Name: Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri metodi quantitativi per rilevare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi sui globuli rossi. Queste tecniche utilizzano citometria a flusso e spettrometria per analisi precise.

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1. Preparazione di bromelina trattati globuli rossi <ol><li> Globuli rossi Lavare 0 tipizzate 3x con 1x PBS (centrifugazione a 664 xg per 2-5 min). </li><li> Incubare 1 volume di eritrociti concentrati con due volumi di una soluzione bromelina 0,5% per 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule 3x 1x PBS. </li><li> Le cellule possono essere memorizzati come una soluzione al 3% a 4 ° C in PBS 1x per almeno una settimana. </li></ol> 2. C3 e C4 Deposizione Analisi su globuli rossi di FACS <ol><li> Calore inattivare la quantità necessaria di siero del paziente (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) mediante riscaldamento del campione per 30 minuti a 56 ° C. </li><li> Lavare RBC bromelina trattati tre volte in VBG - (5 veronal mM, NaCl 150 mM, 0,05% gelatina pH 7.4) e risospendere in VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl 2 + 10 mM CaCl 2) per dare un soluzione allo 0,5%. </li><li> Pipettare i seguenti componenti in un piatto fondo rotondo con una perla di vetro (fo corretta miscelazione): 25 microlitri 0,5% globuli rossi, 37,5 ml di siero fresco AB (fonte complemento) e 37,5 ml 200 mg / ml anti-C5. Anti-C5 è costoso e potrebbe essere difficile da ottenere. Si potrebbe considerare l&#39;utilizzo di siero C5-/C6-/C7- o C8-deficienti, invece di siero AB e anti-C5. </li><li> Aggiungere siero del paziente per pozzetto per una concentrazione finale di 0,1-33%. Corretto per le differenze di concentrazione sierica per pozzetto dovute utilizzando siero AB inattivato al calore. Aggiungere VBG + + per ottenere un volume finale di 150 microlitri / pozzetto. Chiudi piastra con ELISA pellicola. </li><li> Incubare 1,5-2 ore a 37 ° C sotto agitazione. </li><li> Lavare gli RBC tre volte con PBS + 0,5% BSA (centrifugazione a 664 xg per 2 minuti). </li><li> Aggiungere fluorescente anti-C3 e anticorpi monoclonali anti-C4 o loro frammenti Fab (per ridurre l&#39;agglutinazione) in PBS + 0,5% BSA ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Qui personalizzata sviluppata anti-C3-Alexa Fluor 488 e vengono utilizzati anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorpi monoclonali, la scelta di These le etichette fluorescenti permette la rilevazione simultanea di C3 e C4 da FACS. </li><li> Incubare 30-45 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. </li><li> Lavare globuli rossi 3x con PBS + 0,5% BSA. </li><li> Risospendere GR 150 microlitri di PBS +0,5% BSA e li pipetta in una nuova piastra (di sbarazzarsi delle perle di vetro prima dell&#39;analisi FACS). </li><li> Eseguire l&#39;analisi FACS. Separare singole cellule da doppietti in una dispersione tracciato FSC-A, impostare la porta sui singoli globuli rossi; selezionare il canale di rilevamento appropriato per i segnali di fluorescenza (ad esempio FITC e APC). </li><li> Quantificare risultati usando l&#39;intensità di fluorescenza mediana. </li></ol> Nota: E &#39;possibile utilizzare un controllo isotipico (es fluorescente anti-IL6 topo IgG1). Tuttavia, si raccomanda di includere un vero controllo negativo esempio incubando RBC senza siero del paziente (solo siero AB) o senza una fonte complemento (AB siero inattivato al calore e siero inattivato al calore), und poi macchiare questi con lo stesso anti-C3-Alexa Fluor 488 e anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorpi. Questo dà un controllo più valido di un isotipo di controllo in caso di globuli rossi 12, sebbene questi diversi controlli tipicamente danno lo stesso, esito negativo. 3. Quantitative Assay emolitica <ol><li> Calore inattivare la quantità necessaria di sieri dei pazienti (o altra sorgente anticorpo anti-RBC) riscaldando il campione 30 min a 56 ° C. </li><li> Lavare globuli rossi 3x con VBG - e una volta con VBG + +. </li><li> Pipettare i seguenti componenti in un piatto fondo rotondo con una perla di vetro (per una corretta miscelazione): 35 ml 3% globuli rossi, 25 ml di siero fresco AB (fonte complemento) e il siero del paziente 1-50%. Corretto per le differenze di concentrazione del siero utilizzando siero AB inattivato al calore. Aggiungere VBG + + per ottenere un volume finale di 150 microlitri / pozzetto. Chiudi piastra con ELISA pellicola. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1,5-2 ore con agitazione. </li><li> CPiastra entrifuge a 664 xg per 5 minuti con la decelerazione ridotta (ad esempio, la decelerazione alla piena fermata in 2-3 min). </li><li> Pipetta con cautela 90 microlitri surnatante in una nuova micropiastra. È importante, in questa fase per evitare bolle d&#39;aria e per evitare di portare con cellule intatte. </li><li> Misurare A414/690 in uno spettrofotometro adeguato. </li><li> Esprimere la lisi come percentuale della lisi di un campione eritrociti con acqua pura. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l&#39;interpretazione è ob...

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l&#39;attivazione sul seguente trasfusione 5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l&#39;interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso recettori del complemento nel fegato 6,7. Attivazione del complemento fulminante con conseguente emolisi intravascolare è rara, ma spesso fatale. Accelerata, integrare mediata distruzione RBC indotta da entrambi risultati-allo o autoanticorpi in anemia acuta e ipossia tissutale, quindi, potenzialmente fatale. Gli auto-anticorpi in MEA sono classificati in anticorpi caldi e freddi, depending della temperatura ottimale si legano a RBC (rispettivamente 37 ° C o inferiori,). Gli anticorpi caldi sono generalmente di isotipo IgG e gli anticorpi fredde del isotipo IgM 8,9. MEA può essere secondaria ad es lymphoprolyferative disturbi, malattie del tessuto connettivo, tumori solidi, infezioni o droghe, ma nel 50% dei casi è idiopatica MEA 9. Rilevamento di gammaglobuline (ad es. IgG o IgM) e complementare legato a globuli rossi del paziente viene eseguita mediante un diretto all&#39;antiglobulina semiquantitativa (Coombs) Test (DAT). Nella DAT globuli rossi del paziente vengono incubati con anticorpi anti-IgG o anti-C3d. Presenza di RBC agglutinazione dimostra la presenza di componenti del complemento montati o IgG vincolante. Rilevamento di-allo o autoanticorpi nel siero del paziente viene eseguita mediante il test indiretto (IAT). Nel IAT, globuli rossi prova bromelina trattati vengono incubati con siero del paziente, lavate e poi incubate con anti-hUman IgG. Nel caso in cui i globuli rossi sono stati sensibilizzati con anticorpi anti-IgG RBC presenti nel agglutinazione siero del paziente si verificherà. Anticorpi IgM anti globuli rossi saranno direttamente portare a agglutinazione su di incubazione di globuli rossi prova bromelina trattati con siero del paziente. RBC agglutinazione nel test di Coombs diretto o in IAT è valutata visivamente sia dall&#39;occhio in una provetta o caricando il campione su una piccola colonna Sephadex separa RBC agglutinate e singoli per dimensione 1. Un&#39;altra tecnica frequentemente utilizzata per misurare l&#39;attivazione del complemento su globuli rossi è il saggio emolitico 1, in cui viene valutata la capacità del siero del paziente per indurre (complemento-mediata) emolisi dei globuli rossi bromelina trattati 10. Il test è notato come positivo quando il surnatante dopo centrifugazione è macchiato rosso causa emoglobina rilasciata e considerato negativo se rimane incolore. Sia il test antiglobulina e il saggio emolitico sono semiquantitativa, poiché la massima Serum diluizione è indicato in cui il test è ancora positivo. Il test di Coombs e il saggio emolitico sono test affidabili che sono abitualmente utilizzati nella diagnostica. Poiché questi saggi sono semiquantitativa e dipendente dall&#39;esperienza del tecnico esecuzione del saggio non sono adatti per studiare le sottili differenze di attivazione del complemento di globuli rossi, come necessario quando valutare l&#39;efficacia di inibitori del complemento. Pertanto, abbiamo sviluppato due analisi quantitative per determinare l&#39;attivazione del complemento da anticorpi (auto-) per i globuli rossi, che descriveremo in questo articolo. In primo luogo, abbiamo sviluppato un saggio per misurare la deposizione di frammenti attivazione del complemento C3 e C4 su globuli rossi (Figura 1A). In questo saggio, bromelina trattati umane di tipo-0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi), siero fresco AB (fonte complemento) e anti-C5 anticorpo monoclonale (Eculizumab). Durante questa incubation, C3 e C4 deposizione si verifica se il siero del paziente contiene completano l&#39;attivazione di anticorpi anti-RBC. Per evitare di lisi da attivazione del complemento a valle viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-C5 blocco. Successivamente, C3 e C4 deposizione sul globuli rossi viene rilevato mediante FACS utilizzando anticorpi monoclonali fluorescente o frammenti Fab-reagiscono con C3 e C4, rispettivamente. Gating sul singolo globuli rossi è importante per garantire l&#39;affidabilità dei risultati. I vantaggi di questa tecnica sono che è necessaria una piccola quantità di materiale paziente, l&#39;attivazione del complemento in una fase iniziale della cascata è valutato e il metodo è riproducibile e quantitativa. Un ulteriore vantaggio di guardare sia C3 e C4 è che una distinzione può essere fatta tra l&#39;attivazione classica e lectina pathway (sia C3 e C4 deposizione) e l&#39;attivazione della via alternativa (solo C3 deposizione). L&#39;uso di GR bromelina trattato invece di eritrociti non trattati aumenta la sensibilità del comedire. Il secondo saggio è basato sul dosaggio emolitica attualmente utilizzato (Figura 1B). Umani bromelina trattati tipo 0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi) e siero fresco AB (fonte complemento). Se complemento è attivato da anticorpi anti-RBC paziente, si verificherà dose-dipendente di lisi, porta al rilascio di emoglobina. La quantità di emoglobina rilasciata viene quantificato misurando la sua assorbanza a 414 nm nel supernatante dopo la filatura le eritrociti intatti e frammentati. L&#39;assorbanza è correlata alla quantità di emolisi verificato. In contrasto con il dosaggio attualmente in uso, questo protocollo permette un obiettivo, valore quantitativo di emolisi che è molto riproducibile e non dipende dalla persona interpretazione del saggio. Un&#39;applicazione di questi metodi è stato descritto in 11, in cui l&#39;uso potenziale di C1-inibitore come inibitore del complemento in MEA era studied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci.</td></tr><tr><td>Barbital di sodio</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Questa sostanza chimica è soggetta a regolamentazione dei farmaci.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 colorante reattivo all'ammina</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 colorante reattivo all'ammina</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Può essere utilizzato qualsiasi FACS che abbia i laser appropriati.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro (ad es. spettro Multiskan)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi spettrofotometro con la giusta gamma di lunghezze d'onda</td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi software di analisi FACS compatibile</td></tr><tr><td>Bromelina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere - soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare - fatale 1. Attualmente, l&#39;attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi 1-4. Tuttavia, per valutare l&#39;efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.

Figura 2A mostra un grafico rappresentante dispersione di globuli rossi. Gating Adatto per singoli globuli rossi può essere visto in de FSC-W - FSC-A plot (P1). Solitamente circa il 95% dei globuli rossi rientrano in questa porta P1 (singole cellule), ma quando viene usata una percentuale di siero del paziente, questo può cadere al 70-80%, specialmente quando anti-RBC IgM è presente nel siero del paziente. Risultati rappresentativi per l&#39;effetto del siero del paziente ME...

Qui si descrivono due saggi per misurare l&#39;attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.

Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'attivazione del complemento da parte di anticorpi diretti contro i globuli rossi o RBC nel siero del paziente. Questo viene ottenuto incubando i globuli rossi con il siero del paziente in presenza di un anticorpo bloccante anti C5 per indurre il deposito di C4 e C3 sulla superficie dei globuli rossi. Successivamente, i globuli rossi vengono colorati con anticorpi anti C4 e anti C3 marcati con fluorocromo, e la quantità di deposito di complemento sui globuli rossi può quindi essere analizzata mediante citometria a flusso in un metodo alternativo.I globuli rossi vengono incubati con il siero del paziente in assenza di anti-C5 per indurre la lisi mediata dal complemento. La percentuale di globuli rossi lisati può quindi essere determinata misurando la quantità di emoglobina rilasciata dalle cellule mediante spettrometria. Il principale vantaggio di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test di emolisi o il test antiglobulina utilizzati nella diagnostica di routine, è che essa è di natura quantitativa e consente di rilevare differenze subottimali nell'attivazione del complemento.Elizabeth Brook, postdottoranda nel nostro laboratorio, illustrerà le procedure. Iniziare lavando tre volte i globuli rossi di gruppo zero con PBS, quindi incubare il pellet in una soluzione allo 0,5% di Roma lane in rapporto uno a due per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule altre tre volte, conservarle come soluzione al 3% in PBS fresco a quattro gradi Celsius. Per analizzare il deposito di complemento sui globuli rossi mediante citometria a flusso, prima inattivare termicamente la quantità desiderata di siero del paziente per 30 minuti a 56 gradi Celsius. Mentre il siero viene trattato termicamente, lavare tre volte i globuli rossi trattati con brola nel buffer Roal dopo l'ultimo lavaggio.Risospendere il pellet in vbg plus plus in una diluizione dello 0,5%. Successivamente, in ogni pozzetto di una piastra rotonda a 96 pozzetti, aggiungere 25 microlitri di globuli rossi allo 0,5%, 37,5 microlitri di siero AB fresco e 37,5 microlitri di anti-C cinque a 200 microgrammi per millilitro. Quindi aggiungere il siero del paziente inattivato termicamente in ciascun pozzetto alla concentrazione appropriata, integrando con siero AB inattivato termicamente se necessario, e includendo anche un controllo negativo.Utilizzare VBG plus plus per portare ogni pozzetto a un volume finale di 150 microlitri, quindi incubare la piastra coperta con pellicola E IA per un'ora e mezza fino a due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS integrato con 0,5% di BSA, quindi marcare le cellule con un microgrammo per millilitro di anticorpi monoclonali anti-C3 e anti-C4 marcati con fluorocromo. Incubare le cellule per 30-45 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata; dopo aver lavato la piastra tre volte, risospendere i globuli rossi in 150 microlitri di PBS più 0,5% di BSA ciascuno.Trasferiremo le sospensioni cellulari in una nuova piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, quindi caricheremo la piastra nel citofluorimetro e separeremo le cellule singole dai doppietti utilizzando un grafico di scattering anteriore. Impostare la finestra (gate) sulle eritrociti singoli, quindi selezionare il canale di rilevamento appropriato per i segnali fluorescenti. Quantificare i risultati utilizzando l'intensità mediana della fluorescenza per l'analisi emolitica quantitativa, riscaldare e attivare il siero del paziente e lavare gli eritrociti trattati con romaine come appena dimostrato.Successivamente, dopo aver incubato i globuli rossi con il complemento e il siero del paziente come appena illustrato, ma senza l'anti C5, centrifugare le cellule per cinque minuti a 664 ×g con decelerazione ridotta. Successivamente, trasferire con attenzione 90 microlitri di sopranatante in una nuova piastra microtitolatrice, avendo cura di non trasferire le cellule integre e di evitare la formazione di bolle d'aria, quindi misurare l'assorbanza a 414-690 nm con uno spettrofotometro Express. Calcolare l'emolisi come percentuale della lisi di un campione di globuli rossi incubato in acqua pura.In questa prima figura, sono mostrati grafici a dispersione rappresentativi per i globuli rossi trattati con brola, in cui si può osservare un gating appropriato per singoli globuli rossi. Tipicamente, circa il 95% dei globuli rossi rientra in questa finestra per singola cellula. In questi istogrammi sono riportati risultati rappresentativi relativi all'effetto dell'anemia emolitica autoimmune o AHA.Il siero del paziente sulla deposizione di C4 e C3 è mostrato come previsto: un quantitativo maggiore di siero del paziente porta a una maggiore deposizione del complemento. Curiosamente, la deposizione del complemento avviene in due picchi positivi distinti. Questo fenomeno probabilmente non è causato da un’eterogeneità nella popolazione di globuli rossi, poiché i globuli rossi provengono da un singolo donatore; sebbene la causa di questo fenomeno sia ancora in fase di studio, le intensità medie di fluorescenza dei campioni sono riportate in questi grafici lineari per mostrare la riproducibilità dei saggi di deposizione di C4 e C3.Si noti l'ampia variabilità nel deposito dei diversi campioni di pazienti AH H. Infine, nei grafici è possibile osservare i dati ottenuti da un saggio emolitico su un campione di siero di paziente ahha contenente autoanticorpi contro i globuli rossi. La titolazione con il campione di siero produce una curva chiara e riproducibile in presenza di un inibitore del complemento adeguato, come l'anti C5.Il segnale emolitico può essere titolato, come dimostrato in questo grafico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attivazione del complemento mediante anticorpi specifici per i globuli rossi, sia tramite analisi citofluorimetrica del deposito di C3 o C4, sia mediante saggio emolitico quantitativo.

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Immunologia e Infezioni

La via classica è attivata da anticorpi e culmina nella lisi delle cellule bersaglio. Il...

Misura del Complemento 50% emolitica (CH 50) Attività di siero

Fonte: Nagre, N., et al. Macrofagi alveolare, fagocitosi e eliminazione dei batteri nei topi. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra la valutazione della fagocitosi mediata dai recettori del complemento utilizzando globuli rossi di pecora opsonizzati con IgM e complemento, seguita dalla loro acquisizione da parte dei macrofagi del topo. L'entità della fagocitosi viene quantificata midendo un prodotto cromogenico blu formato tramite ossidazione catalizzata dall'emoglobina del diaminofluorene.

Modellazione della fagocitosi mediata dal complemento utilizzando globuli rossi opsonizzati in vitro

Questo video dimostra una tecnica per valutare l'attività battericida mediata dal complemento degli anticorpi presenti nel siero. Questo approccio combina siero isolato con batteri patogeni e proteine esogene del complemento. Dopo l'incubazione, i batteri vengono coltivati su una piastra di agar e le colonie prodotte vengono quantificate per misurare il titolo battericida sierico.

Un test battericida sierico per l'attività battericida mediata dal complemento degli anticorpi

Il video mostra un test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare anticorpi sierici contro antigeni specifici. La conferma dell'inibizione dell'emoagglutinazione nel pozzetto del test e dell'emoagglutinazione nel pozzetto di controllo si ottiene attraverso modelli visivi distinti. Questo test svolge un ruolo cruciale nella valutazione della risposta immunitaria, dell'efficacia del vaccino e nello studio delle infezioni virali in virologia e immunologia.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare gli anticorpi sierici contro un antigene bersaglio

Questo video mostra un test che misura l'attivazione mediata da anticorpi delle funzioni effettrici delle cellule T. L'aggiunta di un anticorpo monoclonale specifico per l'emoagglutinina (HA) del virus dell'influenza alle cellule di mammifero trasfettate che esprimono HA provoca la formazione di immunocomplessi con HA. Dopo l'introduzione di cellule T ingegnerizzate che esprimono recettori Fc e un reporter della luciferasi, le cellule T vengono attivate dai complessi anticorpo-HA e questa...

Misurazione dell'attivazione delle funzioni effettrici mediate da FC da parte degli anticorpi HA

Questo video mostra un test per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP) da parte dei fagociti del latte materno. Microsfere marcate in fluorescenza, coniugate a un complesso antigene-anticorpo, sono combinate con una sospensione cellulare isolata dal latte materno per indurre la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei leucociti fagociti. Dopo aver marcato le cellule con anticorpi contro l'antigene leucocitario comune (CD45), la citometria a flusso viene...

Un test in vitro per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei fagociti

Il test monostrato dei monociti (MMA) è un test in vitro che utilizza monociti primari isolati ottenuti da sangue intero periferico di mammifero per valutare la fagocitosi mediata dal recettore Fcγ (FcγR).

L&#39;uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Lo scopo di questo metodo è quello di determinare la densità di CR1 negli eritrociti di qualsiasi soggetto confrontandosi con tre soggetti la cui densità di eritrocito CR1 è nota. Il metodo utilizza la citometria di flusso dopo l'immunostaining degli eritrociti dei soggetti da parte di un anticorpo monoclonale anti-CR1 accoppiato a un sistema amplificato utilizzando la ficoerythrina (PE).

Misurazione del recettore del complemento dell'eritrocite 1 utilizzando la citometria di flusso

Catturare i cambiamenti dinamici nell'attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l'analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.

Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Abbiamo sviluppato miglioramenti e metodi aggiornati per l'attuale test monocita-monostrato (MMA), in cui i macrofagi vengono utilizzati per aiutare a prevedere meglio la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale e nell'immunologia. Questo test è chiamato test dei monociti-macrofagi (M-MA).

Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Scopri metodi quantitativi per rilevare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi sui globuli rossi. Queste tecniche utilizzano citometria a flusso e spettrometria per analisi precise.

Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

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