Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l'applicazione di Invasion Cancer Cell

L'obiettivo generale della procedura seguente è generare una matrice nativa a partire da fibroblasti per valutare l'invasione delle cellule tumorali. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto coltivando i fibroblasti su plastica in un mezzo arricchito con acido sorbico per produrre la matrice nativa. Nel secondo passaggio, la matrice nativa viene staccata e rilasciata dalla superficie di crescita in plastica, quindi viene seminata con cellule tumorali e sollevata all'interfaccia aria-liquido dopo un periodo definito.

Queste colture 3D vengono raccolte per l'analisi istologica dell'invasione delle cellule tumorali. In definitiva, gli effetti della matrice di fibroblasti nativa sull'invasione delle cellule tumorali possono essere valutati mediante analisi immunoistochimica. Il vantaggio di questa tecnica per la generazione di colture tipiche 3D consiste nella possibilità di valutare la matrice nativa prodotta dagli stessi fibroblasti, in assenza di substrati sintetici o estranei, come il collagene di tipo uno di origine interspecifica. Iniziare seminando 200.000 fibroblasti per pozzetto in piastre a sei pozzetti, utilizzando mezzo per fibroblasti integrato con acido ascorbico appena preparato.

Passare le cellule ogni due o tre giorni con due o cinque millilitri di mezzo fresco. Alla fine delle sei settimane si formerà uno strato spesso di cellule inglobate in una matrice extracellulare visibile ad occhio nudo. A seconda del tipo di cellule utilizzate, la matrice visibile potrebbe formarsi prima o dopo e potrebbe iniziare a staccarsi dalla piastra come mostrato in questo caso.

Per staccare questo strato dalla piastra per colture cellulari, raschiare delicatamente la circonferenza della matrice con la punta di una pipetta microlitrica da un millilitro, quindi spingere i bordi della matrice verso il centro del pozzetto. Le cellule e la matrice nativa dovrebbero staccarsi facilmente dalla superficie della piastra e ora galleggiare nel mezzo. Distribuire la matrice nativa all'interno del mezzo per evitare che si ripieghi su se stessa.

Lasciare che la matrice nativa galleggi e si rimodelli per cinque giorni, continuando a cambiare il mezzo ogni due o tre giorni a causa della resistenza alla trazione e del rimodellamento intrinseco. La matrice si contrarrà notevolmente e si ridurrà a una matrice nativa più piccola ma più spessa, momento in cui sarà pronta per essere utilizzata. Per il saggio di invasione.

Per il saggio di invasione. Utilizzare prima pinze a punta smussata per trasferire delicatamente la matrice nativa su una rete di nylon. Una volta sulla rete, utilizzare una pipetta microlitrica da un millilitro e pinze a punta smussata per stendere delicatamente la matrice in modo da farla aderire il più possibile in piano.

Successivamente, spalmare una piccola quantità di Vaseline su un'estremità di un cilindro clonale sterile per matrice. Quindi posizionare i cilindri sulle matrici native con il lato della Vaseline rivolto verso il basso, per garantire una sigillatura stretta tra la matrice nativa e gli anelli clonali. Aggiungere ora 250.000 cellule di carcinoma a cellule squamose cutaneo o cellule SCC nel mezzo di crescita del sito carat ai cilindri.

Dopo che le cellule di carcinoma a cellule squamose cutaneo si sono depositate sulla matrice nativa, rimuovere i cilindri, quindi sollevare la rete di nylon con la matrice nativa e le cellule di SEC cutaneo fino all'interfaccia aria-liquido, appoggiandole su un supporto di rete metallica in acciaio inossidabile piegato. Infine, aggiungere il terreno di coltura per cheratinociti, integrato con acido sorbico, fino a quando il livello del terreno tocca la parte inferiore della matrice nativa; sostituire il terreno ogni due o tre giorni e raccogliere i campioni a sette e 14 giorni dal seeding delle cellule di carcinoma a cellule squamose cutaneo. Questa tecnica permette di esaminare e confrontare il comportamento invasivo delle cellule tumorali in diversi ambienti stromali tridimensionali.

Come si può osservare in queste immagini, l'invasione delle cheratinocti SCC cutanee da RDEB è risultata significativamente ritardata nelle matrici native sovraesprimenti C sette nei pannelli di destra, rispetto ai controlli RDEB carenti di C sette nei pannelli di sinistra. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori di valutare direttamente l'influenza della Matrice Nativa prodotta dai fibroblasti sui processi delle cellule tumorali, come l'invasione.