Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi
29 gennaio 2014
Qui si descrivono due saggi per misurare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'attivazione del complemento da parte di anticorpi diretti contro i globuli rossi o RBC nel siero del paziente. Questo viene ottenuto incubando i globuli rossi con il siero del paziente in presenza di un anticorpo bloccante anti C5 per indurre il deposito di C4 e C3 sulla superficie dei globuli rossi. Successivamente, i globuli rossi vengono colorati con anticorpi anti C4 e anti C3 marcati con fluorocromo, e la quantità di deposito di complemento sui globuli rossi può quindi essere analizzata mediante citometria a flusso in un metodo alternativo.
I globuli rossi vengono incubati con il siero del paziente in assenza di anti-C5 per indurre la lisi mediata dal complemento. La percentuale di globuli rossi lisati può quindi essere determinata misurando la quantità di emoglobina rilasciata dalle cellule mediante spettrometria. Il principale vantaggio di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test di emolisi o il test antiglobulina utilizzati nella diagnostica di routine, è che essa è di natura quantitativa e consente di rilevare differenze subottimali nell'attivazione del complemento.
Elizabeth Brook, postdottoranda nel nostro laboratorio, illustrerà le procedure. Iniziare lavando tre volte i globuli rossi di gruppo zero con PBS, quindi incubare il pellet in una soluzione allo 0,5% di Roma lane in rapporto uno a due per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule altre tre volte, conservarle come soluzione al 3% in PBS fresco a quattro gradi Celsius. Per analizzare il deposito di complemento sui globuli rossi mediante citometria a flusso, prima inattivare termicamente la quantità desiderata di siero del paziente per 30 minuti a 56 gradi Celsius. Mentre il siero viene trattato termicamente, lavare tre volte i globuli rossi trattati con brola nel buffer Roal dopo l'ultimo lavaggio.
Risospendere il pellet in vbg plus plus in una diluizione dello 0,5%. Successivamente, in ogni pozzetto di una piastra rotonda a 96 pozzetti, aggiungere 25 microlitri di globuli rossi allo 0,5%, 37,5 microlitri di siero AB fresco e 37,5 microlitri di anti-C cinque a 200 microgrammi per millilitro. Quindi aggiungere il siero del paziente inattivato termicamente in ciascun pozzetto alla concentrazione appropriata, integrando con siero AB inattivato termicamente se necessario, e includendo anche un controllo negativo.
Utilizzare VBG plus plus per portare ogni pozzetto a un volume finale di 150 microlitri, quindi incubare la piastra coperta con pellicola E IA per un'ora e mezza fino a due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS integrato con 0,5% di BSA, quindi marcare le cellule con un microgrammo per millilitro di anticorpi monoclonali anti-C3 e anti-C4 marcati con fluorocromo. Incubare le cellule per 30-45 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata; dopo aver lavato la piastra tre volte, risospendere i globuli rossi in 150 microlitri di PBS più 0,5% di BSA ciascuno.
Trasferiremo le sospensioni cellulari in una nuova piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, quindi caricheremo la piastra nel citofluorimetro e separeremo le cellule singole dai doppietti utilizzando un grafico di scattering anteriore. Impostare la finestra (gate) sulle eritrociti singoli, quindi selezionare il canale di rilevamento appropriato per i segnali fluorescenti. Quantificare i risultati utilizzando l'intensità mediana della fluorescenza per l'analisi emolitica quantitativa, riscaldare e attivare il siero del paziente e lavare gli eritrociti trattati con romaine come appena dimostrato.
Successivamente, dopo aver incubato i globuli rossi con il complemento e il siero del paziente come appena illustrato, ma senza l'anti C5, centrifugare le cellule per cinque minuti a 664 ×g con decelerazione ridotta. Successivamente, trasferire con attenzione 90 microlitri di sopranatante in una nuova piastra microtitolatrice, avendo cura di non trasferire le cellule integre e di evitare la formazione di bolle d'aria, quindi misurare l'assorbanza a 414-690 nm con uno spettrofotometro Express. Calcolare l'emolisi come percentuale della lisi di un campione di globuli rossi incubato in acqua pura.
In questa prima figura, sono mostrati grafici a dispersione rappresentativi per i globuli rossi trattati con brola, in cui si può osservare un gating appropriato per singoli globuli rossi. Tipicamente, circa il 95% dei globuli rossi rientra in questa finestra per singola cellula. In questi istogrammi sono riportati risultati rappresentativi relativi all'effetto dell'anemia emolitica autoimmune o AHA.
Il siero del paziente sulla deposizione di C4 e C3 è mostrato come previsto: un quantitativo maggiore di siero del paziente porta a una maggiore deposizione del complemento. Curiosamente, la deposizione del complemento avviene in due picchi positivi distinti. Questo fenomeno probabilmente non è causato da un’eterogeneità nella popolazione di globuli rossi, poiché i globuli rossi provengono da un singolo donatore; sebbene la causa di questo fenomeno sia ancora in fase di studio, le intensità medie di fluorescenza dei campioni sono riportate in questi grafici lineari per mostrare la riproducibilità dei saggi di deposizione di C4 e C3.
Si noti l'ampia variabilità nel deposito dei diversi campioni di pazienti AH H. Infine, nei grafici è possibile osservare i dati ottenuti da un saggio emolitico su un campione di siero di paziente ahha contenente autoanticorpi contro i globuli rossi. La titolazione con il campione di siero produce una curva chiara e riproducibile in presenza di un inibitore del complemento adeguato, come l'anti C5.
Il segnale emolitico può essere titolato, come dimostrato in questo grafico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attivazione del complemento mediante anticorpi specifici per i globuli rossi, sia tramite analisi citofluorimetrica del deposito di C3 o C4, sia mediante saggio emolitico quantitativo.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive due saggi per la misurazione dell'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro i globuli rossi (RBCs). I saggi sono quantitativi e di facile interpretazione, offrendo vantaggi rispetto ai metodi esistenti.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Immunologia
- Ematologia
- Citometria in flusso
Sfondo
- L'attivazione del complemento è fondamentale nelle risposte immunitarie.
- Gli anticorpi contro i globuli rossi possono causare diverse condizioni cliniche.
- I saggi attuali possono mancare di precisione quantitativa.
- Metodi nuovi mirano a migliorare il rilevamento dell'attivazione del complemento.
Scopo dello studio
- Valutare l'attivazione del complemento da parte di anticorpi diretti contro i globuli rossi.
- Sviluppare un saggio quantitativo per un'interpretazione migliore dei risultati.
- Confrontare nuove tecniche con metodi diagnostici esistenti.
Metodi Utilizzati
- Incubazione di globuli rossi con siero del paziente e anticorpi bloccanti.
- Colorazione dei globuli rossi con anticorpi marcati fluorescentemente.
- Analisi del deposito di complemento mediante citometria a flusso.
- Misurazione del rilascio di emoglobina per determinare la lisi dei globuli rossi.
Risultati principali
- I nuovi saggi forniscono dati quantitativi sull'attivazione del complemento.
- È possibile rilevare differenze subottimali nell'attivazione.
- I risultati mostrano una sensibilità migliore rispetto ai metodi tradizionali.
- L'analisi mediante citometria a flusso consente un'interpretazione dettagliata.
Conclusioni
- I nuovi saggi migliorano la comprensione dell'attivazione del complemento.
- Offrono un'alternativa affidabile ai test diagnostici esistenti.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la diagnosi e il trattamento dei pazienti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione quantitativa dell'attivazione del complemento indotta da anticorpi sui globuli rossi è fondamentale per valutare l'efficacia degli inibitori del complemento e comprendere i meccanismi emolitici nei disturbi autoimmuni e alloimmuni. I saggi citometrici e spettrofotometrici descritti forniscono letture quantitative e riproducibili che consentono di rilevare differenze subottimali nell'attivazione del complemento, supportando l'identificazione dei meccanismi e la riduzione dei rischi nello sviluppo terapeutico. Questi metodi migliorano la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi trasformando osservazioni qualitative in biomarcatori misurabili e trasferibili per decisioni precliniche e cliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando il deposito di complemento (C3/C4) indotto da autoanticorpi o alloanticorpi sui globuli rossi.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale del bersaglio mediante la misurazione diretta dell'attività effettrice mediata dagli anticorpi, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione dei bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio generando dati quantitativi sulla potenza dell'attivazione del complemento, informando decisioni di avanzamento o interruzione per terapie modulatrici del complemento.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output standardizzati e quantitativi (intensità di fluorescenza mediana, rilascio di emoglobina) adatti allo screening ad alto rendimento di inibitori del complemento o di anticorpi terapeutici.
- Riproducibilità: Mostra una bassa variabilità tra campioni di siero di pazienti, consentendo una valutazione affidabile dei composti e una standardizzazione intersettoriale.
- Utilità della piattaforma: Utilizza strumentazione accessibile (citometro a flusso, spettrofotometro) per creare saggi riutilizzabili per la misurazione dell'attività biologica dipendente dal complemento nei processi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella i meccanismi fisiopatologici dell'anemia emolitica autoimmune (AIHA) e dell'emolisi alloimmune, collegando l'interazione con il bersaglio all'attivazione funzionale del complemento.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo biomarcatori quantitativi (deposizione di C3/C4, emolisi) che correlano con il potenziale emolitico clinico.
- Avanzamento basato sul rischio: Permette una riduzione del rischio di natura meccanicistica quantificando la lisi mediata dal complemento, fornendo informazioni per le valutazioni di sicurezza e la modellizzazione dose-risposta negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I saggi si integrano nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica della sicurezza, fornendo letture quantitative dell'attivazione del complemento che informano sulla riduzione del rischio biologico e sulla valutazione dell'indice terapeutico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando le vie di attivazione del complemento indotta da anticorpi, chiarificando il meccanismo d'azione di candidati immunomodulatori.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio (intensità di fluorescenza, emolisi spettrofotometrica) che consentono un confronto affidabile tra composti in esame o campioni sierici.
- Analisi: Genera letture misurabili (intensità mediana di fluorescenza, rilascio di emoglobina) che facilitano l'analisi statistica e il confronto tra diverse condizioni negli studi di risposta alla dose.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso output rilevanti per la malattia, che rispecchiano l'attivazione del complemento osservata nelle condizioni di AIEC e nelle trasfusioni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e standardizzata per la valutazione dell'attività dipendente dal complemento in terapie a base di anticorpi, biosimilari e inibitori del complemento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi convertendo saggi del complemento qualitativi in misurazioni quantitative e trasferibili.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso protocolli definiti per la preparazione dei globuli rossi, l'incubazione del siero e il rilevamento mediante citometria a flusso o spettrometria.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo il rilevamento precoce di potenziali problematiche legate all'attivazione del complemento, riducendo il rischio di fallimento in fase avanzata nei programmi di immunomodulazione.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta rispetto al rischio quantificando il potenziale di attivazione del complemento, sostenendo decisioni oggettive di avanzamento nello sviluppo terapeutico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunologia, citometria a flusso e gestione di saggi spettrofotometrici per misurazioni accurate del deposito di complemento e dell'emolisi.
- È vincolato all'accesso a citometri a flusso dotati di canali di fluorescenza adeguati e a spettrofotometri per la quantificazione dell'emoglobina a 414/690 nm.
- Necessita della standardizzazione della preparazione dei globuli rossi (ad esempio, di tipo zero, trattati con bromelina) e dell'inattivazione termica del siero per garantire la coerenza del saggio tra diversi utilizzatori e sedi.
- Richiede considerazioni adattative quando applicato a specie diverse di globuli rossi, densità di antigeni o fonti di complemento diverse dal siero AB umano.
- Le limitazioni pratiche includono la necessità di un trasferimento accurato del sopranatante per evitare il trascinamento cellulare e la formazione di bolle d'aria, che potrebbero compromettere l'accuratezza della quantificazione dell'emolisi.
