A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire l'imaging in immunofluorescenza intravitale dell'orecchio di topi portatori di melanoma per studiare la dinamica dei componenti della matrice del tessuto tumorale. Ciò si ottiene inoculando prima un orecchio di topo con GFP che esprime cellule di melanoma B 16 F 10. Il successivo intervento chirurgico viene eseguito sull'orecchio del topo per separare la pelle ventrale da quella dorsale ed esporre il tessuto tumorale.

Quindi viene eseguita la colorazione immunologica sul tessuto esposto dell'orecchio dorsale. Infine, l'animale viene preparato per l'imaging intravitale. In definitiva, la microscopia stereoscopica fluorescente o la microscopia multifotone viene utilizzata per mostrare la localizzazione e il comportamento dinamico delle cellule tumorali e dei loro componenti della matrice.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto agli altri metodi di imaging dal vivo è che possiamo visualizzare le interazioni dinamiche delle cellule tumorali con le cellule stromali associate come le cellule immunitarie, ma è nel contesto della matrice extracellulare fibrillare e a rete. Quindi questo metodo può aiutarti ad affrontare domande chiave nel campo della biologia dei tumori, come il modo in cui le cellule tumorali interagiscono con il loro microambiente fisico, che a sua volta può fornire importanti informazioni su come i tumori progrediscono. Una parte della procedura sarà dimostrata da Vita Kki, uno scienziato senior del nostro laboratorio. Per preparare le cellule tumorali per l'iniezione, iniziare con la coltura di cellule di melanoma GFP B 16 F 10.

Dopo aver centrifugato le cellule, trasferirle in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugarle di nuovo, rimuovere tutto il surnatante tranne un sottile strato di terreno che rimane appena sopra il pellet, risospendere le cellule in un impasto cellulare denso per caricare il liquame cellulare in un volume di 10 microlitri. Siringa di Hamilton. Rimuovere il cappuccio della punta da un ago calibro 33 collegato e caricare 20 microlitri di impasto liquido sopra la camera della punta.

Quindi tirare indietro lo stantuffo fino a caricare cinque microlitri di liquame all'interno della siringa. Dopo aver anestetizzato un mouse C 57 black six con anestesia iniettabile, rasare la testa del topo, pulire i peli sulla testa e intorno all'orecchio e risciacquare con acqua. Utilizzando del nastro adesivo, fissare il bordo prossimale dell'orecchio sulla punta di un dito indice.

Inserire l'ago della siringa di Hamilton tra il derma dorsale e la cartilagine dell'orecchio di un topo C 57 black six penetrando nell'orecchio prossimale a distale per circa due o tre millimetri. Iniettare l'impasto cellulare e ritrarre lentamente l'ago dalla pelle. Lascia che le cellule tumorali formino un tumore solido nel corso di sette-nove giorni, utilizzando un microscopio a fluorescenza per seguire la crescita del tumore.

Dopo aver utilizzato una miscela di ossigeno umidificato e isofluoro per anestetizzare il mouse, posizionare il mouse su un termoforo a 37 gradi Celsius ed eseguire un leggero pizzicamento delle dita. Per confermare che l'animale sia sufficientemente anestetizzato. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi e tenere il mouse su un termoforo controllato dal termistore rettale durante l'intera procedura.

Quindi, posizionare delicatamente l'orecchio portatore del tumore su una pila di vetrini. Quindi utilizzare piccole strisce di nastro adesivo per fissare i bordi anteriori e posteriori dell'orecchio alla pila utilizzando un bisturi, tagliare la pelle ventrale dell'orecchio lungo l'anti elica del padiglione auricolare. Rimuovi i nastri dall'orecchio con l'aiuto di una pinzetta curva.

Staccare delicatamente il derma ventrale e la cartilagine dal derma dorsale. Utilizzare il tampone della suoneria per lavare l'orecchio per eseguire la colorazione immunofluorescente. Applicare all'orecchio esposto gli anticorpi primari che prendono di mira le molecole della matrice extracellulare nel tampone bloccante e posizionare un vetrino coprioggetti.

Incubare per 15 minuti prima di utilizzare circa cinque millilitri di tampone ringers per lavare l'orecchio due volte. Applicare anticorpi secondari appropriati o streptococco Aden nel tampone bloccante. Applicare un vetrino coprinte e incubare per 15 minuti prima di lavare due volte Come prima, piegare l'area dermica aperta nel conki EM mencia e utilizzare salviette sterili per asciugare il derma esterno dell'orecchio non aperto.

Posizionare l'orecchio su una pila di vetrini e applicare 0,5 microlitri di colla chirurgica sui bordi dorsali anteriori e posteriori per immobilizzarlo per l'imaging a breve termine di due ore o meno. Aggiungere un tampone sterile come suoneria per sorbato appena preparato sulla parte superiore dell'orecchio immobilizzato e applicare un vetrino coprioggetti. Quindi utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente con due lenti per visualizzare l'orecchio.

Per l'imaging a lungo termine. Posizionare l'uscita di un ago attaccato a un serbatoio contenente un anello per sorbato sotto il vetrino coprioggetti a circa 0,5 centimetri di distanza dall'orecchio. Utilizzare una pompa peristaltica alla velocità di un microlitro al minuto per erogare costantemente il tampone alla camera.

Aprire il software di acquisizione. Regola l'intensità della fluorescenza del guadagno, l'ingrandimento e il tempo di esposizione dell'immagine, diversi campi che contengono cellule tumorali, nonché proteine della matrice extracellulare colorate per eseguire l'imaging intravitale utilizzando la microscopia multifotone con grasso al silicio. A partire dalla base dell'orecchio.

Costruisci una parete circolare di circa due centimetri di diametro e due o tre millimetri di altezza intorno all'orecchio. Riempi il cerchio con una suoneria per sorbato. Posizionare il mouse sul tavolino su un termoforo, impostato a 37 gradi Celsius e configurare le impostazioni del microscopio secondo il protocollo di testo.

Come mostrato in questa figura, molte strutture possono essere distinte in base alla loro morfologia dopo l'immunocolorazione. Per i componenti della membrana basale come il collagene quattro o il prolean, soprattutto, le proteine strutturali che normalmente non possono essere rilevate da SHG. È possibile visualizzare il classico metodo di rilevamento a matrice.

Ad esempio, abbiamo scoperto che la tens e la C si depositano in diverse posizioni dello stroma tumorale dai collageni fibrillari: le forze che si sviluppano all'interno del microambiente tumorale possono portare all'espansione o alla contrazione della matrice tumorale e, di conseguenza, al rimodellamento della vascolarizzazione tumorale simile alla guarigione delle ferite. Qui dimostriamo che possiamo eseguire la microscopia time-lapse a due fotoni, mentre simultaneamente imaging immuno marcato tenas e matrice C con un minimo sbiancamento fotografico dei quattro fluori, anche in alta densità di fotoni alla microscopia fotonica. In questo video, le cellule tumorali che erano sovrapposte al derma esposto per il collagene 4 hanno aderito al tessuto e in gruppi hanno iniziato a migrare collettivamente lungo la membrana basale dei vasi sanguigni e dei siti adiposi.

Una volta padroneggiata, l'intera procedura di apertura dell'orecchio e l'immunocolorazione richiede due ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'immunocolorazione intravitale per studiare le interazioni della matrice cellulare nei tumori utilizzando l'epifluorescenza o la microscopia a due fotoni.