Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e digerire le pareti cellulari batteriche per determinare le identità e le frazioni relative di diversi neuropeptidi. Utilizzando l'analisi UPLC, ciò si ottiene mediante prima lisi di campioni batterici mediante bollitura in ecol solfato di sodio. Dopo aver lavato via la SDS, il secondo passo consiste nel digerire i campioni con la pronasi E per purificare la membrana esterna dai batteri gram-negativi.

Successivamente, i campioni vengono digeriti con mease per solubilizzare il peptidoglicano in singoli neuropeptidi. Il passaggio finale consiste nel ridurre i neuropeptidi e regolare il pH al punto isoelettrico del neuropeptide. In definitiva, l'UPLC viene utilizzato per separare i neuropeptidi in base alle dimensioni e all'idrofobicità, facilitando la quantificazione di importanti caratteristiche della parete cellulare, come il grado di reticolazione e la lunghezza media del filamento di glicani.

Questo metodo può aiutare a rivelare le risposte a domande chiave nel campo della microbiologia, come le relazioni tra morfogenesi, architettura della parete cellulare, attivazione del sistema immunitario e patogenesi. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per purificare il peptidil glicano gram-negativo, può essere applicato anche ai batteri gram-positivi con l'aggiunta di alcuni enzimi e trattamenti chimici. Per far ricrescere le colture batteriche, diluire le colture notturne da uno a 100 in 250 millilitri di terreno fresco e crescere fino alla densità ottica desiderata a 600 nanometri, mentre le colture diluite crescono. Preparare un bagnomaria bollente su una piastra calda in un bicchiere da un litro.

Una volta che l'acqua bolle, aliquotare sei millilitri di sodio dyl solfato o SDS al 6% in tubi di polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere una piccola ancoretta a ciascun tubo e serrare saldamente i coperchi dei tubi. Mettere i tubi nel bagnomaria bollente e mescolare a 500 giri/min sulla piastra calda.

Raccogli le colture da 250 millilitri centrifugando a 5.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere i pellet in tre millilitri di terreno o in una soluzione salina tamponata con fosfato. Pipettare lentamente le sospensioni cellulari nelle provette da 50 millilitri con SDS bollente al 6% per pidocchiare le cellule mentre le provette sono immerse nel bagno di acqua bollente e richiudere i coperchi per serrare a mano.

Coprire il bagnomaria bollente e lasciare bollire le celle per tre ore, controllando periodicamente il livello dell'acqua e riempiendo nuovamente il bagnomaria quando necessario. Dopo tre ore, spegnere il fuoco sulla piastra calda e continuare a mescolare per una notte a 500 giri/min. Se la SDS è precipitata nelle provette da 50 millilitri durante la notte, impostare il bagnomaria a ebollizione per altre una o due ore.

Ecco come dovrebbe apparire una coltura normale dopo la lisi durante la notte. Nella SDS, si noti la trasparenza rispetto all'opacità correlata alle precipitazioni. Preparare il tampone prono e attivare il tampone prono a 60 gradi Celsius in un blocco di calore per almeno 30 minuti.

Utilizzare un'ultracentrifuga impostata a 400.000 volte G per centrifugare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente al fine di pellettare le grandi molecole di peptolo glicano o macro PG e quindi purificarle da altri componenti cellulari. Rimuovere con cura il surnatante e poi risospendere ogni pellet a temperatura ambiente. Il volume della sospensione di acqua ultrapura dipende dal volume delle provette per ultracentrifuga utilizzate.

Utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà, ma non superi il volume massimo dei tubi. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio fino a quando l'acqua non forma bolle durante la sospensione di Resus, indicando che la SDS è stata completamente rimossa a questo punto. Resus sospendere i campioni in 900 microlitri di tampone tris HCL e trasferirli in provette da due millilitri precedentemente forate nella parte superiore.

Utilizzando un piccolo ago, aggiungere 100 microlitri di pronasi E attivata a ciascun campione prima di incubare a 60 gradi Celsius per due ore. Ferma l'indigestione prona aggiungendo 200 microlitri di SDS al 6% a ciascun campione e fai bollire i campioni nel blocco termico a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Come prima, utilizzare un'ultracentrifuga impostata a 400, 000 volte G per centrifugare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare con acqua ultrapura a temperatura ambiente fino a quando la SDS non è completamente rimossa nell'ultima fase di lavaggio della centrifugazione, sospendere nuovamente i campioni in 200 microlitri di tampone fosfato di sodio da 50 millimolari.

Questo volume può essere regolato in base alla quantità di Pepto glicano nel campione e può dipendere dalla specie. Se il campione contiene più glicano pep, aumentare il volume della sospensione. Se il campione ha poco glicano peptidico.

Ridurre il volume della sospensione di resus a un minimo di 50 microlitri. Trasferire i campioni in provette da 1,5 millilitri e aggiungere un milligrammo per millilitro di mastice per ottenere una concentrazione finale di 40 microgrammi per millilitro. Incubare per sei-otto ore o durante la notte in un blocco termico a 37 gradi Celsius.

Per preparare i campioni per l'UPLC, accendere un blocco termico a 100 gradi Celsius. Far bollire i campioni senza SDS per cinque minuti per fermare i campioni della centrifuga di digestione mease per 10 minuti a 16.000 volte. G a temperatura ambiente.

I neuropeptidi sono ora nel surnatante. Trasferire il surnatante in tubi di vetro da 13 x 100 millimetri. Cercate di recuperare quanto più surnatante possibile, avvicinandovi molto al palato senza disturbarlo.

Regolare il pH aggiungendo 500 millimolare di borato di tampone al campione per ottenere una concentrazione finale di 100 millimolare di borato di tampone borato 8 è compatibile con l'agente riducente. Idruro di boro di sodio: aggiungere diversi grani di idruro di boro di sodio per ridurre ogni campione e lasciare che la reazione proceda per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, regolare i campioni a pH sei come misurato con carta indicatrice di pH con acido ortofosforico utilizzando incrementi di 20 microlitri, il campione dovrebbe bollire in risposta all'aggiunta di acido ortofosforico.

Il campione in genere smette di gorgogliare quando viene raggiunto un pH di sei. Quindi continuare a regolare i campioni a un pH compreso tra tre e quattro con acido ortofosforico utilizzando incrementi di due microlitri. Filtrare il campione attraverso una siringa da 0,22 micron.

Filtrare direttamente nel flaconcino A-U-P-L-C. Se un precipitato si è riformato nei campioni una volta trasferiti nelle fiale UPLC, riscaldare le fiale con diversi passaggi attraverso una fiamma. Posizionare la fiala UPLC nel campionatore automatico e iniettare 10 microlitri di ciascun campione sullo strumento A-U-P-L-C.

Dotato di una colonna UPLC a fase inversa C 18 e di un rivelatore di assorbanza impostato per il monitoraggio. I campioni da 202 a 208 nanometri vengono iniettati in sequenza. Impostare il flusso a 0,25 millilitri al minuto e utilizzare un gradiente lineare in 25 minuti per ottenere il 100% di solvente B ed E sequenziale di neuropeptidi entro 30 minuti.

Se la spettrometria di massa verrà utilizzata per caratterizzare i neuropeptidi dopo l'UPLC, raccogliere frazioni del picco di interesse in un collettore di frazioni, trasferire le frazioni in una provetta da 1,5 millilitri e quindi essiccare le frazioni utilizzando un evaporatore centrifugo, le frazioni devono essere desalinizzate prima dell'analisi MS. In questo tipico risultato UPLC. La rilevazione tramite assorbanza UV a 202-208 nanometri in funzione del tempo stabilisce un particolare tempo di ritenzione dei neuropeptidi.

Si osserva una chiara risoluzione tra la maggior parte delle specie di neuropeptidi e una forte potenza del segnale in tutto lo spettro, che consente l'analisi del grado di reticolazione, della lunghezza media del filamento di glicani e dell'identità dei neuropeptidi e delle loro concentrazioni. Di seguito è mostrato un esempio di cromatogramma che riflette la precipitazione C dei neuropeptidi. Non sono stati allusi picchi, con conseguente assenza di dati sulla composizione del PG.

L'assenza di picchi distinguibili dall'analisi UPLC può verificarsi a causa della super concentrazione del campione o della regolazione errata del pH ben al di sotto del punto isoelettrico dei neuropeptidi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, anche se frenetici e viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi come la spettrometria di massa possono essere utilizzati per identificare positivamente le specie di neuropeptidi in base alla massa dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la funzione biochimica degli enzimi chiave della parete cellulare e la modalità d'azione degli inibitori chimici in un'ampia varietà di specie e mutanti.