Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'attivazione del complemento da parte degli anticorpi contro i globuli rossi o i globuli rossi nel siero del paziente. Ciò si ottiene incubando i globuli rossi con il siero del paziente in presenza di anticorpi bloccanti anti C 5 per indurre la deposizione di C 4 e C3 sulla superficie dei globuli rossi. Successivamente, i globuli rossi vengono colorati con anticorpi anti C 4 e anti C3 marcati in fluorescenza e la quantità di deposizione del complemento sui globuli rossi può quindi essere analizzata mediante citometria a flusso in un metodo alternativo.

I globuli rossi vengono incubati con il siero del paziente in assenza di anti C 5 per indurre la lisi mediata dal complemento. La percentuale di globuli rossi lisati può quindi essere determinata misurando la quantità di emoglobina rilasciata dalle cellule mediante spettrometria. Il vantaggio principale di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'emolisi o il test delle antiglobuline utilizzato nella diagnostica di routine è che è di natura quantitativa e possiamo rilevare differenze non ottimali nell'attivazione del complemento.

Elizabeth Brook, postdoc nel nostro laboratorio, dimostrerà le procedure Iniziare lavando tre volte i globuli rossi zero tipizzati con PBS, quindi incubare il pellet in una soluzione di Roma lane allo 0,5% in un rapporto uno a due per 10 minuti a 37 gradi Celsius dopo aver lavato le cellule altre tre volte, conservarle come soluzione al 3% in PBS fresco a quattro gradi Celsius per analizzare la deposizione del complemento sui globuli rossi mediante citometria a flusso. Per prima cosa, con il calore, inattivare la quantità desiderata di siero paziente per 30 minuti a 56 gradi Celsius mentre il siero viene trattato termicamente. Lavare i globuli rossi trattati con brola tre volte in tampone Roal dopo il lavaggio finale.

Resus sospendere il pellet in vbg plus plus ad una diluizione dello 0,5%. Successivamente, a una perla di vetro, 25 microlitri di globuli rossi allo 0,5%, 37,5 microlitri di siero AB fresco e 37,5 microlitri di 200 microgrammi per millilitro, anti C cinque a ciascun pozzetto di una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti. Quindi aggiungere il siero paziente inattivato a caldo in ciascun pozzetto alla concentrazione appropriata, integrando con siero AB inattivato a caldo se necessario e includendo anche un controllo negativo.

Utilizzare VBG plus plus per portare ogni pozzetto a un volume finale di 150 microlitri e quindi incubare la piastra coperta con un foglio di E IA per un'ora e mezza o due ore a 37 gradi Celsius con agitazione dopo l'incubazione. Lavare le cellule tre volte con PBS integrato con 0,5% di BSA, quindi etichettare le cellule con un microgrammo per millilitro. Quattro anticorpi monoclonali anti C3 e anti C marcati in fluorescenza incubano le cellule per 30-45 minuti a temperatura ambiente con un leggero agitamento, quindi dopo aver lavato la piastra tre volte, riprospendono i globuli rossi in 150 microlitri di PBS più lo 0,5% di BSA per.

Trasferire bene le sospensioni cellulari su una nuova piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti, quindi caricare la piastra sul citometro a flusso, separare le singole cellule dai doppietti utilizzando un grafico di dispersione in avanti. Impostare il gate sui singoli globuli rossi e quindi selezionare il canale di rilevamento appropriato per i segnali fluorescenti. Quantificare i risultati utilizzando l'intensità mediana della fluorescenza per l'analisi emolitica quantitativa, riscaldare e attivare il siero del paziente e lavare i globuli rossi trattati con lattuga romana come appena dimostrato.

Quindi, dopo aver incubato i globuli rossi con il complemento e il siero del paziente come appena dimostrato, ma senza l'anti C cinque, far girare le cellule per cinque minuti a 664 GS con decelerazione ridotta. Successivamente, trasferire con cura 90 microlitri di surnatante in una nuova piastra per microtitolazione, facendo attenzione a non trasferire le cellule intatte e ad evitare la creazione di bolle d'aria, quindi misurare l'assorbimento a una velocità da quattro 14 a sei 90 in uno spettrofotometro espresso. L'emolisi come percentuale della lisi di un campione di globuli rossi incubato in acqua pura.

In questa prima figura, i grafici a dispersione rappresentativi per i globuli rossi trattati con brola sono mostrati qui Il gating adatto per i singoli globuli rossi. Tipicamente, circa il 95% dei globuli rossi rientra in questo cancello a singola cellula. In questi istogrammi risultati rappresentativi dell'effetto dell'anemia emolitica autoimmune o aha.

Il siero del paziente alla deposizione di C 4 e C3 viene mostrato come previsto, più siero del paziente porta a una maggiore deposizione di complemento. Curiosamente, la deposizione del complemento avviene in due picchi positivi distinti. Ciò probabilmente non è causato dall'eterogeneità nella popolazione di globuli rossi poiché i globuli rossi sono prelevati da un singolo donatore, sebbene la causa di questo fenomeno sia ancora in fase di studio, le intensità mediane di fluorescenza dei campioni sono tracciate in questi grafici a linee per mostrare la riproducibilità dei saggi di deposizione di C 4 e C3.

Si noti l'ampia variazione nella deposizione dei vari campioni di pazienti AH H. Infine, in questi grafici si possono osservare i dati di un test emolitico di un campione di siero di un paziente ahha contenente autoanticorpi contro i globuli rossi. La titolazione con il campione di siero produce una curva chiara e riproducibile con un inibitore del complemento adatto come l'anti C cinque.

Il segnale emolitico può essere titolato come dimostrato in questo grafico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attivazione del complemento da parte di anticorpi specifici per i globuli rossi, sia mediante analisi citofluorimetrica della deposizione di C3 o C 4 che mediante test emolitico quantitativo.