Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Questa tecnologia microfluidica mira a misurare la funzionalità dei neutrofili umani direttamente da una goccia di sangue su una piattaforma che può essere multiplexata. La camera di carico centrale funge da fonte di sangue intero e funge anche da lavandino per i gradienti chemio-attrattivi che si formano dalle 16 camere chemiotattiche focali. L'esclusiva filtrazione meccanica dei globuli rossi consente di sondare la funzione dei neutrofili nel contesto naturale del sangue, dei componenti cellulari e biochimici.

La biforcazione tra un canale che porta alla camera chemiotattica focale e un canale che esce dal dispositivo consente la quantificazione e la modulazione della direzionalità dei neutrofili in migrazione. Pertanto, i risultati possono dimostrare come i neutrofili in migrazione attiva migrino facilmente oltre i globuli rossi intrappolati e si accumulino in numero nel tempo. Una caratteristica unica dei nostri dispositivi microfluidici è che sono molto facili da produrre e configurare.

Sono costituiti da uno strato di PDMS colato su un wafer microfabbricato che leghiamo su una piastra con fondo di vetro, a pozzetto singolo o multiplo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede solo una gocciolina di sangue intero. I dispositivi possono essere utilizzati con pipette standard, non hanno parti mobili, non richiedono tubi o pompe a siringa esterne.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle applicazioni cliniche rispetto alle nostre richieste con le tecniche tradizionali. Il nostro approccio richiede pochi minuti dal momento della raccolta del sangue ai saggi di migrazione dei neutrofili. I nuovi pettini filtranti per i globuli rossi impediscono ai globuli rossi di bloccare la migrazione attiva dei neutrofili e distinguono questo metodo da altri metodi microfluidici.

Ciò richiede la rimozione del sangue prima dell'esecuzione dei test chemioterapici. L'inceppamento meccanico dei globuli rossi e dei canali contraddistingue la nostra tecnologia e consente l'analisi dei neutrofili nel nostro ambiente fisiologico del sangue intero, compresi il siero e le piastrine. Quindi la tecnologia è precisa e facile da usare e può far progredire in modo significativo la nostra comprensione del ruolo dei neutrofili e del sistema immunitario innato C nella salute e nella malattia.

Fabbricare il wafer dello stampo master per definire i canali di migrazione secondo le istruzioni del produttore First pattern. Il primo strato di fotoresist negativo a base epossidica da tre micron modella quindi il secondo strato da 50 micron per definire il carico cellulare e le camere delle chemochine. Ora ai dispositivi in polimetilsoano fusi mescolare energicamente 20 grammi di PDMS con due grammi di iniziatore per cinque minuti.

Versare con cura il PDMS sul wafer modellato e Degasare in un essiccare sottovuoto per un'ora. Quindi cuocere e polimerizzare i dispositivi microfluidici PDMS in un forno a 65 gradi Celsius per almeno tre ore. Per garantire che il PDMS sia cotto alla temperatura corretta, assicurarsi di monitorare la temperatura interna del forno con un termometro.

Perforare le camere centrali di carico del sangue intero di 1,5 millimetri di diametro. Perfora anche dispositivi a forma di ciambella intera di 5,0 millimetri di diametro. Rimuovere le particelle dai dispositivi a ciambella utilizzando del nastro adesivo.

Successivamente, sciacquare una piastra multipozzetto con acqua deionizzata e asciugarla con azoto dopo aver posizionato la piastra in un forno a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Trattare con plasma di ossigeno per 35 secondi. Quindi aggiungere i dispositivi a ciambella e il plasma di ossigeno.

Trattare di nuovo per altri 35 secondi. Trasferire con cura i dispositivi nei pozzetti della piastra e cuocere con i dispositivi incollati su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo il trattamento con plasma di ossigeno, il dispositivo è idrofilo e gli effetti capillari possono promuovere l'adescamento dei piccoli canali nel dispositivo.

Per la soluzione chemio-attrattiva, mescolare cinque microlitri di FMLP 10 micromolari con cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di fibronectina e 490 microlitri di HBSS. Pipettare lentamente la soluzione chemio-attrattiva nella pipetta della camera di carico del sangue intero e altri 20 microlitri di chemio-attrattivo intorno all'esterno del dispositivo. Mettere il piatto in un essiccante per 15 minuti.

Applicare un vuoto al dispositivo per adescare il dispositivo con una soluzione chemioattrattiva. Rimuovere la piastra dall'essiccante e confermare la bagnatura del canale del dispositivo diminuendo gradualmente le dimensioni della bolla d'aria. Quindi lavare accuratamente l'intera camera di carico del sangue e l'esterno del dispositivo per rimuovere la soluzione chemio-attrattiva in eccesso.

Successivamente per generare un gradiente di chemioattrattivo da ciascuna delle camere chemiotattiche focali al centro del dispositivo. Iniettare delicatamente 100 microlitri di PBS nel foro in modo che si formi una gocciolina di PBS sulla parte superiore del dispositivo. Inclinare la piastra e pipettare un millilitro di PBS attorno al dispositivo per raccogliere sul fondo del pozzetto, aspirare il liquido e ripetere il lavaggio PBS tre volte.

Quindi, riempire ogni pozzetto con il terreno per immergere i dispositivi e attendere 15 minuti affinché il gradiente si stabilizzi. Quindi pipettare lentamente due microlitri di sangue intero in ciascuna camera di carico del sangue intero. Per la raccolta del sangue con puntura del dito, lavarsi le mani con acqua e sapone.

Asciugare la pelle come soluzione anticoagulante per macchie. Aggiungere un millilitro di HSA allo 0,2% e 10 microlitri di uncini micromolari da 32,4. Tamponare una provetta per la raccolta del sangue con eparina, pungere il dito del donatore sano e asciugare la prima goccia di sangue.

Raccogliere 50 microlitri di sangue nella soluzione di colorante anticoagulante e mescolare delicatamente. Impostate la biocamera a 37 gradi Celsius, 80% di umidità e 5% di CO2. Avviate immediatamente l'imaging time-lapse a un ingrandimento di 10 x o superiore per un'analisi statistica significativa e tracciate manualmente almeno 50 neutrofili in ciascun campione.

Contare le cellule che entrano nelle camere di chemiotassi focali nel tempo. Quindi, utilizzando l'immagine J, calcolare le velocità dei neutrofili nel canale tra il WBLC e l'FCC. Quindi, per quantificare la direzionalità dei neutrofili, contare il numero di cellule che passano la biforcazione e calcolare il rapporto tra il numero di cellule che si rivolgono verso le camere di chemiotassi focali e le cellule che escono dal dispositivo.

Le cellule che non sono direzionali non seguono il gradiente chemiotattico e quindi migrano in numero uguale verso l'FCC e il canale di uscita. In questo esperimento, il test di chemiotassi dei neutrofili del sangue intero è stato convalidato misurando l'accumulo di neutrofili verso un gradiente FMLP. I risultati confermano che i globuli rossi sono intrappolati dal pettine di filtrazione, mentre i neutrofili sono in grado di migrare attivamente fuori dal sangue intero.

Il gradiente chemio-attrattivo lineare stabile formato dal dispositivo microfluidico del sangue intero è stato confermato utilizzando destrano marcato con FSE e i livelli di fluorescenza sono stati misurati nel tempo. I risultati ottenuti utilizzando la nuova piattaforma WB Chemotaxis rivelano che i neutrofili provenienti da tutte le fonti di sangue migrano con velocità costante e con cellule migratorie totali simili. È importante sottolineare che questo sistema consente la quantificazione dei neutrofili, quindi differenzia la chemiotassi dalla chemio Kinesis Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 10 minuti se eseguita correttamente.

L'incorporazione del nostro dispositivo in una piastra a 12 o 24 pozzetti utilizzando tecniche standard di camera bianca, strutture, screening di più condizioni contemporaneamente. Utilizzando questa tecnica, siamo in grado di misurare la velocità e la direzionalità dei neutrofili a livello di singola cellula. A differenza dei metodi tradizionali che misurano la migrazione di massa delle celle endpoint, ricordarsi di adescare attentamente il dispositivo microfluidico e di caricare lentamente entrambi i campioni in modo che i globuli rossi non vengano spinti oltre la com del dispositivo.

Il protocollo descritto è particolarmente utile per misurare le carenze chemiotattiche transitorie dei neutrofili, consentendo campionamenti ripetuti su più punti temporali, ma potrebbe anche essere adattato per misurare la migrazione di altri tipi di cellule da diversi organismi modello. Questo metodo può fornire informazioni sulle alterazioni temporanee della funzionalità dei neutrofili in pazienti con varie condizioni associate a una maggiore incidenza di infezioni, inclusi pazienti traumatizzati, pazienti dopo interventi chirurgici importanti e pazienti oncologici sottoposti a chemioterapia.