Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l'applicazione di Invasion Cancer Cell

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di generare una matrice nativa dai fibroblasti per valutare l'invasione delle cellule tumorali. Ciò si ottiene in primo luogo coltivando fibroblasti su plastica in un terreno arricchito con acido sorbico per generare la matrice nativa. Nella seconda fase, la matrice nativa viene staccata e rilasciata dalla superficie di crescita della plastica, quindi questa matrice viene seminata con cellule tumorali e sollevata all'interfaccia aria-liquido dopo un periodo prestabilito.

Queste colture 3D vengono raccolte per l'analisi istologica dell'invasione delle cellule tumorali. In definitiva, gli effetti della matrice nativa dei fibroblasti sull'invasione delle cellule tumorali possono essere valutati mediante analisi immunoistologica. Quindi il vantaggio di questa tecnica per la generazione di colture tipiche 3D è che possiamo valutare la matrice nativa prodotta dai fibroblasti stessi in assenza di substrati sintetici o estranei, come il collagene di tipo uno di specie incrociate Inizia seminando 200.000 fibroblasti per pozzetto in piastre a sei pozzetti in terreni di fibroblasti, integrati con acido IC appena preparato.

Due fosfati ripuliscono le cellule ogni due o tre giorni con da due a cinque millilitri di terreno fresco. Alla fine delle sei settimane si formerà uno spesso strato di cellule incorporate nella matrice extracellulare visibile ad occhio nudo. A seconda delle cellule utilizzate, la matrice visibile può formarsi prima o poi e può iniziare a staccarsi dal piatto come si vede qui.

Per rilasciare questo strato dalla piastra di coltura tissutale, raschiare delicatamente la circonferenza della matrice con una punta per micropipetta da un millilitro, quindi spingere i bordi della matrice verso il centro del pozzetto. Le celle e la matrice nativa dovrebbero staccarsi facilmente dalla superficie della piastra e ora galleggiare nel terreno. Distribuisci la matrice nativa all'interno del supporto per evitare che si ripieghi su se stessa.

Lasciare che la matrice nativa galleggi e si rimodelli per cinque giorni, continuando a cambiare il supporto ogni due o tre giorni a causa della resistenza alla trazione e del rimodellamento intrinseco. La matrice si contrarrà drasticamente e si ridurrà a una matrice nativa più piccola ma più spessa, a quel punto sarà pronta per essere utilizzata. Per il test di invasione.

Per il test di invasione. Per prima cosa utilizzare una pinza smussata per trasferire delicatamente la matrice nativa su una rete di nylon. Una volta sulla rete, usa una punta per micropipetta da un millilitro e una pinza smussata per stendere delicatamente la matrice in modo che sia il più piatta possibile.

Quindi, spalmare una piccola quantità di vaselina su un'estremità di un cilindro clonale sterile per matrice. Quindi posizionare i cilindri sulle matrici native con il lato della vaselina rivolto verso il basso per garantire una tenuta ermetica tra la matrice nativa e gli anelli clonali. Ora aggiungi ai cilindri 250.000 cellule di carcinoma cutaneo a cellule squamose o SCC in terreni di crescita del sito di carati.

Dopo che le cellule SCC cutanee si sono depositate sulla matrice nativa, rimuovere i cilindri, quindi sollevare la matrice nativa della rete di nylon e le cellule SEC cutanee all'interfaccia aria-liquido e su un supporto in rete metallica piegata in acciaio inossidabile. Infine, aggiungere i terreni di crescita dei cheratinociti, integrati con acido sorbico fino a quando il livello del terreno non tocca il fondo della matrice nativa, cambiando il terreno ogni due o tre giorni e raccogliendo a sette e 14 giorni dopo la semina delle cellule SCC cutanee. Questa tecnica apre la possibilità di esaminare e confrontare il comportamento invasivo delle cellule tumorali in diversi ambienti stromali 3D.

Come si vede in queste immagini, l'invasione dei cheratinociti cutanei RDEB SCC era significativamente ritardata nelle matrici native che sovraesprimevano C seven nei pannelli di destra rispetto ai controlli RDEB carenti di C seven nei pannelli di sinistra. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori di valutare direttamente l'influenza della matrice nativa prodotta dai fibroblasti sui processi delle cellule tumorali come l'invasione.