Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e digerire le pareti cellulari batteriche per determinare le identità e le frazioni relative di diversi neuropeptidi. Mediante analisi UPLC, ciò si ottiene innanzitutto lisando i campioni batterici mediante ebollizione in sodio ecol solfato. Dopo aver rimosso il SDS con lavaggi, il secondo passaggio consiste nel digerire i campioni con pronasi E per purificare via la membrana esterna dei batteri gram-negativi.

In seguito, i campioni vengono digeriti con la measi per solubilizzare il peptidoglicano in singoli neuropeptidi. L'ultimo passaggio consiste nella riduzione dei neuropeptidi e nell'aggiustamento del pH al punto isoelettrico dei neuropeptidi. Infine, la UPLC viene utilizzata per separare i neuropeptidi in base a dimensione e idrofobicità, facilitando la quantificazione di caratteristiche importanti della parete cellulare, come il grado di reticolazione e la lunghezza media dei filamenti di glicano.

Questo metodo può contribuire a svelare le risposte a domande fondamentali nel campo della microbiologia, come le relazioni tra morfogenesi, architettura della parete cellulare, attivazione del sistema immunitario e patogenesi. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per purificare il peptidoglicano di batteri gram-negativi, può essere applicato anche ai batteri gram-positivi aggiungendo alcuni enzimi e trattamenti chimici. Per coltivare nuovamente i batteri, diluire 1 a 100 colture da incubazione notturna in 250 millilitri di mezzo fresco e far crescere fino alla densità ottica desiderata a 600 nanometri. Mentre le colture diluite crescono, preparare un bagno di acqua bollente su un piastrino riscaldante utilizzando un becher da un litro.

Una volta che l'acqua ha raggiunto l'ebollizione, aliquotare sei millilitri di dodecilsolfato di sodio al 6% o SDS in provette polipropileniche da 50 millilitri. Aggiungere un piccolo agitatore magnetico in ogni provetta e chiudere saldamente i tappi delle provette con le dita. Posizionare le provette nel bagnomaria in ebollizione e agitare a 500 giri al minuto sulla piastra riscaldante.

Raccogliere le colture di 250 millilitri centrifugando a 5.000 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere i pellet in tre millilitri di terreno o in soluzione salina fosfato 1x. Pipettare lentamente le sospensioni cellulari nei tubi da 50 millilitri contenenti SDS al 6% in ebollizione per lisare le cellule mentre i tubi sono immersi nel bagnomaria bollente e richiudere i tappi con una chiusura manuale leggera.

Coprire il bagnomaria in ebollizione e far bollire le cellule per tre ore, controllando periodicamente il livello dell'acqua e riempiendo il bagnomaria quando necessario. Dopo tre ore, spegnere il riscaldamento della piastra e continuare a mescolare tutta la notte a 500 giri al minuto. Se l'SDS si è precipitato nei tubi da 50 millilitri durante la notte, impostare il bagnomaria in ebollizione per un'ulteriore una o due ore.

Qui viene mostrato come dovrebbe apparire una coltura normale dopo la lisi notturna. In SDS, osservare la trasparenza rispetto all'opacità, che corrisponde alla precipitazione. Preparare il tampone prone E e attivare la prone E a 60 gradi Celsius in un blocco termico per almeno 30 minuti.

Utilizzare un ultracentrifugo impostato a 400.000 ×g per centrifugare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente, al fine di formare un pellet dei grandi peptidoglicani o molecole macro di PG e purificarli così da altri componenti cellulari. Rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi risospendere ciascun pellet in acqua ultrapura a temperatura ambiente. Il volume di risospensione dipende dal volume delle provette utilizzate per l'ultracentrifugazione.

Utilizzare un volume che riempia le provette almeno per metà, ma che non superi il volume massimo delle provette. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio fino a quando l'acqua non forma bolle durante la sospensione in Resus, indicando che in questo momento l'SDS è stato completamente rimosso. Sospendere i campioni in 900 microlitri di tampone tris HCL e trasferirli in provette da due millilitri precedentemente forate nei tappi.

Utilizzando un ago piccolo, aggiungere 100 microlitri di pronasi E attivata a ciascun campione prima di incubare a 60 gradi Celsius per due ore. Arrestare la digestione proteolitica aggiungendo 200 microlitri di SDS al 6% a ciascun campione e far bollire i campioni nel blocco termico a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Come in precedenza, utilizzare un ultracentrifugo impostato a 400.000 ×g per centrifugare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente e lavarli con acqua ultrapura a temperatura ambiente fino alla completa rimozione dell'SDS nell'ultima fase di lavaggio con centrifugazione; quindi risospendere i campioni in 200 microlitri di tampone fosfato di sodio 50 millimolare.

Questo volume può essere regolato in base alla quantità di peptidoglicano nel campione e potrebbe dipendere dalla specie. Se il campione contiene più peptidoglicano, aumentare il volume della sospensione. Se il campione contiene poco peptidoglicano.

Ridurre il volume della sospensione di risospensione a un minimo di 50 microlitri. Trasferire i campioni in provette da 1,5 millilitro e aggiungere mease ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro per ottenere una concentrazione finale di 40 microgrammi per millilitro. Incubare per sei-otto ore oppure tutta la notte in un blocco termico a 37 gradi Celsius.

Per preparare i campioni per la UPLC, accendere un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius. Far bollire i campioni senza SDS per cinque minuti per arrestare la digestione enzimatica, quindi centrifugare i campioni per 10 minuti a 16.000 ×g a temperatura ambiente.

I neuropeptidi si trovano ora nel soprannatante. Trasferire il soprannatante in provette di vetro da 13 per 100 millimetri. Cercare di recuperare la maggior quantità possibile di soprannatante, avvicinandosi il più possibile al palato senza disturbarlo.

Regolare il pH aggiungendo tampone borato 500 millimolare al campione per ottenere una concentrazione finale di 100 millimolare di tampone borato; il tampone borato è compatibile con l'agente riducente. Boroidruro di sodio: aggiungere alcuni cristalli di boroidruro di sodio per ridurre ciascun campione e lasciare procedere la reazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, regolare i campioni a pH 6, misurato con carta indicatrice del pH, aggiungendo acido ortofosforico a incrementi di 20 microlitri; il campione dovrebbe effervescere in risposta all'aggiunta di acido ortofosforico.

Il campione smette tipicamente di effervescente quando è stato raggiunto un pH di sei. Proseguire quindi regolando i campioni a un valore compreso tra pH tre e quattro con acido ortofosforico, utilizzando incrementi di due microlitri. Filtrare il campione attraverso una siringa da 0,22 micron.

Filtrare direttamente nel vial A-U-P-L-C. Se nei campioni si è riformato un precipitato dopo il trasferimento nei vial UPLC, riscaldare i vial con diverse passate attraverso una fiamma. Posizionare il vial UPLC nel campionatore automatico e iniettare 10 microlitri di ciascun campione nell'apparecchio A-U-P-L-C.

Dotato di una colonna UPLC a fase inversa C 18 e di un rivelatore di assorbanza impostato per il monitoraggio da 202 a 208 nanometri, i campioni vengono iniettati in sequenza. Impostare il flusso a 0,25 millilitri al minuto e utilizzare un gradiente lineare per 25 minuti per raggiungere il 100% di solvente B e l'eluzione sequenziale dei neuropeptidi entro 30 minuti.

Se la spettrometria di massa verrà utilizzata per caratterizzare i neuropeptidi dopo la UPLC, raccogliere le frazioni del picco di interesse in un collettore di frazioni, trasferire le frazioni in una provetta da 1,5 millilitri e quindi essiccare le frazioni utilizzando un evaporatore centrifugo; le frazioni devono essere desalate prima dell'analisi mediante spettrometria di massa. In questo risultato tipico di UPLC, il rilevamento tramite assorbanza UV a 202-208 nanometri in funzione del tempo stabilisce il tempo di ritenzione di un particolare neuropeptide.

Si osserva una chiara risoluzione tra la maggior parte delle specie di neuropeptidi e un'elevata intensità del segnale lungo tutto lo spettro, il che consente l'analisi del grado di reticolazione, della lunghezza media dei filamenti di glicano e dell'identità dei neuropeptidi e delle loro concentrazioni. Qui viene mostrato un esempio di cromatogramma che riflette la precipitazione di C dei neuropeptidi. Nessun picco osservato ha portato all'assenza di dati sulla composizione del PG.

L'assenza di picchi distinguibili dall'analisi UPLC può verificarsi a causa di una concentrazione eccessiva del campione o di un'impostazione errata del pH ben al di sotto del punto isoelettrico dei neuropeptidi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, sebbene intensi, se svolta correttamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come la spettrometria di massa, possono essere utilizzati per identificare in modo positivo le specie di neuropeptidi in base alla massa dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la funzione biochimica di enzimi chiave della parete cellulare e il meccanismo d'azione di inibitori chimici in una vasta gamma di specie e mutanti.