Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine ​​per Nerve Tissue Regeneration

L'obiettivo generale di questa procedura è progettare, esprimere e isolare con successo proteine ricombinanti biotinilate che possono essere incorporate in una varietà di applicazioni come sonde, sensori, somministrazione di farmaci e ingegneria dei tessuti. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasformando il plasmide progettato su misura in una linea cellulare batterica mediante colture su piccola scala, quindi inducendo l'espressione della proteina bersaglio. Successivamente, si determina la presenza e la solubilità della proteina bersaglio al fine di formulare adeguate procedure di purificazione.

Successivamente, la procedura viene ampliata per produrre rese più elevate della proteina bersaglio, che vengono quindi isolate mediante tecniche di cromatografia per affinità. Infine, le proteine vengono purificate e concentrate per applicazioni e analisi successive. In ultima analisi, i risultati di SDS-PAGE e FPLC confermano che le proteine ricombinanti sono state isolate e purificate con successo, e le proteine vengono ulteriormente testate per verificarne la funzionalità.

Il principale vantaggio dell'ingegneria delle proteine ricombinanti è che ci permette di creare quantità su larga scala o su scala milligrammica di proteine progettate su misura per soddisfare le nostre specifiche scientifiche esatte. Ad esempio, possiamo aggiungere nuove funzionalità a parti di queste proteine per conferire loro nuove proprietà. Oggi vi mostreremo come biotinilizzare le estremità di proteine specifiche, e come utilizzare questo accorgimento per immobilizzare o ancorare in modo specifico queste proteine su superfici, al fine di guidare funzioni cellulari come la crescita assonale o la differenziazione neuronale.

I soggetti alle prime armi con questa tecnica non dovrebbero incontrare grandi difficoltà seguendo le procedure per l'isolamento di proteine native o non native. Molti passaggi sono identici, ma richiedono un buffer specifico formulato per condizioni native o non native. È fondamentale prestare attenzione ai dettagli fin dall'inizio.

Le fasi di trasformazione ed espressione sperimentale garantiranno un'elevata resa proteica durante la successiva fase di scala finale. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché mostra come le proteine ricombinanti possano essere prodotte utilizzando attrezzature e materiali di laboratorio semplici. Utilizzando la reazione discontinua semplice, il mezzo di equilibrio e il mezzo di crescita vengono amplificati su scala maggiore, producendo 10 milligrammi di proteina per ogni coltura principale.

Inoltre, è possibile utilizzare e dimostrare tecniche di cromatografia per mostrare come le proteine vengono ulteriormente purificate per applicazioni successive. Oggi, Alicia, del laboratorio cinematografico per laureati, illustrerà la procedura. Dopo il clonaggio e il test di espressione della proteina bersaglio di interesse, e la coltivazione di una coltura da 20 millilitri per tutta la notte, versare la coltura notturna in 1,8 litri di mezzo di crescita sterile contenente ampicillina ed utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere da sei a otto gocce di anti-foam sterile 204. Posizionare le colture in un bagnomaria a 37 gradi Celsius; attraverso un filtro da 0,2 micron, far passare aria compressa nelle colture mediante pietre di aerazione. Quando la coltura raggiunge un OD600 compreso tra 0,7 e 0,8, aggiungere IPTG alla concentrazione di un millimolare e indurre per quattro ore a 37 gradi Celsius oppure per tutta la notte a 18 gradi Celsius, a seconda che la proteina si sia rivelata presente nella frazione solubile o insolubile durante il test di espressione.

Eseguire esperimenti per raccogliere le cellule, trasferire la coltura in bottiglie da centrifuga da un litro e centrifugare per 15 minuti a 14.000 × g e quattro gradi Celsius. Versare il soprannatante e, utilizzando una spatola sottile, prelevare il pellet batterico in due tubi da 50 millilitri. Pellettizzare nuovamente le cellule mediante centrifugazione per alcuni minuti prima di conservare i pellet a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire l'isolamento di proteine non native. Aggiungere a ogni pellet congelato di E. coli 20 millilitri di buffer di lisi e di lavaggio, quindi vortexare e agitare per risospendere ed eliminare eventuali grumi di grandi dimensioni.

Dopo l'incubazione su un mutatore durante la notte, la soluzione avrà l'aspetto di una sospensione viscosa da centrifugare. Centrifugare la sospensione a 20.500 ×g e a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire il soprannatante in una provetta pulita e scartare il pellet per l'isolamento della proteina nativa.

Risospendere i pellet nel buffer di lisi ad un volume finale di 30 millilitri, mantenendo il pellet risospeso sul ghiaccio. Impostare il sonicator al 30% di ampiezza con un impulso di 30 secondi accesi e 30 secondi spenti, e sottoporre a sonica per cinque minuti. Muovere il tubo su e giù durante la sonica per rompere completamente il pellet cellulare.

Centrifugare la sospensione a 20.500 ×g e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire quindi il soprannatante in un tubo nuovo e scartare il pellet. Per eseguire la cromatografia di affinità su una proteina isolata non nativa, aggiungere un millilitro di soluzione di resina al nichel NTA in ciascun tubo da centrifuga e incubare su un agitatore o shaker a temperatura ambiente per almeno un'ora.

Versare la sospensione in una colonna a affinità e lasciare che la soluzione scorra completamente attraverso la valvola a tenuta in un becher di scarto. Aggiungere 10 millilitri di buffer di lavaggio nel tubo da centrifuga per rimuovere la resina residua e aggiungere la soluzione alla colonna dopo che questa ha finito di scorrere. Utilizzare una bacchetta di vetro per mescolare la resina e lasciarla terminare lo scolo prima di aggiungere un ulteriore lavaggio.

Successivamente, utilizzare 10 millilitri di buffer di lavaggio per ripetere il risciacquo del tubo da centrifuga e trasferirli sulla colonna. Eseguire quindi altri otto lavaggi della colonna con 10 millilitri di buffer di lisi per ogni lavaggio. Al termine dei lavaggi, chiudere il rubinetto e sostituire il becher per i rifiuti con il tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Aggiungere 15 millilitri di tampone eluente alla colonna, mescolare la resina e lasciare riposare la soluzione per cinque minuti. Quindi aprire il rubinetto e raccogliere l’EIT, ripetendo l’operazione con ulteriori 15 millilitri di tampone eluente per purificare una proteina nativa. Dopo aver aggiunto la resina nickel NTA alla soluzione proteica, incubare su un agitatore a quattro gradi Celsius per almeno un’ora.

Dopo aver utilizzato il tampone di lavaggio per lavare la colonna per 10 volte, aggiungere cinque millilitri di tampone di eluizione e incubare la resina per cinque minuti prima di utilizzare una provetta nuova per raccogliere la maggior parte dell'EIT mentre l'EIT gocciola dalla colonna; aggiungere 90 microlitri per pozzetto del reagente di Bradford in una piastra chiara a 96 pozzetti. Dopo ogni eluizione di cinque millilitri con tampone, lasciare gocciolare 10 microlitri di soluzione dalla colonna in un pozzetto contenente 90 microlitri di reagente di Bradford. Proseguire con l'EEU finché la proteina non viene più rilevata, quindi dializzare e/o Rena.

Trasferire le proteine in tubi dialitici e dializzare contro il rispettivo tampone, una volta per quattro ore a quattro gradi Celsius, prima di sostituire con il tampone corrispondente. Due volte per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzare dei concentratori a centrifuga per concentrare le proteine dializzate a meno di cinque millilitri ed eventualmente ulteriormente purificare mediante cromatografia di esclusione molecolare usando atin otto.

Secondo il protocollo descritto nel test di espressione, NGF e SEMA3A sono stati inizialmente indotti per quattro ore a 37 gradi Celsius e l'analisi tramite SDS-PAGE ha determinato che entrambe le proteine si trovavano in questa frazione solubile. L'espressione proteica sembrava accettabile e pertanto è stato esaminato un ulteriore test di espressione con induzione notturna a 18 gradi Celsius. L'espressione di NGF è migliorata nella frazione solubile, mentre non si è osservata alcuna differenza significativa con SEMA3A.

Un NGF è stato isolato in condizioni native e non native ed è stato purificato mediante colonna FPLC. Sebbene il NGF fosse presente nella frazione solubile durante l'espressione testata, l'isolamento in condizioni native ha prodotto un basso rendimento sia a 37 gradi Celsius che a 18 gradi Celsius. Tuttavia, un rendimento maggiore di NGF è stato ottenuto tramite isolamento non nativo con rinaturazione.

Di conseguenza, il NGF è stato isolato in condizioni non native. Dopo un'induzione notturna a 18 gradi Celsius, l'isolamento non native non ha prodotto SEMA three a, mentre per l'isolamento native si è ottenuto 8,61 più o meno 3,1 milligrammi per coltura principale di due litri. Pertanto, SEMA three A è stato indotto per quattro ore a 37 gradi Celsius ed isolato utilizzando i parametri di isolamento native.

I picchi FPLC sono stati raccolti e i campioni di NGF e SEMA tre A sono stati analizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE. Sono stati raccolti e analizzati ulteriori picchi proteici presenti nell'eluito FPLC per SEMA tre A, i quali non corrispondevano alla regione del peso molecolare di SEMA tre A. Queste frazioni sono molto probabilmente prodotti di degradazione, poiché non hanno mostrato attività funzionale nei saggi cellulari, a differenza di SEMA tre.

Un picco indicato qui. Una volta stabilito e padroneggiato il sistema, l'isolamento e la purificazione della proteina ricombinante dovrebbero richiedere solo pochi giorni, se eseguiti correttamente. Tuttavia, le fasi iniziali di trasformazione batterica e di test dell'espressione richiedono più tempo, al fine di identificare correttamente la solubilità della proteina.

Dopo aver determinato la solubilità, una libreria dei batteri trasformati può essere conservata a meno 80. Inoltre, dopo l'espressione proteica, i pellet di e coli possono essere conservati anche loro a meno 80 fino all'isolamento e agli esperimenti successivi. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che i tamponi siano sterilizzati e preparati al momento per evitare che le proteasi denaturino e degradino le proteine.

I tamponi per l'isolamento devono essere preparati e sterilizzati ogni quattro-sei settimane, mentre i tamponi per la dialisi devono essere preparati il giorno precedente l'isolamento. Le colonne N-I-N-T-A e FPLC devono essere pulite seguendo i protocolli del produttore al fine di prevenire contaminazioni incrociate da parte di diverse proteine biotinilate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come esprimere, isolare e purificare proteine biotinilate su misura utilizzando un sistema di espressione in un ospite batterico.

Questo è simile a quanto viene fatto a livello scientifico e commerciale su scala ridotta e su larga scala. Pertanto, ha ampie applicazioni.