Name: Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dellunità burst-forming e dellunità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri l'isolamento di progenitori eritroidi BFU-e e CFU-e da midollo osseo e milza murini mediante citometria a flusso. Questa tecnica ad alta purezza consente studi avanzati sulle malattie eritroidi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i protocolli animali A-1586 e 202200017 approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Chan Medical School dell'Università del Massachusetts.
NOTA: Due protocolli sono dettagliati qui: primo, analisi citometrica a flusso (sezione 1), seguita da aggiustamenti di protocollo per l'ordinamento citometrico a flusso (sezione 2). Il protocollo seguente utilizza un citometro a flusso / selezionatore con 10 canali. Un esempio di configurazione è fornito nella tabella 1, di cui al punto 1.14.5. È anche possibile eseguire questo protocollo con solo nove canali; vedi la legenda nella tabella 2.
1. Analisi citometrica a flusso
<ol><li>Eutanasia topi adulti (>6 settimane) Balb/C o C57BL6 utilizzando un metodo appropriato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (ad esempio, inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale). Per l'analisi citometrica a flusso, sarà sufficiente il midollo osseo (BM) di un singolo topo. Per l'ordinamento, il numero di mouse dipende dalle applicazioni a valle. La resa cellulare per ciascuna popolazione è riportata di seguito (fase 2.3.3).</li>
	<li>Raccolta dei tessuti:<ol><li>Preparare 5 mL di provette di selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) contenenti 3 mL di tampone colorante freddo (4 °C) ("SB5": soluzione salina tamponata fosfato (PBS), albumina sierica bovina allo 0,2% (BSA), glucosio 0,08%, 5 mM EDTA) su ghiaccio. Usalo per posizionare i tessuti raccolti.</li>
		<li>Preparare tubi separati per ogni tessuto sezionato da ciascun topo. Non raggruppare tessuti da più topi.</li>
		<li>Raccogli entrambi i femori ed entrambe le tibie. Rimuovere tutti i muscoli dalle ossa prima di metterli nel tubo con SB5.</li>
		<li>Sezionare la milza attraverso un'incisione sul lato sinistro dell'addome.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione delle cellule del midollo osseo:<ol><li>Posizionare i femori e le tibie appena sezionati direttamente nel tampone colorante freddo (SB5) e mantenere i tubi sul ghiaccio fino al momento di estrarre il midollo osseo (BM). Metti un mortaio sterilizzato pulito sul ghiaccio in un secchio. Trasferire le ossa alla malta insieme all'SB5 dal tubo.</li>
		<li>Tagliare circa 1 mm delle estremità di ciascun osso con le forbici per dissezione in modo che l'orifizio dell'osso diventi appena visibile.</li>
		<li>Utilizzare un ago da 26 G e una siringa da 3 ml riempita con SB5 per eliminare il midollo dalle ossa e raccoglierlo nel mortaio. Ripetere il processo 3-5 volte usando un tampone fresco ogni volta fino a quando le ossa appaiono incolori.</li>
		<li>Filtrare il midollo lavato attraverso un filtro a maglie da 100 μm e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml posta sul ghiaccio.</li>
		<li>Utilizzare il mortaio e il pestello per schiacciare le ossa arrossate in 5-10 ml di SB5. Filtrare la miscela di ossa frantumate e tampone attraverso il filtro cellulare da 100 μm e il pool con le cellule raccolte nella fase 1.3.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione delle cellule della milza:<ol><li>Installare un filtro a maglie da 100 μm su una provetta da centrifuga vuota da 50 ml posta sul ghiaccio. Posizionare una singola milza sul filtro a rete.</li>
		<li>Aggiungere 0,5-1 mL di SB5 alla milza per assicurarsi che non si asciughi.</li>
		<li>Utilizzando il lato in gomma di uno stantuffo per siringa da 3 ml o 5 ml, schiacciare la milza attraverso la rete. Aggiungere più SB5, 5 ml alla volta, e continuare a schiacciare fino a quando tutte le cellule sono state raccolte nel tubo.</li>
	</ol></li>
	<li>Da questo punto in poi, il midollo osseo e le cellule spleniche vengono trattati allo stesso modo.</li>
	<li>Far girare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti. Aspirare il surnatante utilizzando una configurazione di aspirazione del vuoto.</li>
	<li>Per effettuare una sospensione a cella singola, risospendere le celle in 2 ml di SB5 e pipettare su e giù 50 volte usando un P1000 con una punta dell'orifizio grande (vedere Tabella dei materiali). Questi hanno ampie aperture della punta per aiutare a prevenire danni alle cellule fragili.</li>
	<li>Per contare le celle, risospendere mediante pipettaggio su e giù 20 volte. Diluire le cellule in un rapporto di 1:100 in SB5. Mescolare 10 μL delle cellule diluite con 10 μL di blu di tripano e contare su un emocitometro e/o un contatore cellulare.</li>
	<li>Far girare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 33 x 106 cellule vive/ml in SB5.</li>
	<li>Preparare il cocktail Lin-FITC mescolando volumi uguali di ciascun anticorpo nella Tabella 3.</li>
	<li>Preparare le celle per i controlli a colore singolo e i controlli "Fluorescenza meno uno" (FMO). Eseguire le fasi 1.11-1.12 in parallelo con la preparazione e la colorazione delle cellule campione nella fase 1.14 (campioni per analisi citometrica a flusso) e/o nella fase 2.1 (selezione citometrica a flusso).<ol><li>Preparare le cellule per un controllo cellulare non colorato trasferendo 50 μL (1,6 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS su ghiaccio. Preparare le celle per ogni singolo controllo del colore (11 tubi) trasferendo 50 μL (1,6 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS su ghiaccio.</li>
		<li>Preparare i controlli FMO per i seguenti colori (Kit, CD41, CD150, CD49f [quattro provette]) trasferendo 300 μL (10 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS separato su ghiaccio.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione anticorpale di FMO e controlli a colore singolo<ol><li>Colorare gli FMO a 33 x 106 celle/ml (in un volume totale di 300 μL) in tubi FACS. Per ogni controllo, aggiungere tutti gli anticorpi tranne l'anticorpo omonimo della FMO. Ad esempio, per il Kit FMO, omettere l'anticorpo Kit. Per ciascun anticorpo, utilizzare la diluizione e la concentrazione finale come indicato nella Tabella 2.</li>
		<li>Colorare i controlli monocolore a 20 x 106 celle/ml (in un volume totale di 50 μL) in tubi FACS; per ciascun controllo, aggiungere un singolo anticorpo alla concentrazione elencata nella Tabella 2.</li>
		<li>Vortice ogni tubo di controllo per 2-3 s a 3.000 giri / min (rotazioni al minuto), quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce. Scuotere i tubi con un asse di rotazione parallelo alla lunghezza del tubo, tra circa un angolo di 10° e 60° dall'orizzontale, in modo che il contenuto non tocchi il tappo.</li>
		<li>Lavare le celle con SB5: Portare il volume della sospensione cellulare a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sospensione cellulare:<ol><li>Risospendere i controlli non colorati e tutti i controlli a colore singolo (tranne il controllo DAPI) in 300 μL di SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS.</li>
		<li>Produrre una soluzione DAPI/SB5 diluendo lo stock DAPI (1 mg/ml in etanolo al 100%) a 1:10.000 in SB5.</li>
		<li>Risospendere gli FMO in 1,8 mL di DAPI/SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS</li>
		<li>Risospendere il controllo monocolore DAPI in 300 μL di DAPI/SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS da 4 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del campione: se le cellule vengono preparate per l'analisi citometrica a flusso, andare al punto 1.14. Se si preparano le celle per l'ordinamento, andare al passaggio 2.1.</li>
	<li>Colorare i campioni di analisi citometrica a flusso a 33 x 10 6 celle/ml in un volume totale di 300 μL (10 x 106 celle) in provette FACS:<ol><li>Preparare la miscela principale di anticorpi. Determinare il volume della miscela principale in base al numero di campioni, con 300 μL per campione. Preparare la miscela madre diluendo tutti gli anticorpi elencati nella Tabella 2 alla diluizione indicata in SB5. Il Rabbit IgG nel master mix funge da blocco Fc.</li>
		<li>Vortice ogni tubo per 2-3 s a 3.000 giri / min, quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Lavare le celle con SB5: Portare il volume della sospensione cellulare a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere i campioni per l'analisi citometrica a flusso in 1,8 mL di DAPI/SB5 come preparato nella fase 1.12.5.2 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in una provetta FACS.</li>
		<li>Analizzare i campioni su un citometro con 10 canali per ospitare i coniugati anticorpali nella Tabella 2 e il colorante di vitalità DAPI. Un esempio di configurazione del canale è fornito nella Tabella 1. È anche possibile utilizzare solo nove canali; vedere la legenda della Tabella 2 .</li>
		<li>Durante l'analisi dei dati di citometria a flusso, utilizzare approcci standard di compensazione spettrale con l'aiuto dei controlli a colore singolo e dei controlli FMO come descritto nel passaggio 2.4.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Adeguamenti del protocollo per la selezione citometrica a flusso
<ol><li>Preparazione di Lin-<ol><li>Raggruppa tutte le cellule estratte dallo stesso tessuto (BM o milza) da 10 topi in un tubo da 50 ml. Risospendere ogni campione aggregato mediante pipettaggio utilizzando un P1000 con una punta dell'orifizio grande.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante.</li>
		<li>Preparare controlli monocolore e FMO come descritto nella sezione 1 utilizzando celle non arricchite.</li>
		<li>Arricchire le celle di Lin- per la selezione utilizzando l'arricchimento magnetico delle celle Lin :</li>
		<li>Risospendere le cellule a 1 x 108 cellule/ml con SB5 e trasferirle in un tubo da 15 ml. Aggiungere siero di ratto normale e gli anticorpi biotinilati elencati nella Tabella 4 e incubare con oscillazione a 4 °C per 1 ora.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 15 ml di SB5 freddo.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule a 1 x 108 cellule/ml in SB5 freddo e tenerle sul ghiaccio.</li>
		<li>Vortice le nanosfere magnetiche a 3.000 giri / min per 5-10 s. Prendi 1 mL di nanosfere magnetiche per ogni 10 mL di cellule.</li>
		<li>Lavare le nanosfere in un tubo FACS da 5 ml. Portare il volume a 4 mL con SB5, centrifugare a 900 x g, 4 °C per 5 minuti e aspirare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le nanosfere in 500 μL di SB5 e mescolarle con le cellule preparate al punto 2.1.7. Incubare a 4 °C con oscillazione per 15 min.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le celle a 1 x 108 celle/ml con SB5.</li>
		<li>Posizionare il tubo su un magnete a 4 °C per 5 minuti.</li>
		<li>Versare con cautela il surnatante in un nuovo tubo da 15 ml.</li>
		<li>Posizionare il tubo contenente il surnatante del punto 2.1.13 su un magnete a 4 °C per 5 minuti. Versare con cautela il surnatante in un nuovo tubo da 15 ml.</li>
		<li>Ruotare le cellule del surnatante al punto 2.1.14 a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule arricchite di Lin in 1 mL di SB5.</li>
		<li>Diluire 10 μL delle cellule a 1:100 in SB5. Mescolare 10 μL delle cellule diluite con 10 μL di blu di tripano e contare su un emocitometro e/o un contatore cellulare.</li>
		<li>Sulla base del conteggio delle cellule nel passaggio 2.1.17, risospendere le cellule arricchite con Lin a 33 x 106 cellule/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione di cellule arricchite:<ol><li>Colorare i campioni di cellule arricchite a 33 x 106 cellule/ml in provette FACS aggiungendo tutti gli anticorpi elencati nella Tabella 2. Vortice ogni tubo per 2-3 s a 3.000 giri / min, quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Lavare le celle con SB5: Portare il volume dei tubi FACS a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4°C per 10 minuti, e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospendere i campioni per l'analisi citometrica a flusso in 4-6 ml di DAPI/SB5 come preparato al punto 1.12.5.2 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in una nuova provetta FACS da 4 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Ordinamento dei campioni:<ol><li>Ordinare i campioni con un ugello grande e bassa pressione per massimizzare la resa CFU-e poiché le celle CFU-e sono facilmente danneggiabili ad alta pressione. Per il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare 14 psi e un ugello da 100 μm o 12 psi con un ugello da 130 μm. Impostare le porte di smistamento come descritto al punto 2.4 di seguito.</li>
		<li>Preparare il tampone di raccolta: aggiungere il 20% di siero fetale bovino alla PBS.</li>
		<li>Per verificare la purezza delle popolazioni ordinate, eseguire nuovamente una piccola aliquota da ciascuna popolazione ordinata in un buffer contenente DAPI, come descritto nel passaggio 1.12.5.2. NOTA: Tipicamente, BM da un totale di 10 topi (circa 1 x 109 cellule) produce almeno 50.000-100.000 cellule per ciascuna delle popolazioni P1-hi, P1-low e P2 con una vitalità di circa il 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare la strategia di gating illustrata nella Figura 3 per l'analisi o l'impostazione delle porte di smistamento.<ol><li>Utilizzare il parametro forward-scatter (FSC) per rimuovere i detriti in base alle dimensioni. Utilizzare l'istogramma FSC-height rispetto all'istogramma dell'area FSC per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle; ripetere l'operazione con l'altezza della dispersione laterale (SSC) rispetto all'istogramma dell'area SSC.</li>
		<li>Escludere le cellule morte eliminando le cellule che sono positive per il DAPI colorante del DNA, a cui le cellule vitali sono impermeabili.</li>
		<li>Selezionare le celle Lin-Ter119-Kit+ e, da queste, selezionare una sottopopolazione che esprima CD55.</li>
		<li>Suddividere le cellule Lin-Ter119-Kit+CD55+ in due popolazioni principali, P6 e P7, basate sull'espressione di CD49f e CD105.</li>
		<li>Sulla base dell'espressione di CD150 e CD41, suddividere ulteriormente P6 in P3 (progenitori basofili o mastociti), P4 (progenitori megacariocitici) e P5 (EBMP e MPP eritroide-biased).</li>
		<li>Sulla base dell'espressione di CD150 e CD71, suddividere ulteriormente P7 in P2 (BFU-e), CFU-e precoce (P1-bassa) e CFU-e tardiva (P1-hi).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development%3A+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li>
<li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).</li>
<li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hemopoiesis+in+Culture%22%5BJournal%5D)">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).</li>
<li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li>
<li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li>
<li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture%3A+State+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li>
<li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture%3A+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li>
<li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system%3A+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li>
<li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).</li>
<li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71%2FTER119+flow-cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li>
<li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li>
<li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2020).</li>
<li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334(2021).</li>
<li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383(2012).</li>
<li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li>
<li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li>
<li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192(2011).</li>
<li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+phenotypic%2C+functional%2C+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li>
<li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors%3A+BFU-E+and+CFU-E%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li>
<li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells%3A+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li>
<li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li>
<li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li>
<li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li>
<li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li>
<li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La capacità di isolare prospetticamente i progenitori BFU-e e CFU-e direttamente da tessuti freschi con elevata purezza era precedentemente sfuggita ai ricercatori. Il nostro nuovo approccio, convalidato utilizzando scRNAseq e saggi sul destino cellulare 1,27, offre ora gli strumenti per farlo.
Ci sono una serie di punti chiave per eseguire con successo sia i protocolli di ordinamento che quelli analitici. In primo luogo, le cellule de...

L'eritropoiesi può essere suddivisa in due fasi principali: eritropoiesi precoce e differenziazione eritroide terminale (Figura 1)1,2,3. Nell'eritropoiesi precoce, le cellule staminali ematopoietiche si impegnano nella linea eritroide e danno origine ai primi progenitori eritroidi, che sono stati identificati per la prima volta nel 1970 sulla base del loro potenziale di formazione di colonie in mezzo semi-solido 4,5,6,7,8,9 . In generale, i progenitori eritroidi sono divisi in due categorie: progenitori precedenti che danno origine ciascuno a un "burst" (un grande aggregato di cluster di cellule eritroidi più piccoli), chiamato "burst-forming unit erythroid" o BFU-e 4,5,6; e la loro progenie, che formano ciascuna un singolo, piccolo gruppo o colonia di cellule eritroidi, chiamato "unità eritroide formante colonie" o CFU-e 7,8,9. BFU-e e CFU-e non esprimono ancora geni eritroidi terminali e non sono morfologicamente riconoscibili. Dopo una serie di divisioni cellulari di auto-rinnovamento o espansione, la CFU-e subisce un passaggio trascrizionale in cui vengono indotti geni eritroidi come le globine, passando così alla differenziazione eritroide terminale (ETD)1,10. Durante l'ETD, gli eritroblasti subiscono da tre a cinque divisioni cellulari di maturazione prima dell'enucleazione per formare reticolociti, che maturano in globuli rossi.
Gli eritroblasti durante la differenziazione terminale sono stati originariamente classificati in base alla loro morfologia in proeritroblasti, basofili, policromatici e ortocromatici. L'avvento della citometria a flusso ha permesso il loro ordinamento prospettico e isolamento in base alle dimensioni delle cellule (misurate mediante forward scatter, FSC) e a due marcatori di superficie cellulare, CD71 e Ter11911,12,13 (Figura 1). Questo e simili approcci citometrici a flusso 14 hanno rivoluzionato lo studio degli aspetti molecolari e cellulari dell'ETD, consentendo l'analisi specifica dello stadio di sviluppo degli eritroblasti in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L'approccio CD71/Ter119 è ora utilizzato di routine nell'analisi dei precursori eritroidi.
Fino a poco tempo fa, un approccio citometrico a flusso simile e accessibile per l'isolamento prospettico diretto e ad alta purezza di CFU-e e BFU-e dal tessuto di topo è sfuggito ai ricercatori. Invece, i ricercatori hanno utilizzato strategie citometriche a flusso che isolano solo una frazione di questi progenitori, spesso in presenza di cellule non eritroidi che co-purificano all'interno degli stessi sottoinsiemi citometrici a flusso21. Di conseguenza, lo studio di BFU-e e CFU-e è stato limitato a sistemi di differenziazione in vitro che derivano e amplificano BFU-e e CFU-e da precedenti progenitori del midollo osseo. E' quindi possibile applicare strategie citometriche a flusso che distinguono CFU-e da BFU-e in queste colture eritroidi arricchite con progenitori22,23. Un approccio alternativo fa uso di CFU-e fetale e BFU-e, che sono altamente arricchiti nella frazione Ter119-negativa del fegato fetale di topo a metà gestazione 10,24,25. Nessuno di questi approcci, tuttavia, consente lo studio di BFU-e e CFU-e adulti nel loro stato fisiologico in vivo. L'entità della sfida può essere apprezzata quando si ricorda che, sulla base di saggi di formazione di colonie, queste cellule sono presenti nel midollo osseo adulto ad una frequenza di solo 0,025% e 0,3%, rispettivamente6.
Il protocollo qui descritto è un nuovo approccio citometrico a flusso basato sull'analisi trascrittomica a singola cellula di cellule midollari di topo Kit+ appena raccolte (Kit è espresso da tutte le prime popolazioni progenitrici del midollo osseo)1. Il nostro approccio contiene alcuni marcatori di superficie cellulare che erano già in uso da Pronk et al.21,26. I trascrittomi a singola cellula sono stati utilizzati per determinare combinazioni di marcatori di superficie cellulare che identificano eritroidi e altri progenitori ematopoietici precoci (Figura 2). In particolare, la frazione CD55+ delle cellule Kit+ lin-negative può essere suddivisa in cinque popolazioni, tre delle quali producono segmenti contigui della traiettoria eritroide (Figura 2). Le identità trascrittomiche di ciascuna di queste popolazioni sono state confermate mediante ordinamento, seguito da scRNAseq e proiezione dei trascrittomi monocellulari ordinati sulla mappa trascrittomica originale (l'espressione genica in ciascuna delle cinque popolazioni e l'intero set di dati del midollo osseo possono essere esplorati in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Il potenziale di destino cellulare di ciascuna delle popolazioni è stato confermato utilizzando saggi tradizionali di formazione di colonie (Figura 2), nonché un nuovo saggio di destino a singola cellula ad alto rendimento 1,27. Queste analisi mostrano che il nuovo approccio citometrico a flusso si traduce in un isolamento ad alta purezza di tutti i progenitori BFU-e e CFU-e del midollo osseo e della milza adulti freschi. In particolare, la popolazione 1 (P1) contiene solo CFU-e e nessun altro progenitore ematopoietico, e la popolazione 2 (P2) contiene tutti i progenitori BFU-e del midollo osseo e un piccolo numero di CFU-e ma nessun altro progenitore1. Il protocollo dettagliato di seguito è ulteriormente illustrato con un esperimento di esempio in topi a cui è stata iniettata soluzione salina o con l'ormone stimolante l'eritropoiesi (Epo).

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1000 &; L punte dell'orifizio grande</td><td>USA sceintific</td><td>1011-9000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo CD55 (DAF) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>131806</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>557395</td><td>M1/70 (clone)</td></tr><tr><td>Biotin-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td>1D3 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553045</td><td>RM4-5 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553029</td><td>53-6.7 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>BM8 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-Ly-6G e Ly-6C</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>RB6-8C5 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>TER-119 (clone)</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma aldritch</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-umano/topo CD49f Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>313624</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-topo CD41 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>133921</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-topo CD150 (SLAM) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>115931</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cellule</td><td>BD Biosciences</td><td>563827</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Rabbit IgG, molecola intera</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Digital DIVA hardware e software per LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo Anticorpo</td> <td>F4/80BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553785</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G e LY-6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553127</tr><tr><td>software FlowJo&nbsp;</td><td>Software di analisi del citometro a flusso FlowJo</td><td>versione 10</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore digitale multiparametrico del citometro a flusso LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometro a flusso&nbsp;</td></tr><tr><td>NewlineNY Schiacciamani e Schiacciamani in Acciaio Inox Set di ciotole, mortaio e pestello</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di ratto normale</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo CD105 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>120408</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-topo CD71 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 10x Soluzione</td><td>Fisher scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480016</td><td>Perline magnetiche</td></tr></tbody></table>

identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

I primi progenitori eritroidi sono stati originariamente definiti dal loro potenziale di formazione di colonie in vitro e classificati in "unità" che formano scoppi e colonie note come BFU-e e CFU-e. Fino a poco tempo fa, non erano disponibili metodi per l'isolamento diretto prospettico e completo di progenitori puri di BFU-e e CFU-e da midollo osseo di topo adulto appena isolato. Per colmare questa lacuna, è stato analizzato un set di dati RNA-seq (scRNAseq) a singola cellula del midollo osseo di topo per l'espressione di geni che codificano per i marcatori di superficie cellulare. Questa analisi è stata combinata con saggi sul destino cellulare, consentendo lo sviluppo di un nuovo approccio citometrico a flusso che identifica e consente l'isolamento di sottogruppi completi e puri di progenitori BFU-e e CFU-e nel midollo osseo o nella milza di topo. Questo approccio identifica anche altri sottoinsiemi progenitori, inclusi sottoinsiemi arricchiti per potenziali basofili/mastociti e megacariociti. Il metodo consiste nell'etichettare le cellule fresche del midollo osseo o della milza con anticorpi diretti a Kit e CD55. I progenitori che esprimono entrambi questi marcatori sono quindi suddivisi in cinque popolazioni principali. La popolazione 1 (P1 o CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) contiene tutti i progenitori CFU-e e può essere ulteriormente suddivisa in P1-low (CD71med CD150high) e P1-hi (CD71 high CD150 low), corrispondenti rispettivamente a CFU-e precoce e tardiva; La popolazione 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contiene tutti i progenitori della BFU-e; La popolazione P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) è arricchita per i progenitori basofili/mastociti; La popolazione 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) è arricchita per i progenitori megacariociti; e la popolazione 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41-) contiene progenitori con potenziale eritroide, basofilo/mastocitario e megacariocitico (EBMP) e progenitori multipotenziali (MPP) eritroidi/megacariocitici/basofili. Questo nuovo approccio consente una maggiore precisione nell'analisi dell'eritroide e di altri progenitori ematopoietici e consente anche di fare riferimento alle informazioni sul trascrittoma per ogni popolazione a flusso definita citometricamente.

Il protocollo descrive un approccio citometrico a flusso per identificare BFU-es e CFU-es nelle cellule del midollo osseo e della milza appena raccolte. Inizia con la raccolta di BM fresco e milza dai topi e immediatamente mettendo il tessuto sul ghiaccio. Tutte le procedure sono condotte a freddo per preservare la vitalità cellulare. Le cellule sono marcate con un cocktail di anticorpi "lignaggio" che consente l'esclusione di tutte le cellule che esprimono marcatori di linee di sangue differenziate (il cocktail FITC-Lin...

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Questo protocollo consente l'identificazione e l'isolamento dei progenitori eritroidi BFU-E e CFU-E direttamente dal tessuto di topo appena raccolto come midollo osseo e milza. Usando questa tecnica, possiamo isolare popolazioni pure di progenitori eritroidi, cosa che non era possibile con i precedenti protocolli di flusso. Questo metodo migliora notevolmente la nostra capacità di studiare modelli murini di malattia eritroide consentendo l'isolamento dei progenitori per molti esperimenti a valle.Per iniziare, posizionare i femori e la tibia appena sezionati direttamente nel tampone colorante freddo o SB-5 e mantenere i tubi sul ghiaccio fino al momento di estrarre il midollo osseo. Metti una malta sterilizzata pulita sul ghiaccio in un secchio e trasferisci le ossa nel mortaio. Usando le forbici da dissezione, tagliare circa 1 millimetro di estremità di ciascun osso.Utilizzare una siringa da 3 millilitri dotata di un ago da 26 gauge contenente SB-5 per lavare il midollo dalle ossa e raccoglierlo nel mortaio e ripetere il processo da 3 a 5 volte usando un tampone fresco ogni volta fino a quando le ossa appaiono incolori. Filtrare il midollo lavato attraverso una maglia di 100 micrometri e raccogliere le cellule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Quindi, utilizzare il mortaio e il pestello per schiacciare le ossa arrossate in 5-10 millilitri di SB-5.Filtrare la miscela di ossa frantumate e tamponare attraverso il filtro cellulare da 100 micrometri per raggruppare le cellule precedentemente raccolte. Installare un filtro a maglie da 100 micrometri su un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Posizionare una singola milza sul filtro a rete e aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di SB-5 alla milza per assicurarsi che non si asciughi.Utilizzando il lato in gomma di uno stantuffo per siringhe da 3 o 5 millilitri, schiacciare la milza attraverso la rete. Aggiungere più SB-5, 5 millilitri alla volta, e continuare a schiacciare fino a quando tutte le cellule sono state raccolte nel tubo. Preparare una sospensione a cella singola pipettando su e giù le celle raccolte con 2 millilitri di SB-5 utilizzando una grande punta dell'orifizio.Colorare la fluorescenza meno uno o i controlli FMO aggiungendo tutti gli anticorpi tranne l'omonimo anticorpo FMO alla sospensione cellulare nel tubo FACS. Per colorare i controlli monocolore, aggiungere un singolo anticorpo alla sospensione cellulare nel tubo FACS. Vortice ogni tubo di controllo per 2 o 3 secondi a 3000 RPM e poi incubare a 4 gradi Celsius oscillando per 2,5 ore al buio.Dopo l'incubazione, lavare le cellule con SB-5 e aumentare il volume della sospensione cellulare a 4 millilitri con SB-5. Ruotare le cellule a 900 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e aspirare il surnatante. Risospendere i controlli non colorati e tutti i controlli monocolore in 300 microlitri di SB-5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in nuovi tubi FACS.Crea una soluzione DAPI SB-5 diluendo lo stock DAPI in un rapporto da 1 a 10.000 in SB-5. Risospendere l'FMOS in 1,8 millilitri di DAPI SB-5 e il controllo monocolore DAPI in 300 microlitri di DAPI SB-5, quindi filtrarli attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in nuovi tubi FACS. Dopo aver aggiunto la miscela principale di anticorpi a ciascun campione, vortice le provette per 2 o 3 secondi a 3000 giri / min seguita da incubazione a 4 gradi Celsius al buio per 2,5 ore in condizioni di oscillazione.Dopo aver lavato le cellule come dimostrato in precedenza, risospendere i campioni in 1,8 millilitri di DAPI SB-5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 micrometri in una nuova provetta FACS e analizzare i campioni utilizzando un cistometro. Utilizzare la dispersione diretta per rimuovere i detriti in base alle dimensioni, quindi utilizzare l'istogramma dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'istogramma dell'area di dispersione diretta per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle. Ripetete l'esclusione con l'altezza di dispersione laterale rispetto all'istogramma dell'area di dispersione laterale.Escludere le cellule morte eliminando le celle positive per DAPI. Selezionare il ligname negativo TUR uno 19 negativo kit celle positive. E da questi selezionare una sottopopolazione che esprime CD 55.Suddividere il lignaggio negativo TUR uno 19, kit negativo, positivo, cellule CD 55 positive in 2 popolazioni principali, P sei e P sette in base all'espressione di CD 49 F e CD 1 0 5. Ora, sulla base dell'espressione di CD 150 e CD 41, suddividere ulteriormente P 6 in P 3, P 4 e P 5. Allo stesso modo, sulla base dell'espressione di CD 150 e CD 71, suddividere ulteriormente P 7 in BFUE, CFUE precoce e CFUE tardiva.Nel presente studio, sono state identificate unità di scoppio e formazione di colonie dalle cellule del midollo osseo e della milza appena raccolte. Dopo 72 ore di eritropoietina, o iniezione di veicolo nei topi, la stimolazione dell'eritropoietina ha mostrato un'espansione delle popolazioni di unità di formazione di colonie precoci e tardive P 1 basse e P 1 alte nel midollo osseo raccolto e nelle cellule della milza. La risposta dei progenitori del midollo osseo e della milza all'eritropoietina in vivo ha anche mostrato un numero più elevato di cellule nelle popolazioni di unità di formazione delle colonie precoci e tardive P 1 basse e P 1 alte, rispetto al controllo del veicolo.È molto importante generare una singola sospensione cellulare prima di marcare le cellule con anticorpi. Ciò può essere ottenuto pipettando ripetutamente su e giù e includendo EDTA nel buffer. I progenitori purificati possono essere utilizzati per qualsiasi analisi cellulare e molecolare a valle.Ad esempio, trascrittomica a singola cellula, atesque, saggi di colonia e biochimica. Questa tecnica ci ha aiutato a testare le previsioni degli esperimenti di RNA-seq a singola cellula.

identification-isolation-burst-forming-unit-colony-forming-unit

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.

Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Qui viene presentata una tecnica basata sulla citometria a flusso che consente di misurare simultaneamente il numero di divisioni cellulari, il fenotipo cellulare di superficie e la parentela cellulare. Queste proprietà possono essere testate statisticamente utilizzando un framework basato sulla permutazione.

Valutazione simultanea di parentela, numero di divisione e fenotipo tramite citometria a flusso per cellule staminali e progenitrici ematopoietiche

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Descriviamo una strategia di selezione per spermatidi di topo utilizzando la citometria a flusso. Gli spermatidi sono suddivisi in quattro popolazioni altamente pure, tra cui rotonda (fasi di spermiogenesi 1-9), allungamento precoce (fasi di spermiogenesi 10-12), allungamento tardivo (fasi di spermiogenesi 13-14) e spermatidi allungati (fasi di spermiogenesi 15-16). La colorazione, la dimensione e la granulosità del DNA sono utilizzate come parametri di selezione.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Scopri l'isolamento di progenitori eritroidi BFU-e e CFU-e da midollo osseo e milza murini mediante citometria a flusso. Questa tecnica ad alta purezza consente studi avanzati sulle malattie eritroidi.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dellunità burst-forming e dellunità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Esplora altri video