Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine ​​per Nerve Tissue Regeneration

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di progettare, esprimere e isolare con successo proteine biotinilate ricombinanti che possono essere incorporate in una varietà di applicazioni come sonde, sensori, somministrazione di farmaci e ingegneria tissutale. Ciò si ottiene trasformando prima il plasmide progettato su misura in una linea cellulare ospite batterica utilizzando colture su piccola scala e quindi inducendo l'espressione della proteina bersaglio. Successivamente, viene determinata la presenza e la solubilità della proteina bersaglio al fine di formulare adeguate procedure di purificazione.

Quindi la procedura viene scalata per produrre rese maggiori della proteina bersaglio, che vengono poi isolate utilizzando tecniche di cromatografia di affinità. Infine, le proteine vengono purificate e quindi concentrate per applicazioni e analisi a valle. In definitiva, la pagina SDS e i risultati FPLC verificano che le proteine ricombinanti sono state isolate e purificate con successo e che le proteine vengono ulteriormente testate per verificarne la funzionalità.

Il vantaggio principale dell'ingegneria delle proteine ricombinanti è che ci consente di creare quantità su larga scala o su scala milligrammo di proteine progettate su misura per soddisfare le nostre esatte specifiche scientifiche. Ad esempio, possiamo aggiungere nuove funzionalità a porzioni di queste proteine per abilitare nuove proprietà. Oggi vi mostreremo come è possibile biotin le estremità di proteine specifiche, e lo usiamo per immobilizzare o legare specificamente queste proteine alle superfici per guidare le funzioni cellulari come la crescita neuronale o la differenziazione neuronale.

Gli individui che non conoscono questa tecnica non dovrebbero avere molte difficoltà nel seguire le procedure per l'isolamento delle proteine native o non native. Molti passaggi sono gli stessi, ma richiedono un buffer specifico formulato per condizioni native o non native. Attenta attenzione ai dettagli durante l'inizio.

Le fasi di trasformazione e di espressione del test garantiranno un'elevata resa proteica durante il successivo processo finale di scale-up. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché mostra come le proteine ricombinanti possano essere prodotte utilizzando semplici attrezzature e forniture di laboratorio. Utilizzando la semplice reazione batch, i terreni di equalizzazione e crescita vengono cresciuti in scala leader, producendo 10 milligrammi di proteine per coltura principale.

Inoltre, le tecniche cromatografiche possono essere utilizzate e dimostrate per mostrare come le proteine vengono ulteriormente purificate per l'applicazione a valle Oggi, Alicia, laureata in Cinema Lab, dimostrerà la procedura dopo il clonaggio e il test per l'espressione della proteina bersaglio di interesse e la coltivazione di una coltura da 20 millilitri durante la notte. Secondo il protocollo di testo, versare la coltura notturna in 1,8 litri di terreno di coltura sterile con ampicillina e utilizzare una pipetta per pasta per aggiungere da sei a otto gocce di colture sterili anti schiuma 2 0 colture a 4 posti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius attraverso un filtro da 0,2 micron, bolle di aria compressa nelle colture attraverso pietre di aerazione. Quando la coltura raggiunge un OD 600 compreso tra 0,7 e 0,8 a un millimolare IPTG e lo induce per quattro ore a 37 gradi Celsius o durante la notte a 18 gradi Celsius, a seconda che la proteina sia stata trovata nella frazione solubile o insolubile nell'espressione del test.

Esperimenti per raccogliere le cellule, trasferire la coltura in flaconi da centrifuga da un litro e farla girare per 15 minuti a 14.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius. Versare il super natin e con una spatola sottile, raccogliere il pellet batterico in due provette da 50 millilitri. Pellettare nuovamente le celle mediante centrifugazione per alcuni minuti prima di conservare i pellet a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire proteine non native. Isolamento di una proteina insolubile per ogni pellet di e coli congelato. Aggiungere 20 millilitri di lisi, tampone di lavaggio e vortice e agitare per risospendere per eliminare eventuali pezzi di grandi dimensioni.

Dopo l'incubazione su un mutatore per una notte, la soluzione apparirà come una centrifuga di liquami viscosi. L'impasto liquido a 20, 500 volte la gravità e la temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire il surnatante in una provetta nuova e scartare il pellet per l'isolamento delle proteine native.

Sospendere nuovamente i pellet nel tampone di lisi ad un volume finale di 30 millilitri con il pellet risospeso su ghiaccio. Impostare la sonicazione a un'ampiezza del 30% con un impulso di 30 secondi su 30 secondi off e sonicare per cinque minuti. Far oscillare il tubo su e giù durante la sonicazione per rompere completamente il pellet cellulare.

Centrifugare l'impasto a 20, 500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi trasferire il surnatante in un tubo nuovo e scartare il pellet. Per eseguire la cromatografia di affinità su una proteina isolata non nativa, aggiungere un millilitro di soluzione di resina di nichel NTA a ciascuna provetta da centrifuga e incubare su un mutatore o agitatore a temperatura ambiente per almeno un'ora.

Versare il liquame in una colonna di affinità e lasciare che la soluzione goccioli completamente attraverso la valvola del rubinetto di arresto in un becher di scarico. Aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio alla provetta da centrifuga per rimuovere la resina residua e aggiungere la soluzione alla colonna dopo che la soluzione è gocciolata. Usa un'asta di vetro per mescolare la resina e lasciala sgocciolare prima di aggiungere un altro lavaggio.

Successivamente, utilizzare 10 millilitri di tampone di lavaggio per ripetere il risciacquo della provetta da centrifuga e trasferirlo sulla colonna. Quindi eseguire altri otto lavaggi della colonna con 10 millilitri di tampone di lavaggio per lisi per ogni lavaggio. Al termine dei lavaggi, chiudere il rubinetto di arresto e sostituire il becher di scarico con la provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Aggiungere 15 millilitri di tampone eluciano alla colonna, mescolare la resina e lasciare riposare la soluzione per cinque minuti. Quindi aprire il rubinetto di arresto e raccogliere l'EIT prima di ripetere con altri 15 millilitri di tampone di eluizione per purificare una proteina nativa. Dopo aver aggiunto la resina di nichel NTA alla soluzione proteica, incubato su un mutatore a quattro gradi Celsius per almeno un'ora.

Dopo aver utilizzato il tampone di lavaggio per lavare la colonna 10 volte, aggiungere cinque millilitri di tampone di eluizione e incubare la resina per cinque minuti prima di utilizzare una provetta nuova per raccogliere la maggior parte dell'EIT mentre l'EIT gocciola dalla colonna, aggiungere 90 microlitri per pozzetto di reagente Bradford a una piastra trasparente da 96 pozzetti. Dopo ogni cinque millilitri di elucian con tampone, lasciare gocciolare 10 microlitri di soluzione dalla colonna in un pozzetto contenente 90 microlitri di reagente Bradford. Continuare con l'EEU fino a quando non viene più rilevata la proteina per la dialisi e/o Rena.

Le proteine trasferiscono ciascuna EIT al tubo di dialisi e dializzano contro il tampone appropriato, uno per quattro ore a quattro gradi Celsius prima di sostituirlo con il rispettivo tampone. Due notti a quattro gradi Celsius. Utilizzare concentratori di spin per concentrare le proteine dializzate a meno di cinque millilitri e purificare ulteriormente utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale, se lo si desidera entro l'ottavo atin.

Secondo il protocollo di testo durante l'espressione del test, NGF e SE tre A sono stati indotti per la prima volta per quattro ore a 37 gradi Celsius e l'analisi della pagina SDS ha determinato che entrambe le proteine si trovavano in questa frazione solubile. L'espressione proteica sembrava discreta e quindi è stata esaminata un'altra espressione di prova con induzione notturna a 18 gradi Celsius. L'espressione dell'NGF è migliorata nella frazione solubile, mentre non c'era alcuna differenza evidente con SEMA 3.

Un NGF è stato isolato in condizioni native e non native e fatto passare attraverso la colonna FPLC per la purificazione. Sebbene l'NGF fosse nella frazione solubile durante l'espressione del test, l'isolamento nativo ha prodotto una bassa resa sia a 37 gradi Celsius che a 18 gradi Celsius. Tuttavia, una resa più elevata di NGF è stata ottenuta attraverso l'isolamento non nativo con rinaturazione.

Di conseguenza, l'NGF è stato isolato in condizioni non native. Dopo l'induzione notturna a 18 gradi Celsius, l'isolamento non nativo ha portato a nessuna produzione di SEMA tre con 8,61 milligrammi in più o in meno di 3,1 milligrammi per coltura principale di due litri per l'isolamento nativo. Pertanto, SEMA tre A è stato indotto per quattro ore a 37 gradi Celsius e isolato utilizzando parametri di isolamento nativi.

Sono stati raccolti i picchi di FPLC e sono stati analizzati i campioni di NGF e SEMA tre A con la pagina SDS. Ulteriori picchi proteici trovati nell'output FPLC per SEMA tre A sono stati raccolti e analizzati con la pagina SDS e non sono stati localizzati nella regione del peso molecolare SEMA tre a. Queste frazioni sono molto probabilmente prodotti di degradazione perché non si sono comportate funzionalmente nei saggi basati su cellule, come hanno fatto i tre SEMA.

Un picco qui indicato. Una volta stabilita e padroneggiata la proteina ricombinante, l'isolamento e la purificazione dovrebbero richiedere solo pochi giorni se eseguiti correttamente. Tuttavia, le fasi iniziali di trasformazione batterica e di espressione del test richiedono più tempo per identificare correttamente la solubilità della proteina.

Una volta determinata la solubilità, una libreria dei batteri trasformati può essere conservata a meno 80. Inoltre, dopo l'espressione proteica, i pellet di E coli possono essere conservati a meno 80 fino a ulteriore isolamento e sperimentazione. Quando si tenta questa procedura, è importante assicurarsi che i tamponi siano sterilizzati e resi freschi per evitare che le proteasi denaturano e scompongano le proteine.

I tamponi di isolamento devono essere realizzati e sterilizzati ogni quattro-sei settimane e i tamponi di dialisi devono essere preparati il giorno prima dell'isolamento. Le colonne N-I-N-T-A e FPLC devono essere pulite secondo i protocolli del produttore al fine di prevenire la contaminazione incrociata da più proteine biotinilate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, isolare e purificare le proteine biotinilate progettate su misura utilizzando un sistema di espressione dell'ospite batterico.

Questo è simile a ciò che viene fatto sia scientificamente che commercialmente su piccola e grande scala. Pertanto, questo ha un'ampia applicazione.