Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di facilitare l'identificazione di eventi di enucleazione con una sottopopolazione di Erythroblast. Il primo passo è quello di creare una popolazione arricchita in eventi nucleanti. Ciò si ottiene mediante coltura di eritropoiesi in vitro, a lungo termine a partire da cellule di midollo osseo a bassa densità isolate da femori, tibia e ossa pelviche di un topo non stressato o coltura a breve termine.

A partire dai ple cytes della milza di un topo sottoposto precedentemente a flebotomia al fine di montare l'eritropoiesi da stress. Le cellule coltivate nella fase finale della coltura vengono fissate, permeate e colorate con i marcatori fluorescenti di interesse. Queste cellule vengono analizzate su un citometro a flusso di imaging e quindi analizzate per identificare le cellule sottoposte a enucleazione nella popolazione di cellule nucleanti che possono essere identificate le componenti di segnalazione e citoscheletriche che regolano e mediano il processo di enucleazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza, è che il numero significativamente maggiore di cellule nucleanti può essere osservato e analizzato in un breve lasso di tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'eritropoiesi, come ad esempio quali meccanismi molecolari sono coinvolti nella nucleazione dell'eritroblasto. Per differenziare le cellule eritroidi dalle cellule del midollo osseo a bassa densità, iniziare aggiungendo un millilitro di terreno di coltura a una provetta sterile per citometria a flusso.

Quindi collegare un ago da 25 gauge per cinque ottavi di pollice a una siringa di tubercolina e sciacquare delicatamente il terreno di coltura fresco attraverso i femori e la tibia prelevati alcune volte nella provetta per citometria a flusso. Dopo aver regolato il volume della sospensione cellulare a cinque millilitri con IMDM, sovrapporre con cura cinque millilitri di terreno di separazione cellulare a gradiente di densità di 1,083 grammi per millilitro in una provetta da 15 millilitri. Trasferire il tutto fino al segno di due millilitri in una nuova provetta da 15 millilitri e lavare il buffy coat raccolto con terreno di coltura fresco, pidocchi, i globuli rossi in tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente, dopo aver lavato le cellule in terreni di coltura e aver sospeso il pellet nella stessa piastra, le cellule in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti a una concentrazione di cinque volte il decimo delle quinte cellule per pozzetto fino a un volume finale di 2,5 millilitri in terreno di crescita e incubare le cellule a 37 gradi Celsius cinque giorni dopo la placcatura della coltura.

Contare il numero di eritroblasti in ciascun pozzetto della piastra di coltura originale e quindi trasferire ciascun pozzetto in provette coniche individuali da 15 millilitri corrispondenti. Dopo aver centrifugato le cellule, aspirare i surnatanti e risospendere i pellet in un terreno di crescita fresco contenente solo eritropoietina a una concentrazione di due volte 10 delle quinte cellule per millilitro. Quindi aspirare il surnatante da una piastra di MS cinque cellule e aggiungere le cellule eritroidi ai pozzetti.

Due giorni dopo, sostituire il surnatante con terreni di crescita freschi senza citochine per eliminare gli eritroblasti da citi PLE a bassa densità. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per macerare la milza attraverso un colino da 40 micron in un tubo da 50 millilitri. Lavare il filtro cellulare con il terreno di coltura e regolare il volume finale della sospensione cellulare a cinque millilitri.

Quindi, dopo aver separato gli strati cellulari mediante gradiente di densità, come appena dimostrato, pidocchiare i globuli rossi e lavare i citi in sette millilitri di terreno di coltura. Quindi Resus sospende il pellet in terreni di crescita integrati con citochine e incuba le cellule da una a cinque volte 10 alle sei cellule in un volume finale di un millilitro per pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente.

Trasferire le cellule in pozzetti contenenti cinque cellule MS aderenti come descritto in precedenza e analizzare dopo sei-otto ore, raccogliere gli eritroblasti dai pozzetti di coltura e fissarli in 500 microlitri di formaldeide al 3,7% in PBS Resus, sospendendo il pellet con un pipettaggio delicato. Dopo 15 minuti, centrifugare le celle a 2000 GS per 20 secondi in una microcentrifuga, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule nella microcentrifuga, aspirare nuovamente il surnatante e porre le cellule sul ghiaccio per almeno 15 minuti.

Metti le soluzioni di acetone conservate a meno 20 gradi Celsius sul ghiaccio. Quindi risospendere rapidamente e centrifugare le cellule in una serie di lavaggi con acetone come indicato dopo il lavaggio con tampone fax, incubare i pellet cellulari in 100 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, dopo aver lavato nuovamente le cellule nel tampone fax, sospendere nuovamente i pellet sostenuti in 60 microlitri di tampone fax contenente drac cinque ed eseguire i campioni su un citometro a flusso di imaging che raccoglie almeno 10.000 eventi per campione sperimentale.

Quindi inizia l'analisi selezionando le celle in base al loro rapporto di aspetto in campo chiaro, al rapporto tra la lunghezza del loro asse minore rispetto a quello maggiore e la loro area in campo chiaro, che è indicativo delle loro dimensioni. Gli eventi con un valore dell'area di campo chiaro inferiore a 20 e superiore a 200 sono per lo più rispettivamente detriti e aggregati cellulari e sono esclusi dall'analisi. Analizzando quindi le singole celle in base al loro valore per il parametro RMS del gradiente, che indica la nitidezza dell'immagine, si crea un secondo gate contenente le celle con il valore RMS del gradiente maggiore del 50° percentile in modo da selezionare le immagini scattate bene a fuoco.

Al cancello successivo, le cellule, in base alle loro dimensioni, misurate dalla loro area di campo chiaro e alla loro positività per il marcatore eritroide TER one 19 misurato dal TER one 19 colorazione fluorescente media pixel le celle del parametro molto basse o molto alte per TER one 19 sono rispettivamente aggregati di cellule non eritroidi o rimanenti e sono escluse dall'analisi nella fase successiva. Le cellule vengono selezionate in base all'intensità del rapporto d'aspetto DR five, al rapporto tra l'asse minore rispetto all'asse maggiore del loro nucleo e l'intensità della loro espressione d dr five. Le cinque cellule negative DR hanno per lo più cellule enucleate come reticolociti e globuli rossi e cellule con un basso rapporto di aspetto di resistenza cinque.

Per lo più i doppietti sono esclusi dall'andatura di analisi. Trascinano cinque cellule positive al DNA positivo, che a questo punto sono per lo più eritroblasti. Questi eritroblasti vengono quindi analizzati in base alla loro area TER one 19, che indica la dimensione della cellula e la loro area media di pixel TER one 19 o la densità dell'espressione TER one 19, che indica la luminosità della loro colorazione TER one 19.

Gli eritroblasti ortocromatici sono riconosciuti come piccole cellule TER alte 19 cellule. Infine, una sottopopolazione di eritroblasti ortocromatici è caratterizzata dal loro basso rapporto d'aspetto in campo chiaro e dal loro alto delta sentu XY TUR one 19. DR 5 come definito dalla distanza tra il centro del reticolocita positivo TUR 19 incipiente e il centro del nucleo positivo DR 5 insieme all'anticorpo contro di lei uno 19 e alla colorazione del DNA DRAAK cinque.

Le cellule sono tipicamente anche colorate per identificare la localizzazione della f actina durante l'eritroblasto e la nucleazione. Da notare che la progressione dell'enucleazione può essere visualizzata come cellule con un rapporto d'aspetto decrescente. Cioè, si osservano cellule che diventano sempre più allungate e con un aumento di delta OID xy TUR uno 19 si osservano cinque trascinamenti.

La F actina si concentra nel solco di scissione durante la nucleazione e poi si dissipa una volta che il nucleo viene estruso. Altre proteine e strutture di interesse possono anche essere colorate con gli anticorpi appropriati o marcatori fluorescenti per consentire l'imaging del loro ruolo durante l'enucleazione. Ad esempio, la formazione di microtubuli polarizzati può essere visualizzata in eritroblasti ortocromatici wild type prima di una nucleazione, ma non in eritroblasti trattati con colchicina.

L'inibizione della polimerizzazione della tubulina da parte della colchicina diminuisce la polarizzazione cellulare, come dimostrato misurando il parametro delta OID XYB FDR five tra il centro del corpo cellulare visto nel canale di campo chiaro e il centro della colorazione nucleare ottenuta con DR five. Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre metodiche come la microscopia a fluorescenza per rispondere a domande riguardanti le interazioni tra diversi tipi di cellule coinvolte nell'eritropoiesi come quelle osservate nelle isole Erythroblast. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare gli eventi di enucleazione in una popolazione arricchita di eritroblasti.