Name: Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine per Nerve Tissue Regeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Impara a esprimere, isolare e purificare proteine biotinilate ricombinanti solubili e insolubili utilizzando cellule batteriche. Questo metodo consente di ottenere rese elevate per applicazioni in biotecnologia e ingegneria tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare l&#39;Università di Akron per il finanziamento che ha sostenuto questo lavoro.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ingegneria proteina ricombinante è una tecnica molto potente che abbraccia molte discipline. Si è costo-efficace, regolabile e una procedura relativamente semplice, consentendo la produzione di alte rese di proteine ​​personalizzati. È importante notare che la progettazione ed esprimere proteine ​​bersaglio non è sempre semplice. Espressione basale e la stabilità della proteina ricombinante dipendono da specifiche scelte di vettore, E. coli cellulari, peptide tag aggiunte e parametri colturali. Il nostro criter...

Proteine ​​coprono una vasta gamma di biomolecole che sono responsabili di molte funzioni biologiche, portando in definitiva a formazione di tessuto corretto e organizzazione. Queste molecole iniziano migliaia di vie di segnalazione che controllano up-regulation e / o down-regolazione dei geni e delle altre proteine, mantenendo l&#39;equilibrio all&#39;interno del corpo umano. Rottura di una singola proteina colpisce tutta questa rete di segnali, che può portare alla comparsa di disturbi o malattie devastanti. Ingegneria singole proteine ​​in laboratorio offre una soluzione per la lotta contro questi effetti collaterali e offre un&#39;alternativa ai farmaci a piccole molecole. Nel 1977, un gene che codifica la sequenza amminoacidica somatostatina 14 è stato uno dei primi polipeptidi ingegnerizzati creati utilizzando E. coli 1. Poco dopo, nel 1979, l&#39;insulina è stato clonato in plasmide pBR322, trasformato, espresso e purificato 2. Da allora, proteine ​​ricombinanti hanno esteso la loro influenza per più campi di research come biomateriali, drug delivery, l&#39;ingegneria dei tessuti, prodotti biofarmaceutici, agricoltura, enzimi industriali, biocarburanti, ecc (per una rassegna vedi riferimenti 3-8). Ciò è dovuto alla versatilità che la tecnica offre tramite l&#39;aggiunta di applicazioni porzioni chimiche specifiche o sequenze proteiche per scopi che includono, ma non limitato a, l&#39;identificazione delle proteine ​​bersaglio, stabilizzazione e purificazione. Tramite la tecnologia del DNA ricombinante, proteine ​​ricombinanti possono essere espressi in una varietà di sistemi ospite eucariotiche e procariotiche inclusi mammiferi, insetti, piante, lieviti, funghi o batteri. Ogni host offre diversi vantaggi e tipicamente il miglior sistema è determinato sulla base della funzione della proteina, resa, stabilità, costi complessivi e scalabilità. Cellule dei batteri spesso mancano i meccanismi di modificazione post-traslazionale che ospita eucariotiche forniscono (ad esempio la glicosilazione, disolfuro di transizione, e<html> tc.) 5. Di conseguenza, i sistemi di mammiferi e insetti solito risultato migliore compatibilità e l&#39;espressione di proteine ​​eucariotiche, tuttavia questi host sono generalmente più costosi e 9 richiede tempo. Pertanto, E. coli è l&#39;ospite privilegiato per il nostro sistema di espressione perché le cellule si espandono rapidamente in condizioni di crescita economici ed i meccanismi di espressione genetica sono ben compresi 5,9. Inoltre, questo sistema è facile da scalare, per scopi produttivi e dei risultati in proteine ​​funzionali nonostante la mancanza di modificazioni post-traslazionali 10. Il E. coli K12 è scelto in questo protocollo per la clonazione, perché questo ceppo offre ottimi rendimenti plasmide basato su alte efficienze di trasformazione. Inoltre, un E. coli BL21 è utilizzato per l&#39;espressione perché questo ceppo ospite contiene il gene della polimerasi T7 RNA che fornisce l&#39;espressione proteica controllata e stabilità 11. tenda &quot;&gt; Dopo la selezione ospitante, inoltre bisogna fare attenzione nella scelta del vettore di espressione ideale per facilitare l&#39;espressione della proteina selezionata e controllata. Sintetizzando proteine ​​ricombinanti inizia con una sequenza di DNA bersaglio che è clonato sotto la direzione del batteriofago T7 trascrizione e traduzione segnali, e espressione viene indotta in cellule ospiti contenenti copie cromosomiche del gene T7 RNA polimerasi 12. Questi vettori derivati ​​da pBR322 plasmide vettore (per una rassegna vedi riferimento 13), sono strettamente controllato dal promotore T7 sviluppato inizialmente da Studier e colleghi 14 e fornire ulteriori controllo attraverso l&#39;inclusione dell&#39;operatore lac e repressore lac (lac1) 15,16. Per ingegneria proteica ricombinante, questo sistema di espressione offre la possibilità di personalizzare una specifica sequenza amminoacidica di una proteina desiderata inserendo diverse sequenze di DNA bersaglio o per creare proteine ​​di fusione costituiti di dominio combinatos da singole proteine. Inoltre, alcune serie vettore comprendono peptide modifiche tag per essere immessi sul N o C terminus. Per i nostri scopi di progettazione, una istidina (His) tag è stato aggiunto alla sequenza bersaglio di DNA per la purificazione e una sequenza amminoacidica biotinylatable 15 è stato incluso per biotinylation 17,18. In questo protocollo un plasmide contenente un gene di resistenza all&#39;ampicillina, è stato scelto per portare le sequenze di proteine ​​di fusione biotinylatable. Espressione è controllata in questo vettore tramite il T7 promotore lac ed è facilmente indotta con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Espressioni di prova (colture su piccola scala) vengono utilizzati per determinare la presenza e la solubilità della proteina bersaglio, che può essere espresso sia in una forma solubile o insolubile formulare procedure di purificazione. Una proteina solubile espressa all&#39;interno della cellula batterica subirà pieghevole spontanea di mantenere la sua struttura nativa 19. Tipicamente il nativostruttura è termodinamicamente favorevole. In molti casi l&#39;attività metabolica dell&#39;ospite non è favorevole alla proteina bersaglio, ponendo sollecitazioni al sistema che porta alla produzione di proteine ​​insolubili e la formazione di corpi di inclusione composti di aggregati proteici insolubili. Così la proteina bersaglio denatura, rendendoli generalmente biologicamente inattivo 20. Entrambe le espressioni di prova sono scalati-up, e procedure di isolamento sono determinate dalla solubilità della proteina bersaglio. È necessaria una rinaturazione supplementare o ripiegamento passo per le proteine ​​insolubili. Le proteine ​​ricombinanti risultanti possono essere ulteriormente purificati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. In casa produzione di proteine ​​ricombinanti offre vantaggi economici rispetto ai prodotti commerciali dal milligrammi di proteina bersaglio possono essere isolati per litro di coltura principale. La maggior parte delle attrezzature necessarie è disponibile in un tipico laboratorio biologico o chimico. Ingegneria proteica consente la creazionedi proteine ​​di fusione personalizzato con ulteriori funzionalità che non sempre sono disponibili in commercio. figura 1 illustra i principali procedure necessarie proteine ​​ricombinanti ingegneria. Con questo sistema di espressione abbiamo creato molte proteine ​​biotinylatable, come l&#39;interferone-gamma, fattore di crescita derivato dalle piastrine, e la proteina morfogenetica dell&#39;osso, 21-23, ma ci concentreremo su due proteine ​​che abbiamo progettato per la guida degli assoni, NGF (29 kDa ) e Sema3A (91 kDa) 10 (per una rassegna vedi riferimento 24). Biotinylation è una tecnica comune per l&#39;identificazione, immobilizzazione e l&#39;isolamento di proteine ​​marcate utilizzando il noto interazione biotina-streptavidina 25-27. Sonde biofisiche 28,29, biosensori 30 e 31 punti quantici sono alcuni esempi di sistemi che utilizzano l&#39;alta affinità della biotina-streptavidina coniugazione con una K d dell&#39;ordine di 10 -15 M 27. Il E. bio coliligasi stagno, Bira, aiuti nel legame covalente di biotina alla catena laterale di lisina trovati all&#39;interno della biotina etichettato sequenza di 18,32. Tethering biotina ai materiali e biomolecole ha prodotto la consegna sostenuto di fattori di crescita per cellulare per molteplici applicazioni di ingegneria tissutale 21,33-35. Pertanto, ingegneria queste proteine ​​biotinylatable progettati su misura è un potente strumento che può trascendere molteplici interessi di ricerca.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditio-DL-treitolo, DTT, 99,5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Idrossietilmercaptano &beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td>Bioshop AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antischiuma 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &micro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Cellule Competenti</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>reagente Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Gel di filtrazione standard</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 fiale</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Guanidina idrodioride amioformamidina cloridrato</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Imidazolo&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>tampone campione Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauryl sulfate sale sodico, Sodium dodecyl surface</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Brodo&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Host di clonazione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>confezione da 10</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &micro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher</td><td>Scientific S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio diabasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Brodo</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Triptone, pancreatico</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Estratto di lievito, EMD granulato</td><td></td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Include kit e accessori</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale da banco</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>L'enzima viene fornito con tamponi di reazione e soluzione di biotina</td></tr><tr><td>Cassetta per dialisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>Tubo per</td> <td>dialisiSpectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: valvola di deviazione del flusso da 25.000 e 50.000</td></tr><tr><td>FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Kit di analisi per la quantificazione della biotina</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Rack per provette, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Collettore di frazioni Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Include kit e accessori</td></tr><tr><td>Termostato/Termostato/Refrigerato&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Modello 1156D</td></tr><tr><td>Forno di riscaldamento Serie FD</td><td>Legante</td><td></td><td>Modello FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Fuori produzione - Prodotto di ricambio: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Include bottiglie di poliporpilene da 1 litro</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Themo Scientific</td><td>1849 Forma 1800</td><td>Series Clean</td></tr><tr><td>Bench Lettore di micropiastre</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4 gel verticale sistema di elettroforesi</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Qualsiasi kDa, pettine a 15 pozzetti</td></tr><tr><td>Ni-NTA Colonna</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; volume ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmidi Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Alimentatore</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Tubi in polipropilene copolimero a fondo tondo</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; tubi per rotore JA 25.50</td></tr><tr><td>Concentratori Spin-X UF</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 e 6 ml; MWCO: 10.000 Da</td></tr><tr><td>Servizio di subclonaggio</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td> Processore ad ultrasuoni <td>per servizi proteici</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A Modello</td><td>CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Modello G560</td></tr></tbody></table>

espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili biotinylated proteine ​​per nerve tissue regeneration

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Ingegneria proteica ricombinante ha utilizzato Escherichia coli (E. coli) sistemi di espressione per quasi 4 decenni, e oggi E. coli è ancora dell&#39;organismo ospite più utilizzato. La flessibilità del sistema consente l&#39;aggiunta di frazioni come per esempio un tag biotina (per interazioni streptavidina) e proteine ​​funzionali più grandi come proteina fluorescente verde o ciliegio proteina rosso. Inoltre, l&#39;integrazione di amminoacidi innaturali come chelanti di ioni metallici, gruppi funzionali reattivi univoco, sonde spettroscopiche, e molecole che impartiscono modificazioni post-traduzionali ha permesso una migliore manipolazione delle proprietà proteiche e funzionalità. Di conseguenza questa tecnica crea proteine ​​di fusione personalizzabili che offrono utilità significativa per vari campi di ricerca. Più specificamente, la sequenza proteica biotinylatable è stato incorporato in molte proteine ​​bersaglio a causa della elevata interazione affinità tra biotina con avidina e streptavidina. Questa aggiunta ha aiutato a migliorare la rilevazione e purificazione di proteine ​​nella categoria oltre ad aprire la strada ad applicazioni secondarie, come l&#39;ordinamento delle cellule. Così, molecole di biotina marcata mostrano una crescente influenza e diffusa nei campi bioindustriale e biomedica. Ai fini della nostra ricerca abbiamo ingegnerizzato proteine ​​di fusione biotinilato ricombinanti contenenti il ​​fattore di crescita nervoso (NGF) e semaphorin3A (Sema3A) regioni funzionali. Abbiamo precedentemente riportato come queste proteine ​​di fusione biotinilato, insieme ad altre sequenze proteiche attive, possono essere legati a biomateriali per l&#39;ingegneria tissutale e scopi rigenerativi. Questo protocollo delinea le basi delle proteine ​​ingegneria biotinylatable alla scala milligrammo, utilizzando un T7 lac inducibile vettoriale e E. padroni di espressione coli, a partire da trasformazione di scale-up e di purificazione.

<html> Cloning and Test Expression Quando placcatura viene eseguita correttamente, singole colonie isolate dovrebbero costituire per aumentare le possibilità di spennare clonale trasformati batteri cellule (Figura 2A). Tuttavia, se troppe cellule vengono piastrate, piastre vengono incubate troppo tempo a 37 ° C o trasformazione è discutibile, le colonie possono coprire la piastra di agar o formare grandi aggregati di cellule (figure 2b e <str...

Sviluppo di proteine ​​di fusione biotinylatable ha molte potenziali applicazioni in diversi campi di ricerca. Ingegneria proteina ricombinante è una procedura dritto in avanti che è costo-efficace, che fornisce alte rese di proteine ​​personalizzati.

Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine ​​per Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

L'obiettivo generale di questa procedura è progettare, esprimere e isolare con successo proteine ricombinanti biotinilate che possono essere incorporate in una varietà di applicazioni come sonde, sensori, somministrazione di farmaci e ingegneria dei tessuti. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasformando il plasmide progettato su misura in una linea cellulare batterica mediante colture su piccola scala, quindi inducendo l'espressione della proteina bersaglio. Successivamente, si determina la presenza e la solubilità della proteina bersaglio al fine di formulare adeguate procedure di purificazione.Successivamente, la procedura viene ampliata per produrre rese più elevate della proteina bersaglio, che vengono quindi isolate mediante tecniche di cromatografia per affinità. Infine, le proteine vengono purificate e concentrate per applicazioni e analisi successive. In ultima analisi, i risultati di SDS-PAGE e FPLC confermano che le proteine ricombinanti sono state isolate e purificate con successo, e le proteine vengono ulteriormente testate per verificarne la funzionalità.Il principale vantaggio dell'ingegneria delle proteine ricombinanti è che ci permette di creare quantità su

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Questo video dimostra l'isolamento di proteine della superficie cellulare e intracellulari da una coltura di astrociti. La coltura degli astrociti viene posta su ghiaccio per inibire l'endocitosi, quindi le proteine della superficie cellulare vengono marcate con un reagente di biotinilazione. Le cellule vengono lisate per rilasciare le proteine biotinilate della superficie cellulare e le proteine intracellulari non biotinilate. Infine, le perle rivestite di streptavidina vengono utilizzate per...

Isolamento di proteine di superficie cellulare e intracellulari da una coltura di astrociti

Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine ​​e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell'espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.

In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.

Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

Una metodologia basata sulla gradiente di centrifugazione a densità modificata è stata utilizzata per isolare le cellule epiteliali del tessuto intestinale di Rhipicephalus microplus . Le proteine ​​legate alle superfici sono state biotinilate e purificate mediante perline magnetiche di streptavidina per l'utilizzo nelle applicazioni a valle.

Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l'espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.

Determinazione dell&#39;espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Qui presentiamo un protocollo per l'etichettatura dei Murina in vivo delle proteine di superficie delle cellule glomerulari con biotina. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire immunoprecipitazione endogena della proteina di interesse.

Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

Presentato qui è un protocollo che combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale in vitro e l'incorporazione metabolica di sialoglycan con gruppi funzionali bioortogonali per espandere le cellule staminali primarie e progenitrici ed etichettare la loro superficie sialoglycoproteins per l'imaging o l'analisi della spettrometria di massa dei marcatori di superficie cellulare.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 in modo conveniente ed è purificato dalla cromatografia di affinità. BDNFavi viene quindi direttamente mono-biotinylated con l'enzima BirA in un tubo. BDNFavi e BDNFavi monobionlate mantengono la loro attività biologica rispetto al BDNF disponibile in commercio.

Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Impara a esprimere, isolare e purificare proteine biotinilate ricombinanti solubili e insolubili utilizzando cellule batteriche. Questo metodo consente di ottenere rese elevate per applicazioni in biotecnologia e ingegneria tissutale.

Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine ​​per Nerve Tissue Regeneration

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