Name: Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Impara un metodo in vitro per osservare le interazioni tra cellule tumorali circolanti della prostata e cellule endoteliali umane in condizioni di flusso fisiologico. Questa tecnica consente l'analisi in tempo reale del processo metastatico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del Dipartimento della Difesa prostatico Programma di Ricerca sul Cancro (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 dal National Cancer Institute, e il Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vorremmo ringraziare il Dott. Annarita Lorenzo (Dipartimento di Patologia) per fornire gli anticorpi VE-caderina, e il dottor Marco Seandel (Dipartimento di Chirurgia) per la fornitura di HUVECs.

1. Coltura HUVECs su Microslides per interazioni Observing CTC-endoteliali <ol><li> Sotto il cofano di coltura tissutale, prima sciacquare la MicroSlide, larghezza del canale di 1 mm con PBS. Cappotto delicatamente il MicroSlide con 200 ml di 50 mg / ml fibronectina (sciolto in PBS) usando una siringa Luer-lock da 1 ml. </li><li> Coprire il MicroSlide con il coperchio e tenerlo all&#39;interno della cappa coltura tissutale per 30 min. Erogazione lenta del liquido nel MicroSlide impedisce la formazione di bolle nel canale. </li><li> Profumato 200 ml di acqua calda (37 ° C) HUVEC mezzo di crescita (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml di eparina, 100 pg / ml di fattore di crescita delle cellule endoteliali, e L-glutammina) sul MicroSlide e incubare per 20 min a RT. Durante la perfusione, preparare la sospensione di cellule HUVEC. </li><li> Risciacquare HUVECs con PBS e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare HUVEC in 2 ml di mezzo di crescita a 180 xg per 5 min. </li><li> Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un neubaUER emocitometro e preparare 10 7 HUVEC cells/100 microlitri mezzo di crescita. Poi, rimuovere con attenzione il mezzo dall&#39;ingresso della MicroSlide utilizzando un puntale di 200 microlitri. </li><li> Portare il MicroSlide a livello degli occhi e l&#39;utilizzo di un 1 ml siringa Luer-lock, profumato delicatamente 200 ml di concentrazione preparata del HUVECs nel canale. Si richiede cautela in questa fase per evitare la formazione di bolle. Se compaiono le bolle, tenere perfusione per un tempo leggermente più lungo finché le bolle entrano nel canale di uscita. </li><li> Mettere un volume uguale (~ 80 microlitri) di supporto HUVEC sia l&#39;ingresso e l&#39;uscita del MicroSlide. Ciò impedisce il flusso di celle in entrambe le direzioni. </li><li> Coprire il vetrino e tenerlo in incubatore (37 ° C) per 1,5 ore. </li></ol> 2. Preparazione della camera di flusso dell&#39;Assemblea per Overnight cultura HUVEC su un MicroSlide <ol><li> Inserire una siringa sterile da 20 ml, connettori maschio e femmina Luer, tubi e una pompa a siringa in incubatrice per 15 kmn. </li><li> Per volume morto minimo, utilizzare il tubo con diametro interno di 0,04 pollici. Più piccolo diametro del tubo impedisce la formazione di bolle. </li><li> Riempite la siringa da 20 ml con acqua calda (37 ° C) HUVEC supporto (12 ml). Fissare il tubo con i connettori sulla siringa. Rimuovere le bolle. Collegare questo gruppo alla MicroSlide. </li><li> Riempire completamente l&#39;ingresso della MicroSlide con i media HUVEC. Portare la siringa preriempita da 20 ml collegata al connettore vicino al MicroSlide. Applicare delicatamente il connettore al MicroSlide. </li><li> Portare il set-up in incubatrice e collegarlo alla pompa siringa, fissato a 10 ml / min velocità di taglio. Lasciare le cellule O / N in incubatrice a 37 ° C. </li><li> Il giorno dopo, smontare il set-up rimuovendo il connettore collegato all&#39;ingresso del MicroSlide. </li><li> Per aumentare l&#39;espressione E-selectina sulle cellule endoteliali, preparare il terreno di coltura fresco contenente IL-1β a 10 ng / ml in 4 ml di media. Aspirare i media in una siringa da 10 ml. Rimuovere tegli materiale dal ingresso del MicroSlide e collegare la siringa al vetrino. </li><li> Impostare la pompa a siringa 10 ml / min velocità di taglio per 4 ore in incubatrice. </li></ol> 3. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) con etichetta cellule tumorali della prostata <ol><li> Durante l&#39;IL-1β incubazione di HUVECs, preparare anti-PSMA J591-alexa488 etichettati cellule APC. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA a cellule MDA per 1 min. Non esporre le cellule di tripsina per tempi più lunghi in quanto può influenzare i glicopeptidi presenti sulla superficie cellulare. Enzima reagente dissociazione cellulare libero può anche essere usato al posto di tripsina. Centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet di cellule MDA in 1 ml di H / H tampone (Hanks salina bilanciata solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl 2). Aggiungi anticorpo J591-alexa488 anti-PSMA a 20 mg / ml per 30 min a RT in un luogo buio. Risospendere le cellule durante l&#39;incubazione. </li><li> Dopo 30 minuti, centrifugare la soluzione di cellule a 800 xg per 5 min. Aspivotare e risospendere il pellet in 1 ml di tampone H / H. Contare le cellule MDA etichettati e per portare la concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. Riempire una siringa da 5 ml con J591-488 cellule MDA etichettati e rimuovere le bolle. </li></ol> 4. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) etichetta CTC arricchito da PCa pazienti <ol><li> Raccogliere 7,5 ml di sangue da pazienti affetti da cancro della prostata in un tubo tappo blu (contenente sodio citrato). Diluire delicatamente 1:01 sangue nel 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li> Aggiungere 5.3 ml di Ficoll-Paque più in una provetta da 50 ml. Strato diluito sangue sopra il Ficoll-Paque. Centrifugare a 400 xg per 30 min. </li><li> Pre-coat tutti i tubi o punte entrano in contatto con CTC con 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (buffer R / S) per prevenire il legame non specifico delle CTC alle superfici. Mantenere 4 ° C di temperatura dei media e tamponi che vengono a contatto con CTC. </li><li> Raccogliere il cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) frazionecontenente CTC dall&#39;interfaccia in un&#39;altra provetta conica da 50 ml contenente 30 ml di tampone di R / S. Centrifugare a 400 xg per 8 min. </li><li> Risospendere il pellet e lavare di nuovo nel buffer di R / S a 400 xg per 8 min. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in tampone H / H. Aggiungere anti-PSMA J591-488 anticorpo a 20 ug / ml per 30 min a temperatura ambiente in un luogo buio. </li><li> Dopo 30 minuti, centrifugare le PBMC contenenti J591-488 CTC etichettati a 800 xg per 5 min. Risospendere in tampone H / H. Riempire una siringa da 1 ml (pre-rivestite con tampone R / S) con il campione. </li></ol> 5. Preparazione del microscopio, pompa a siringa e della Camera di flusso Assembly <ol><li> Accendere il microscopio invertito e impostare l&#39;illuminazione Kohler a 10X obiettivo. Portare la pompa a siringa allo stesso livello della fase del campione del microscopio e impostarlo a 1 dyn / cm 2 shear stress (~ 10 microlitri / min). </li><li> Aprire il software Zeiss AxioVision. Selezionare l&#39;obiettivo sullo schermo del computer. Creare un nuovocartella sotto l&#39;opzione strumenti nel software. </li><li> Aprire l&#39;opzione esperimenti intelligenti in AxioVision e regolare le impostazioni di registrare brevi video di 30 secondi per 30 minuti. </li><li> Per il video fluorescente dal vivo, impostare le opzioni-12 msec immagine di esposizione, 2 x 2 bin, 5 Gain. Questi parametri aiutano a raggiungere i video vicino al frame rate video (~ 23 fotogrammi al secondo) con la fotocamera Zeiss MRM. </li><li> Per visualizzare tutta la larghezza del canale di flusso a 10 X obiettivo sullo schermo del computer, utilizzare un adattatore C-mount (0.63 xf/60 mm Interface). </li><li> Accendere la lampada a mercurio. </li><li> Porre la siringa e il connettore contenente le cellule sulla pompa siringa. </li><li> Portare IL-1β stimolato HUVECs dal termostato. Collegare il connettore al canale di ingresso pieno della MicroSlide contenente HUVECs. </li><li> Collegare il canale di uscita con il connettore collegato al tubo. Mettere il tubo in un piatto o tubo 15 ml conica per raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Avviare il Infusiattraverso il MicroSlide a 10 microlitri / min. Osservare le interazioni tra cellule endoteliali e cellule MDA etichettati o etichettati CTC derivati ​​da pazienti al di sotto del filtro 488 nm sul microscopio a epifluorescenza. </li><li> Avviare la registrazione l&#39;esperimento come 30 sec brevi video. Durante l&#39;analisi riproduzione, misurare la velocità di rotazione. Velocità di rotazione si misura dividendo la distanza percorsa dalle cellule nel tempo. </li></ol> 6. Immunocolorazione del MicroSlide <ol><li> Rimuovere il supporto dal ingresso e l&#39;uscita del MicroSlide dopo perfusione cellule MDA su IL-1β-stimolata HUVEC per 10 min. </li><li> Utilizzando una punta di 200 microlitri, mettere calda (37 ° C) PBS contenente calcio e magnesio nella presa del MicroSlide per 5 min. Inclinare il MicroSlide usando il coperchio come un puntello in panchina. Mantenere la MicroSlide in una posizione inclinata per tutte le incubazioni durante immunocolorazione. </li><li> Fissare HUVECs mediante perfusione caldo 2% di formaldeide in ingresso </li><li&gt; incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere triton X-100 (0,1%) in 5% BSA in PBS per 10 minuti a RT. </li><li> Risciacquare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 5% BSA in PBS per 30 min. </li><li> Incubare con anticorpo primario di capra anti-VE-caderina (1:100) nel 2,5% BSA O / N a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo, lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Aggiungi asino secondario anti-goat 647 anticorpo per 45 min. Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno. </li><li> Incubare a RT con umanizzato anticorpo coniugato J591-alexa488 per 1 ora. </li><li> Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno. Aggiungere DAPI per 5 min. Lavare con acqua distillata per 5 minuti. </li><li> Aggiungi PBS (o Mowiol per la conservazione a lungo termine). Visualizza la MicroSlide sotto il microscopio confocale. </li></ol>

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</ol>

Dr. Bander è l&#39;inventore di brevetti che vengono assegnati a Cornell Research Foundation (&quot;CRF&quot;) per l&#39;anticorpo J591 utilizzato in questo articolo. Dr. Bander è un consulente per e possiede azioni in BZL Biologics, la società a cui i brevetti sono stati concessi in licenza da CRF per ulteriore ricerca e sviluppo.

A causa del basso numero di CTC tra cellule del sangue, è difficile isolare CTC come una popolazione pura di cellule. Al fine di studiare le interazioni CTC / CE, la popolazione rara e impura delle CTC pone due sfide importanti: a) identificazione di CTC tra le cellule del sangue; b) Osservazione delle interazioni CTC / CE. Per superare la prima limitazione di identificare CTC prostata tra le cellule del sangue, abbiamo approfittato del fatto che praticamente tutt...

Metastasi è un complesso processo multi-step che rimane poco conosciuta. L&#39;asse ligando E-selectin/selectin ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella metastasi del tumore promuovendo interazioni adesive principali tra l&#39;endotelio vascolare e cellule tumorali 1,2. Endoteliale (E)-selectina è una proteina transmembrana espressa dalle cellule endoteliali attivate, mentre differente ligando E-selectina (s) sono espressi dalle cellule tumorali 3. Numerosi approcci in vitro sono stati impiegati con successo per modellare interazioni ligando E-selectin/selectin tra cellule tumorali e cellule endoteliali (EC) 1. Per studiare queste interazioni, diversi sistemi di camera di flusso vengono impiegati per simulare sistema vascolare sanguigno. Tra assembly camera di flusso, a piatti paralleli camera di flusso (PPFC) in combinazione con EC è abitualmente utilizzato come modello in vitro simulando in condizioni di stress taglio vivo. In questometodo, EC sono coltivate su un piatto da 35 mm e dopo aver ottenuto un monostrato, EC sono attaccati alla PPFC e gli esperimenti shear stress sulla base vengono eseguite. Tuttavia, PPFC e altri sistemi attuali presentano molte limitazioni per studiare le interazioni adesive tra cellule tumorali circolanti (CTC) derivate da pazienti e EC, in primo luogo, perché CTC sono una rara popolazione di cellule, versato dal tumore primario, che circola tra milioni di cellule del sangue (1 CTC per 10 9 cellule ematiche) 4. Quindi, a differenza di fornitura illimitata di linee cellulari in coltura, bassa conta CTC portare ad interazioni molto poche e rare CTC / CE, che richiede un&#39;adeguata larghezza di canale di flusso per registrare le interazioni per l&#39;analisi di riproduzione. Inoltre, dal momento che pazienti CTC derivati ​​sono una popolazione impura, quindi un marcatore di identificazione è necessaria per tenere traccia CTC in specifico. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per identificare il cancro alla prostata (PCA) CTCs approfittando del fatto che la quasi totalità di questi CTC esprimono prostatico specifico antigene di membrana (PSMA) sulla loro superficie cellulare 5,6. In questa relazione, abbiamo utilizzato la linea di cellule di cancro alla prostata, MDA PCa2b (MDA), per dimostrare la potenziale utilità del nostro nuovo sistema per lo studio della prostata interazioni CTC con EC, alla fine di capire il meccanismo di metastasi. La nostra metodologia può essere applicata per vari esperimenti di taglio basato simulano nel sistema di vivo vascolare 7-9. Oltre ad esaminare le interazioni PCa CTC / CE, l&#39;attuale sistema di camera di flusso potrebbe essere facilmente adattato per l&#39;analisi di cellule mononucleari del sangue periferico o interazioni cellule tumorali &quot;con EC. La facilità di smontaggio e rimontaggio della camera di flusso, un MicroSlide III (0,1) (in appresso MicroSlide), permette la coltura EC sotto perfusione e stimolante EC con differenti citochine di indurre protein espressione. Inoltre, colta EC, proteine ​​ricombinanti come la P-selectina-E e possono essere rivestiti sul MicroSlide e le interazioni con le cellule tumorali possano essere rispettati in condizioni di flusso laminare 10.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in plastica</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore Luer maschio</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore Luer femmina</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Mitogeno endoteliale</td><td>Tecnologie biomediche</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Dipartimento di Chirurgia</td><td></td><td>fornito da Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x obiettivo</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare libera da enzimi</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

nel metodo in vitro per osservare le interazioni e-selectina-mediata tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e cellule endoteliali umane

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

La metastasi è un processo in cui le cellule tumorali capannone dal tumore primario intravasate vascolare sangue e del sistema linfatico, in tal modo, l&#39;accesso a estravasare e formare una nicchia secondaria. Il stravaso delle cellule tumorali dal sistema vascolare sanguigno può essere studiata utilizzando cellule endoteliali (EC) e cellule tumorali ottenute da linee cellulari differenti. Gli studi iniziali sono stati condotti utilizzando condizioni statiche, ma si è ben documentato che i CE si comportano in modo diverso in condizioni di flusso fisiologiche. Pertanto, diversi gruppi da camera di flusso sono attualmente utilizzate per studiare le interazioni delle cellule cancro con EC. Assemblee camera di flusso attuali offrono risultati riproducibili utilizzando sia linee cellulari diversi o fluido a differenti condizioni di stress di taglio. Tuttavia, per osservare e studiare le interazioni con cellule rare come cellule tumorali circolanti (CTC), sono necessarie alcune modifiche da apportare al gruppo di camera di flusso convenzionale. CTCsono una popolazione di cellule rare tra milioni di cellule del sangue. Di conseguenza, è difficile ottenere una popolazione pura di CTC. Contaminazione delle CTC con diversi tipi di cellule che normalmente si trovano in circolazione è inevitabile utilizzare presente arricchimento o tecniche di esaurimento. Nel presente rapporto, descriviamo un metodo unico per etichette circolanti cellule tumorali della prostata modo fluorescente e studiare le loro interazioni con EC in un sistema di camera di flusso auto-assemblati. Questa tecnica può essere ulteriormente applicato ad osservare le interazioni tra CTC prostata e qualsiasi proteina di interesse.

La Figura 1 mostra una cultura O / N di un monostrato di cellule endoteliali sulla MicroSlide. I valori di scala sulla figura 1A mostra che il 100% del MicroSlide è visibile usando obiettivo 5X mentre il 70% è visibile usando un obiettivo 10X (Figura 1B). Per interazioni E-selectina mediata, cellule rotolamento ai bordi non sono considerati che rende più del 70% del MicroSlide disponibile per il video-registrazione e analisi riproduzione. Nella nostra esperienza, inizia...

Il nostro rapporto descrive un metodo unico per visualizzare e analizzare le interazioni CTC / CE del cancro della prostata in condizioni di flusso fisiologiche.

Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare le interazioni tra cellule rare di cancro alla prostata e cellule endoteliali che esprimono e-selettina, utilizzando un dispositivo di flusso a microscorrimento. Questo viene realizzato innanzitutto rivestendo un microscorrimento con fibronectina. Il secondo passaggio consiste nel coltivare cellule endoteliali venose dell'ombelico umano o VE in un sistema di flusso dinamico su un microscorrimento con una larghezza del canale ridotta.Successivamente, le cellule del cancro alla prostata vengono marcate con un anticorpo monoclonale umanizzato anti antigene specifico della membrana prostatica, o PSMA, che viene internalizzato. L'ultimo passaggio consiste nel perfondere le cellule del cancro alla prostata marcate con l'anti-PSMA sulle cellule endoteliali che esprimono e-selectina. Infine, la microscopia video viene utilizzata per mostrare le interazioni tra le cellule del cancro alla prostata e le cellule endoteliali.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la camera a flusso a piastre parallele e altri dispositivi dinamici, è che con questa tecnica è possibile esaminare le interazioni tra cellule rare di cancro alla prostata, come le cellule tumorali circolanti, e cellule endoteliali coltivate in un sistema di flusso dinamico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi, ad esempio: come fanno le cellule tumorali della prostata a metastatizzare attraverso il sistema vascolare sanguigno? Utilizzano lo stesso meccanismo impiegato dai leucociti durante la loro emigratasi?Generalmente, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà poiché essa richiede la coltura di un monostrato di cellule endoteliali in un canale stretto sotto perfusione all'interno dell'incubatore per colture cellulari. Per prima cosa, risciacquare la microcamera con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS. Quindi, ricoprire delicatamente la microcamera con 200 microlitri di fibronectina 50 microgrammi per millilitro utilizzando una siringa da un millilitro con connettore a baionetta.Coprire il vetrino con il coperchio e mantenerlo all'interno della cappa a flusso laminare per 30 minuti. Successivamente, perfondere 200 microlitri di mezzo di crescita qve tiepido sul vetrino e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Un'erogazione lenta del liquido sul vetrino evita la formazione di bolle nel canale.Durante la perfusione, preparare la sospensione di vex lavando i vex con PBS e aggiungendo 0,1% di collaghenasi più 0,05% di EDTA in PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Centrifugare gli hve in due millilitri di mezzo di crescita a 180 ×g per cinque minuti. Quindi misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e preparare 10 milioni di cellule per 100 microlitri di mezzo di crescita.Successivamente, rimuovere con attenzione il mezzo dall'ingresso della microcamera. Utilizzando una punta da pipetta da 200 microlitri, portare la microcamera all'altezza degli occhi e, con una siringa da un millilitro dotata di blocco a vite, perfondere delicatamente 200 microlitri della concentrazione preparata di vex nel canale. È necessaria cautela in questo passaggio per evitare la formazione di bolle; se dovessero apparire bolle, continuare la perfusione per un tempo leggermente più lungo finché le bolle non entrano nel canale di uscita.Successivamente, pipettare un volume uguale di circa 80 microlitri di mezzo VE sia nell'ingresso che nell'uscita della microcamera. Questo impedisce il flusso di cellule in entrambe le direzioni. Coprire la camera e mantenerla in un incubatore a 37 gradi Celsius per 1,5 ore.Per iniziare il montaggio della camera a flusso, posizionare una siringa sterile da 20 millilitri, connettori femmina e maschio a baionetta, una pompa per siringa e il tubo nell'incubatrice per 15 minuti per ridurre al minimo il volume morto. Utilizzare tubi con un diametro interno di 0,04 pollici. Un diametro del tubo più piccolo previene la formazione di bolle.Successivamente, riempire la siringa da 20 millilitri con 12 millilitri di mezzo VE tiepido. Rimuovere completamente la bolla dalla siringa. Riempire l'ingresso della microcamera con mezzo VE.Collegare questo montaggio alla lamella microscopica. Attaccare delicatamente il connettore di uscita alla lamella microscopica. Portare l'apparato nell'incubatrice e collegarlo alla pompa per siringa.Quindi impostare la pompa su un tasso di taglio di 10 microlitri al minuto prima di lasciare le cellule durante la notte nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo smontare l'apparato rimuovendo il connettore collegato all'ingresso della microcamera. Quindi rimuovere il connettore di uscita da due a per aumentare l'espressione di e-selectina sulle cellule endoteliali.Preparare un mezzo di crescita fresco contenente interleuchina uno beta. Aspirare il mezzo in una siringa da 10 millilitri. Rimuovere il mezzo residuo dall'ingresso della camera, quindi aggiungere mezzo fresco riempiendo completamente l'ingresso.Collegare la siringa al vetrino. Impostare la pompa per siringa a un flusso di 10 microlitri al minuto per quattro ore nell'incubatore durante l'incubazione con interleuchina uno beta di vex, preparare cellule tumorali della prostata marcate con anticorpo anti-PSMA Alexa 488. Per prima cosa, aggiungere tripsina EDTA 0,05% alle cellule tumorali della prostata MDA per un minuto.Non esporre le cellule alla tripsina per periodi più lunghi poiché ciò può influenzare i glicopeptidi presenti sulla superficie cellulare. Centrifugare le cellule a 200 ×g per cinque minuti. Successivamente, risospendere il palato cellulare MDA in un millilitro di soluzione tampone di Hank e aggiungere l'anticorpo anti-PSMA; incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio, risospendendo le cellule durante l'incubazione.Dopo 30 minuti, centrifugare la soluzione cellulare a 800 ×g per cinque minuti. Aspirare e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di Hank. Contare le cellule MDA marcate e portare la concentrazione finale a 1 milione di cellule per millilitro.Riempire una siringa da cinque millilitri con le cellule MDA marcate ed eliminare le bolle d'aria. Accendere il microscopio invertito e impostare l'illuminazione a curler sull'obiettivo 10x. Posizionare la pompa per siringa allo stesso livello della piastra del campione del microscopio e regolarla a uno dime per centimetro quadrato di sollecitazione al taglio.Successivamente, aprire il software Zeiss Axio Vision. Selezionare l'obiettivo sullo schermo del computer. Creare una nuova cartella nell'opzione strumenti del software.Aprire l'opzione smart experiments in Axio Vision e regolare le impostazioni per registrare brevi video di 1/32 di secondo per 30 minuti. Per il video in fluorescenza in tempo reale, impostare le opzioni dell'immagine. Questi parametri consentono di ottenere video vicini alla frequenza dei fotogrammi con la telecamera Zeiss MRM per visualizzare a piena larghezza il canale di flusso con un obiettivo 10x sullo schermo del computer; utilizzare un adattatore con attacco CM e accendere la lampada a mercurio prima di posizionare la siringa e il connettore contenente le cellule sulla pompa per siringhe. Successivamente, collegare il connettore al canale di ingresso riempito della microslitta contenente l'asse stimolato da interleuchina uno beta.Collegare il canale di uscita con il connettore fissato al tubo. Posizionare il tubo in una piastra o in una provetta conica da 15 millilitri per raccogliere il flusso in uscita. Avviare l'infusione attraverso il microvetrino a 10 microlitri al minuto.Osservare le interazioni tra cellule endoteliali e cellule MDA marcate o CTC marcate derivate da pazienti a 488 nanometri. Filtrare al microscopio a fluorescenza episcopica. Iniziare a registrare l'esperimento come 32 brevi video.Durante l'analisi della riproduzione, misurare la velocità di rotolamento. La velocità di rotolamento viene misurata dividendo la distanza percorsa dalle cellule nel tempo. Qui è mostrata una coltura di un monocstrato di cellule endoteliali incubata per tutta la notte.Sul vetrino. Le scale indicano che il 100% del vetrino è visibile utilizzando un obiettivo 5x, mentre il 70% è visibile con un obiettivo 10x; per le interazioni mediate selezionate, le cellule che rotolano ai margini non vengono considerate, rendendo disponibile per l'analisi mediante registrazione e riproduzione video oltre il 70% del vetrino. Il grafico a scatola (box plot) mostra la distribuzione delle velocità di rotolamento sia delle cellule MDA non marcate che di quelle marcate con anti-PSMA, su cellule endoteliali stimolate con interleuchina-1β in diverse condizioni di stress di taglio.Non &egrave; stata osservata alcuna differenza significativa nelle velocit&agrave; di rotolamento a uno e cinque cellule per centimetro quadrato a stress di taglio pi&ugrave; elevati di 10 cellule per centimetro quadrato. &Egrave; stata osservata una differenza statisticamente significativa tra le velocit&agrave; di rotolamento delle cellule MDA non marcate e quelle marcate con anti-PSMA. Un video composito temporale, acquisito utilizzando sangue proveniente da un paziente affetto da cancro alla prostata, mostra tre tipi di interazioni tra CTC della prostata marcate e cellule endoteliali esprimenti lectina: aggancio, in cui le CTC si attaccano e si riattaccano; adesione stabile, in cui le CTC non si staccano nemmeno dopo 30 secondi; e assenza di interazioni, quando CTC non interagenti entrano nel campo visivo. I microscopici possono essere facilmente sottoposti a immunomarcatura e analizzati mediante microscopia fluorescente per evidenziare l'adesione ferma delle cellule MDA marcate con anti-PSMA.Dopo la profusione su cellule endoteliali stimolate con interleuchina uno beta, si possono osservare qui. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esaminare le interazioni tra cellule rare, come le cellule tumorali prostatiche circolanti, e le cellule endoteliali esprimenti S-selettina seguendo questo procedimento. Altri metodi, come l'immunofluorescenza, possono essere eseguiti anche per rispondere ad ulteriori domande, come la presenza di ligandi della S-selettina.Tecniche di questo tipo possono aiutare i ricercatori a comprendere i diversi passaggi coinvolti nella metastasi.

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