Name: Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per lanalisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Impara l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositiva mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Questo metodo consente di quantificare le caratteristiche del peptidoglicano.

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Questo lavoro è stato supportato dal New Innovator Award DP2OD006466 (a K.C.H.). Gli autori ringraziano Russell Monds per una dimostrazione pratica del metodo e per le discussioni scientifiche.

1. Coltivare colture batteriche in 2,5 ml di media durante la notte
Diluire le colture 1:100 in 250 ml di mezzi freschi e crescere fino a600 OD di 0,7-0,8. Preparare una soluzione di dodecil solfato di sodio al 6% (SDS) in acqua.
ATTENZIONE: la polvere SDS è pericolosa - evitare di inalare polvere di SDS; indossare una maschera sul naso e sulla bocca.
2. Giorno 1 - Le colture batteriche di lysing vengono eseguite nel corso di un giorno e durante la notte
<ol><li>Mentre le colture diluite crescono, impostare un bagno d'acqua bollente su una piastra calda in un becher da 1 L. Una volta che l'acqua è bollente, aliquota 6 ml di SDS 6% in tubi in polipropilene da 50 ml, aggiungere una piccola barra di agitazione a ciascun tubo, fissare i coperchi del tubo a tenuta di dita, posizionare i tubi nel bagnomaria e accendere mescolando a 500 giri/min sulla piastra calda.</li>
	<li>Raccogliere le colture da 250 ml a 5.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e rimossare pellet in 3 ml di mezzi o 1 soluzione salina tamponata con fosfato. Le sospensioni a celle a pipetta lenta si trasformano in tubi da 50 ml con SDS bollente al 6% per liscire le cellule (concentrazione finale 4% SDS) mentre i tubi sono immersi nel bagno d'acqua bollente e richiudere i coperchi a tenuta di dita. Le sospensioni cellulari devono essere trasferite rapidamente in SDS bollente una volta rimontesi. Dovrebbero essere evitati bruschi cambiamenti ambientali, in quanto ciò potrebbe causare un'alterazione errata della struttura della parete cellulare.
</li>
	<li>Coprire il bagno d'acqua bollente e lasciare bollire le cellule per 3 ore, controllando periodicamente il livello dell'acqua e riempiendo il bagnomaria quando necessario. Dopo 3 ore, spegnere l'elemento riscaldante della piastra calda e continuare a mescolare durante la notte a 500 giri/min.</li>
</ol>3. Giorno 2 - Le digestione enzimatica vengono eseguite nel corso di un giorno
<ol><li>Se sds è precipitato nei tubi da 50 ml durante la notte, impostare il bagnomaria a bollire per ulteriori 1-2 ore. Accendere un blocco termico a 60 °C. Preparare uno stock di 1 mg/ml di Pronasi E in Tris-HCl da 10 mM (pH 7,2) + 0,06% con NaCl e attivare la Pronasi E a 60 °C per almeno 30 min.</li>
	<li>Utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente al fine di pellettizzare i grandi polimeri PG e quindi purificarli da altri componenti cellulari. Rimuovere con cura il supernatante, quindi rimescolare ogni pellet in acqua ultrapura a temperatura ambiente. NOTA: Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi. Ripetere la centrifugazione/lavaggio fino a quando l'acqua non forma bolle durante la resuspensione, indicando che l'SDS è stato completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Interrompere il lavaggio del pellet se si forma un precipitato bianco, in quanto ciò indica che i sacculi si stanno raggruppando insieme. Il raggruppamento non è catastrofico, ma i grumi si legano molto fortemente alla plastica e alla vetreria causando una grande perdita di campioni. In questo caso, procedere con il protocollo utilizzando il campione di sacculi raggruppato.</li>
	<li>Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, rimescolare i campioni in 900 μl di 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% con NaCl e trasferire a 2 ml tubi precedentemente infilati con fori nelle cime con un piccolo ago. Aggiungere 100 μl di 1 mg/ml di Pronasi E attivata (concentrazione finale di 100 μg/ml) a ciascun campione e incubare a 60 °C per 2 ore. Impostare un blocco di calore diverso su 100 °C.</li>
	<li>Interrompere la digestione della Pronasi E aggiungendo 200 μl di 6% di SDS a ciascun campione e far bollire i campioni nel blocco termico di 100 °C per 30 minuti. Impostare un blocco termico diverso a 37 °C e fare uno stock di muramidasi (mutanolisina) da 1 mg/ml in tampone fosfato da 50 mM (pH 4.9).</li>
	<li>Come nel passaggio 3.2, utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare con acqua ultrapura a temperatura ambiente fino a quando L'SDS non viene completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi.</li>
	<li>Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, resuspend campioni in 200 μl di tampone di fosfato di sodio da 50 mM (pH 4.9). Questo volume può essere regolato in base alla quantità di peptidoglycan nel campione e può essere dipendente dalle specie. Se in precedenza sono pubblicati rapporti di analisi HPLC per le specie di interesse, questo volume può essere stimato sulla base di queste quantificazioni (una compilazione di studi HPLC PG può essere trovata nelle informazioni supplementari di riferimento7). Per altre specie, la preparazione sacculus può essere eseguita fino a questo passaggio e quindi è possibile aggiungere diverse quantità di volumi di resuspensione per replicare i campioni al fine di determinare il volume minimo che consente al PG di rimanere in soluzione (vedi Discussione per ulteriori stime). Se il campione contiene più peptidoglycan, aumentare il volume di resuspensione; se il campione ha poco peptidoglycan, ridurre il volume di resuspensione ad un minimo di 50 μl.</li>
	<li>Trasferire campioni in tubi da 1,5 ml e aggiungere 1 mg/ml di muramidasi per ottenere una concentrazione finale di 40 μg/ml. Incubare 6-8 ore o durante la notte a 37 °C.</li>
</ol>4. Giorno 3 - La preparazione dei campioni per UPLC viene eseguita l'ultimo giorno
<ol><li>Accendere un blocco termico a 100 °C. Far bollire i campioni senza SDS per 5 minuti per fermare la digestione della muramisasi. Centrifugare i campioni per 10 min a 16.000 × g a temperatura ambiente, quindi trasferire il supernatante (i muropeptidi sono ora solubili) a tubi di vetro da 13 mm x 100 mm. Cerca di recuperare il più supernatante possibile, avvicinandoti molto al pellet senza disturbarlo.</li>
	<li>Regolare il pH aggiungendo 500 mM di tampone di borato (pH 9) al campione per una concentrazione finale di tampone di borato da 100 mM. Il tampone di borato è compatibile con l'agente riducente boroidro di sodio. Aggiungere 1-2 granelli di boroidro di sodio per ridurre ogni campione e lasciare che la reazione proceda per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il boroidro di sodio è altamente reattivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza).</li>
	<li>Regolare i campioni in pH 3-4 (il punto isoelettrico muropeptide è ~3,5) con acido ortofosforico 50% v/v utilizzando incrementi di 20 μl fino a pH 6, come misurato con carta indicatore di pH, quindi utilizzando incrementi di 2 μl. ATTENZIONE: L'acido ortofosforico è corrosivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza). Il campione deve bollicine in risposta all'aggiunta di acido ortofosforico; quando il campione smette di gorgogliare, questo indica in genere che è stato raggiunto un pH di 6. Se nel campione non si verifica alcun gorgogliamento, ciò può indicare che la quantità di boroidro di sodio aggiunta era troppo piccola. In questo caso, interrompere l'abbassamento del pH, aggiungere con cura uno o due granelli di boroidro di sodio, lasciare reagire per 5-10 minuti, quindi riprendere la regolazione del pH.</li>
	<li>Filtrare il campione attraverso un filtro siringa da 0,22 μm direttamente in un flaconcino UPLC. Se si è formato un precipitato, riscaldare il tubo con più passaggi attraverso una fiamma prima di filtrare. Se il campione non verrà iniettato nello strumento UPLC entro il giorno, congelare a -20 °C durante la notte. I campioni possono essere conservati fino a un anno a -80 °C. Il campione può essere scongelato passando attraverso una fiamma più volte.</li>
	<li>Iniettare 10 μl di ogni campione su uno strumento UPLC dotato di una colonna in fase invertita C18 da 1,7 μm e di un rilevatore di assorbanza impostato per monitorare 202-208 nm. Gli esempi vengono inseriti in sequenza, ma le funzionalità di campionamento automatico consentono di elaborare fino a 96 campioni in batch. Utilizzare 50 mM di fosfato di sodio (pH 4,35) + 0,4% v/v azide di sodio per il solvente A e 75 mM fosfato di sodio (pH 4,95) + 15% v/v metanolo per solvente B. NOTA: L'azide di sodio viene aggiunto per compensare l'assorbimento di metanolo di 205 nm per evitare la deriva di base. Impostare il flusso su 0,25 ml/min e utilizzare un gradiente lineare superiore a 25 min per ottenere il 100% di solvente B e l'eluizione sequenziale dei muropeptidi entro 30 min. Se la spettrometria di massa verrà utilizzata per caratterizzare i muropeptidi dopo UPLC, raccogliere frazioni del picco di interesse in un raccoglitore di frazioni e asciugare le frazioni utilizzando un evaporatore centrifugo.</li>
</ol>

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</ol>

I costi di produzione per questo articolo sono stati sponsorizzati da Waters Corporation.

Un passaggio critico di questa procedura è il passaggio 3.1 del secondo giorno di preparazione del campione. Se l'SDS è precipitato durante la notte o se i campioni sono stati conservati in SDS al 4% per diverse settimane a temperatura ambiente, i campioni devono essere riboiled per almeno 1 ora per riassolvere l'SDS. Una causa comune per la precipitazione dell'SDS è l'uso di mezzi con sali di potassio, quindi il potassio dovrebbe essere evitato nei mezzi se possibile. Come accennato nella sezione Risultati rappresentati...

L'obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di isolare le pareti cellulari batteriche intatte (sacculi) e di digerire il peptidoglycan (PG) in modo tale che la cromatografia liquida ultra-performance (UPLC) possa essere utilizzata per fornire informazioni come l'identità dei componenti muropeptidi e le loro concentrazioni, la lunghezza media dei filamenti di glicano e la frazione di materiale coinvolto nei collegamenti incrociati tra i trefoli. Per una discussione dettagliata della biochimica PG e delle specie di muropeptidi, ci sono diverse eccellenti recensioni che descrivono la struttura PG e il suo ruolo in infezione, resistenza, morfogenesi e crescita1-6. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per l'analisi PG è stata inizialmente sviluppata da Glauner e Schwarz negli anni '80, e più recentemente è stata migliorata e applicata ampiamente nei laboratori di Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. I metodi precedenti utilizzavano l'analisi degli amminoacidi o la cromatografia su carta, tecniche dispendiose in termini di tempo e noiose che non producono valutazioni accurate o complete dei componenti della parete cellulare.
L'analisi UPLC può essere facilmente implementata in qualsiasi laboratorio di ricerca di base che abbia accesso a un ultracentrifugo e UPLC. Il metodo UPLC che presentiamo di seguito isola i sacculi completi, fornendo così informazioni complete e quantitative su tutte le specie chimiche in esso contenute. Questo metodo produce una quantificazione precisa di tutti i muropeptidi in una popolazione di batteri, il tutto entro una corsa UPLC di 20 minuti. L'implementazione di questo metodo comporta solo competenze di laboratorio di base, senza significativi investimenti finanziari nei materiali. Per eseguire i passaggi di questo metodo, i ricercatori devono solo essere esperti nella pipettazione, nella preparazione di tamponi ed enzimi e nella regolazione del pH, rendendolo accessibile a una vasta gamma di discipline scientifiche. La scelta degli enzimi utilizzati in questo protocollo dipende dalle specie di batterio analizzate; il protocollo qui descritto è utile per Escherichia coli, ed è stato generalmente trovato adeguato per isolare i sacculi da altri organismi Gram-negativi. La consultazione con la letteratura è raccomandata quando si applica questo metodo ai batteri Gram-positivi; in queste specie, la purificazione del sacculo è stata tradizionalmente più difficile. In particolare, questo metodo potrebbe essere necessario alterare in termini di scelta enzimatica e lunghezza dei tempi di digestione per adattarsi alle pareti più spesse e ai polimeri accessori come gli acidi teichoici dei batteri Gram-positivi. Il primo enzima in questo protocollo scide la lipoproteina della membrana esterna (come la lipoproteina di Braun, o Lpp) attacca al peptidogicano, rilasciando così tutto tranne il peptide C-terminale di- (o tri-) del Lpp dalla parete cellulare. Questo passaggio è necessario quando si esaminano enterobatteri, ma molti altri batteri Gram-negativi non hanno equivalenti Lpp, e quindi questo passaggio può essere saltato. Un secondo enzima si stacca specificamente dopo il componente dell'acido muramico del peptidoglycan, solubilizzando la subunità disaccaride che forma la specie muropeptide. Per fornire una valutazione accurata dell'architettura del PG, è necessario prestare attenzione a digerire i sacculi per evitare la scissione delle passerelle o di qualsiasi altra parte del gambo peptidico.
Sebbene le composizioni chimiche di peptidoglycan di oltre 100 ceppi di ~40 specie batteriche siano state analizzate dall'HPLC, non sono state eseguite analisi con la tecnologia UPLC. Inoltre, il lavoro precedente ha caratterizzato il peptidoglycan solo da una piccola frazione del dominio batterico, in parte limitato dalla produttività dell'HPLC. Pertanto, la diffusione di questo metodo al maggior numero possibile di ricercatori e l'implementazione su piattaforme UPLC saranno fondamentali per guidare studi fisiologici della grande frazione di specie batteriche il cui peptidoglycan deve ancora essere classificato.

<table><tbody><tr><td>Pronasi E</td><td>Amresco</td><td>E629</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina da Streptomyces</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio (NaBH4)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Il boroidruro di sodio è altamente reattivo e pericoloso da maneggiare</td></tr><tr><td>Acido ortofosforico.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79607</td><td>L'acido ortofosforico è corrosivo e pericoloso da maneggiare Acido</td></tr><tr><td>borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31146</td><td></td></tr><tr><td>Aziduro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>L'azoturo di sodio è un veleno</td></tr><tr><td>Tetraborato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Millex 0,22 &mu; m filtri per siringhe</td><td>Fisher</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>strisce di pH (intervallo pH 0-6)</td><td>Fisher</td><td>M95863</td><td></td></tr><tr><td>50 ml di polipropilene Provette Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>13 mm x 100 mm provette di vetro</td><td>Kimble Chase</td><td>60CM13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 32 mm fiala di recupero in vetro con collo a vite</td><td>Waters</td><td>186000327C</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Ambion</td><td>La polvere AM9820</td><td>SDS è pericolosa</td></tr><tr><td>Strumentazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acque Acquity UPLC Sistema di classe H, tra cui:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC H-Class Quaternario Solvent Manager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 e micro; m colonna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC PDA Detector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Fraction Collector III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 30 cm Riscaldatore / Raffreddatore</td><td></td><td></td><td></td> a colonna</tr></tbody></table>

isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

La parete cellulare batterica è fondamentale per la determinazione della forma cellulare durante la crescita e la divisione e mantiene l'integrità meccanica delle cellule di fronte alle pressioni del turgore diverse atmosfere di grandezza. Attraverso le diverse forme e dimensioni del regno batterico, la parete cellulare è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da brevi peptidi. L'importanza centrale del peptidoglicano per la fisiologia batterica è alla base del suo uso come bersaglio antibiotico e ha motivato studi genetici, strutturali e biologici cellulari su come viene assemblato solidamente durante la crescita e la divisione. Tuttavia, sono ancora necessarie indagini approfondite per caratterizzare pienamente le principali attività enzimatiche nella sintesi del peptidoglycan e nella composizione chimica delle pareti cellulari batteriche. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un potente metodo analitico per quantificare le differenze nella composizione chimica delle pareti dei batteri coltivati in una varietà di condizioni ambientali e genetiche, ma la sua produttività è spesso limitata. Qui, presentiamo una procedura semplice per l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per analisi biologiche del peptidoglycan tramite HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), un'estensione di HPLC che utilizza pompe per fornire pressioni ultra-elevate fino a 15.000 psi, rispetto ai 6.000 psi per HPLC. In combinazione con la preparazione delle pareti cellulari batteriche qui presentate, gli iniettori di campioni a basso volume, i rivelatori con alti tassi di campionamento, volumi di campioni più piccoli e tempi di esecuzione più brevi di UPLC consentiranno un'alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan e della biologia delle cellule batteriche fondamentali nella maggior parte dei laboratori biologici con accesso a un ultracentrifugo e UPLC.

Utilizzando la procedura descritta nella figura 1, il campione finale deve essere costituito da almeno 200 μl di soluzione chiara che è stata filtrata direttamente in un flaconcino UPLC (passaggio 4.4). La separazione UPLC dei vari muropeptidi in un campione batterico si basa sulla loro relativa solubilità tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria della colonna. Le colonne C18 in fase inversa forniscono una matrice fortemente idrofobica per separare le specie di muropeptidi in base all'idrofobicit...

La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e digerire le pareti cellulari batteriche per determinare le identità e le frazioni relative di diversi neuropeptidi. Mediante analisi UPLC, ciò si ottiene innanzitutto lisando i campioni batterici mediante ebollizione in sodio ecol solfato. Dopo aver rimosso il SDS con lavaggi, il secondo passaggio consiste nel digerire i campioni con pronasi E per purificare via la membrana esterna dei batteri gram-negativi.In seguito, i campioni vengono digeriti con la measi per solubilizzare il peptidoglicano in singoli neuropeptidi. L'ultimo passaggio consiste nella riduzione dei neuropeptidi e nell'aggiustamento del pH al punto isoelettrico dei neuropeptidi. Infine, la UPLC viene utilizzata per separare i neuropeptidi in base a dimensione e idrofobicità, facilitando la quantificazione di caratteristiche importanti della parete cellulare, come il grado di reticolazione e la lunghezza media dei filamenti di glicano.Questo metodo può contribuire a svelare le risposte a domande fondamentali nel campo della microbiologia, come le relazioni tra morfogenesi, architettura della parete cellulare, attivazione del sistema immunitario e patogenesi. Sebbe

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Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione della lignina polifenoliche.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione di carboidrati muro derivate.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

Un modo rapido per guadagnare è descritto lo studio della struttura di polisaccaridi in una matrice extracellulare. Il metodo sfrutta la specificità del glycosylhydrolases e la sensibilità della spettrometria di massa permette piccole quantità di materiale da analizzare. Questa tecnica è adattabile per essere utilizzato direttamente sul tessuto stesso.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.

Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

Questo video dimostra la separazione degli acidi micolici basata sulla cromatografia su strato sottile. Questa tecnica separa i diversi acidi micolici, lipidi a catena lunga presenti nella parete cellulare dei micobatteri, in base alla loro polarità.

Separazione basata sulla cromatografia su strato sottile di varianti di acido micolico: un metodo per separare i lipidi della parete cellulare micobatterica in base alla polarità

Isolamento e caratterizzazione del lipide Un dominio di lipopolisaccaride (LPS) da batteri gram-negativi fornisce comprensione dei meccanismi cellulari di superficie a base di antibiotico-resistenza, la sopravvivenza dei batteri e fitness, e come chimicamente lipidi varia Una specie molecolari differenziale modulano la risposta immunitaria innata.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Questo metodo fornisce un quadro per studiare l'incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell'acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.

Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.

Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

Questo protocollo separa le proteine insolubili della parete cellulare e della membrana in frazioni semplici (1-5 proteine) utilizzando la focalizzazione isoelettrica preparativa (IEF) basata sul punto isoelettrico, seguita dalla separazione per peso molecolare. Le frazioni risultanti possono essere utilizzate direttamente per analisi immunologiche e proteomiche senza ulteriore purificazione.

Separazione e frazionamento delle proteine della parete cellulare e della membrana cellulare da Mycobacterium tuberculosis per l'analisi delle proteine a valle

Impara l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositiva mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Questo metodo consente di quantificare le caratteristiche del peptidoglicano.

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per lanalisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (Video) | JoVE Journal

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

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