferire il supernatante post-mitocondriale in un tubo ultracentrifugo da 13 millilitri. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri del supernatante post-mitocondriale in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri sul ghiaccio per una successiva analisi della purezza. Riempire il tubo ultracentrifugo con supernatante post-mitocondriale fino all'orlo con tampone freddo 1x IE, per evitare che collassi durante l'ultracentrifugazione.Bilanciare i campioni, quindi centrifugare in un ultracentrifugo a 100.000 volte g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere lo strato LD, inclinare il tubo con un angolo di 45 gradi e aspirare con una pipetta di vetro. Dopo aver trasferito il pellet in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri, raccogliere 100 microlitri del supernatante post-ER sotto lo strato lipidico per l'analisi della purezza.Per pellettizzare eventuali detriti cellulari, centrifugare in un microcentrifugo alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, riscaldare delicatamente il tubo con le mani per aiutare a rimescolare lo strato LD e trasferire il supernatante, incluso lo strato lipidico, in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. Ripetere questi passaggi di lavaggio, riscaldando il tubo da due a tre volte, fino a quando il pellet non è più visibile.Quindi, per lavare il supernatante LD privo di pellet, aggiungere 1x PBS a un volume finale di 1,5 millilitri e centrifugare in un microcentrifugo alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere un millilitro di 1x PBS, che si trova sotto lo strato lipidico, senza disturbare lo strato lipidico. Ripetere il lavaggio LD da quattro a cinque volte, fino a quando il PBS 1x non è visivamente trasparente senza torbidità.Quindi, utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere tutti i 1x PBS sotto lo strato lipidico e utilizzare la frazione LD pura risultante per l'analisi a valle. Quando le immagini rappresentative 20x fluorescenti e brightfield LD sono state prese sia dall'isolamento LD del kit ER che dai metodi di isolamento LD del saccarosio, hanno rivelato livelli simili di particolato, suggerendo purità simili utilizzando due protocolli diversi. In seguito alla purificazione, i livelli di trigliceridi e proteine LD sono stati misurati utilizzando saggi colorimetrici e i dati sono stati normalizzati in base al peso epatico, dimostrando che quando il materiale di partenza è stato normalizzato, i trigliceridi LD e le rese proteiche erano simili usando il kit ER e il metodo del saccarosio.I diametri LD sono stati quantificati utilizzando un software di analisi delle immagini, dimostrando che l'isolamento LD del kit ER e l'isolamento LD del saccarosio producevano LD di dimensioni simili. Per valutare la purezza dell'LD, i campioni sono stati analizzati mediante immunoblotting, dimostrando che i LD derivati dall'isolamento ER kit LD e dal protocollo gradiente di saccarosio avevano entrambi la stessa purezza. PLIN2, un marcatore LD, è stato rilevato in tutti i campioni ad eccezione del kit ER LD isolation PER e del PNS del saccarosio.L'analisi di purezza di una frazione ER che utilizza immunobloti mostra che erano esente da marcatore LD PLIN2 ma avevano livelli significativi della proteina ER SEC61A. È stata inoltre valutata la purezza di una frazione lisosomiale dopo un'ulteriore purificazione dei lisosomi utilizzando il kit di arricchimento lisosoma. Discovery è attualmente l'applicazione più utile del nostro protocollo.Eseguiamo lipidomici in organelli purificati e abbiamo mostrato che le lipotossine sono aumentate specificamente nelle goccioline lipidiche nella malattia epatica alcolica.

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Questo video mostra una tecnica per visualizzare la formazione della sinapsi immunologica nelle cellule natural killer (NK) su un doppio strato lipidico supportato (SLB). L'SLB viene prima marcato con un ligando del recettore attivante delle cellule NK marcato con fluoroforo, seguito dall'incubazione con cellule NK. Successivamente, le cellule vengono colorate per l'actina polimerizzata e i granuli litici perforin-positivi. Questo approccio consente la visualizzazione della formazione delle...

Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

Due tecniche per isolare gocce lipidiche cellulari da 1) cellule di lievito e 2) placente umane sono presentati. Il fulcro di entrambe le procedure è la densità centrifugazione in gradiente, dove lo strato risultante galleggiante contenente le goccioline può essere facilmente visualizzato occhio, estratto, e quantificato mediante analisi Western Blot per la purezza.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Questo protocollo descrive l'isolamento e la quantificazione di piccoli RNA di lipoproteine ad alta densità.

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Viene presentato un protocollo rapido ed efficiente per l'isolamento delle goccioline lipidiche di plastoglobulo associate a vari organismi fotosintetici. Il successo della preparazione di plastoglobuli isolati è un primo passo cruciale che precede indagini molecolari dettagliate come analisi proteomiche e lipidomiche.

Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri

Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

La lipofagia è una forma selettiva di autofagia che comporta la degradazione delle goccioline lipidiche. Le disfunzioni in questo processo sono associate allo sviluppo del cancro. Tuttavia, i meccanismi precisi non sono ancora del tutto compresi. Questo protocollo descrive approcci di imaging quantitativo per comprendere meglio l'interazione tra autofagia, metabolismo lipidico e progressione del cancro.

Esplorare la regolazione del catabolismo delle goccioline lipidiche attraverso la lipofagia

Scopri un metodo rapido per isolare goccioline lipidiche dal fegato di topo usando un kit modificato per il reticolo endoplasmatico. Questa tecnica consente la purificazione simultanea di più organelli, rendendo accessibili studi avanzati sulla biologia lipidica.

Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate

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