Un test battericida sierico per l'attività battericida mediata dal complemento degli anticorpi

Prelevare un campione di siero diluito in serie contenente anticorpi monoclonali contro i lipopolisaccaridi, o LPS, un componente della membrana esterna dei batteri gram-negativi.

Introdurre batteri gram-negativi. Gli anticorpi sierici si legano all'LPS batterico.

Aggiungi le proteine del complemento. Il complesso C1 si lega agli anticorpi legati all'LPS, formando un C1 enzimaticamente attivo.

Il C1 attivato scinde C4 e C2 per formare C3 convertasi, che scinde C3 per formare C5 convertasi. La convertasi scinde C5 per produrre C5b, che recluta C6 e C7. Il complesso risultante si inserisce nella membrana esterna e si associa con C8 e C9 multipli, formando un poro.

Il danno alla membrana esterna destabilizza la membrana interna, causando la lisi cellulare.

Posizionare il composto su una piastra di agar e stenderlo. Incubare per la crescita batterica. Rivestire la piastra con agar contenente cloruro di trifenile tetrazolio, o TTC, che viene ridotto dalle deidrogenasi microbiche, conferendo un colore rosso alle colonie batteriche.

Il numero di colonie aumenta con la diluizione del campione, indicando una ridotta attività battericida con una minore concentrazione di anticorpi.

Per iniziare, incubare i campioni in un bagno d'acqua calda a 56 gradi Celsius per 30 minuti per inattivare termicamente i campioni di prova. Procurarsi una piastra di analisi e 20 microlitri di tampone di analisi nelle colonne da 1 a 12 delle righe da A a G. Aggiungere 20 microlitri di tampone di analisi alle colonne 1 e 2 della riga H. Caricare 30 microlitri di ciascun campione di prova in duplicato nella riga H della piastra di analisi.

Per iniziare a eseguire diluizioni seriali triplicate dei campioni di prova, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere 10 microlitri dai pozzetti da 3H a 12H. Trasferire i campioni nei pozzetti corrispondenti nella riga G e pipettare su e giù da 8 a 10 volte per mescolare il pozzetto del campione. Quindi, rimuovere 10 microlitri da questi pozzetti, trasferirli nei pozzetti corrispondenti nella fila F e pipettare su e giù da 8 a 10 volte per mescolare. Continuare questo processo di diluizione seriale attraverso la riga A. Dopo aver mescolato i pozzetti nella fila A, rimuovere e scartare 10 microlitri dai pozzetti da 3A a 12A in modo che il volume finale in tutti i pozzetti sia di 20 microlitri.

Recuperare una fiala di brodo batterico bersaglio congelato e scongelarla a temperatura ambiente. Quindi, diluire i batteri in 20 ml di tampone di analisi in base al fattore di diluizione ottimale predeterminato. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 microlitri di batteri diluiti a ciascun pozzetto della piastra di analisi.

Recupera una fiala di complemento di coniglietto congelato e una fiala di BRC congelato inattivato termicamente. Utilizzare acqua corrente fredda per scongelare le fiale a temperatura ambiente. Quindi, miscelare 100 microlitri di BRC inattivato a caldo e riscaldato con 400 microlitri di tampone per saggi. Aggiungere 50 microlitri di questa soluzione BRC inattivata termicamente al 20% a tutti i pozzetti della colonna 1. Miscelare 1 millilitro di BRC nativo con 4 millilitri di tampone per saggi. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela al 20% a tutti i pozzetti nelle colonne da 2 a 12. Posizionare la piastra su un agitatore per piastre per 10-15 secondi per miscelare delicatamente la piastra di analisi.

Incubare la piastra del saggio in un incubatore microbiologico per due ore. Nel frattempo, rimuovere i coperchi da due piastre di agar LB e posizionare le piastre a faccia in su in una cabina di sicurezza biologica per 40-60 minuti ad asciugare. Al termine dell'incubazione, trasferire la piastra del saggio su ghiaccio umido e incubare per 10-20 minuti per arrestare la reazione. Utilizzando una pipetta a 12 canali, miscelare i pozzetti della fila H e individuare 10 microlitri della miscela di reazione sul fondo di una piastra LBA. Inclinare immediatamente la piastra e lasciare che le macchie scorrano per circa 1,5-2 centimetri.

Ripeti questa procedura per le righe G, F ed E, individuandole sopra la riga precedente. Incubare le piastre LBA a temperatura ambiente fino a quando la soluzione non viene assorbita nelle piastre LBA. Quindi, metti i coperchi sulle piastre e trasferiscile capovolte in un'incubatrice microbiologica per incubarle durante la notte.

Il giorno successivo, aggiungere 25 ml di agar overlay a 55 gradi Celsius contenente 100 microgrammi per millilitro TTC e 0,1% di sodio azide a ciascuna piastra LBA. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore per consentire ai batteri sopravvissuti di sviluppare un colore rosso. Quindi, usa una fotocamera digitale per fotografare le lastre. Trasferisci le immagini su un computer e utilizza il software di enumerazione delle colonie integrato del NIST per analizzare le immagini come indicato nel protocollo di testo.