Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare le interazioni tra le cellule rare di cancro alla prostata e le cellule endoteliali che esprimono la selectina e utilizzando un gruppo di flusso di micro vetrini. Ciò si ottiene rivestendo prima un micro vetrino con fibronectina. Il secondo passo consiste nel coltivare cellule endoteliali della vena ombelicale umana o VE in un sistema a flusso dinamico su un micro vetrino con una larghezza del canale ridotta.

Successivamente, le cellule tumorali della prostata vengono etichettate con un antigene di membrana specifico per la prostata o un anticorpo monoclonale umanizzato PSMA, che viene internalizzato. Il passo finale consiste nel perfondere le cellule tumorali della prostata marcate anti PSMA sopra la e selectina che esprime ve. In definitiva, la microscopia video viene utilizzata per mostrare le interazioni tra le cellule tumorali della prostata e le cellule endoteliali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la camera a flusso a piastre parallele e altri assemblaggi dinamici, è che con questa tecnica è possibile esaminare le interazioni tra cellule tumorali rare della prostata, come le cellule tumorali circolanti e le cellule endoteliali in coltura in un sistema a flusso dinamico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi, ad esempio come fanno le cellule tumorali della prostata a metastatizzare attraverso il sistema vascolare sanguigno? Usano lo stesso meccanismo utilizzato dai leucociti durante la loro izzazione?

In generale, gli individui che sono nuovi a questa tecnica avranno difficoltà perché comporta la coltura di un monostrato di cellule endoteliali in un canale stretto sotto perfusione sotto il cappuccio di coltura tissutale. Per prima cosa, sciacquare il microvetrino con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Quindi rivestire delicatamente il micro vetrino con 200 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di fibronectina utilizzando una siringa di blocco dell'esca da un millilitro.

Coprire il microvetrino con il coperchio e tenerlo all'interno della cappa di coltura tissutale per 30 minuti. Quindi, perfondere 200 microlitri di terreno di coltura qve caldo sul micro vetrino e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. L'erogazione lenta del liquido nel micro scivolo impedisce la formazione di bolle nel canale.

Durante la perfusione, preparare la sospensione vex sciacquando vex con PBS e aggiungendo lo 0,1% di collagenasi più lo 0,05% di EDTA in PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Centrifugare il contenuto in due millilitri di terreno di coltura a 180 volte G per cinque minuti. Quindi misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e preparare 10 milioni di cellule per 100 microlitri di terreno di crescita.

Quindi, rimuovere con cautela il fluido dall'ingresso del micro vetrino. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, portare il micro vetrino all'altezza degli occhi e utilizzando una siringa di blocco dell'esca da un millilitro perfò delicatamente 200 microlitri della concentrazione preparata di vex nel canale. In questa fase è necessario prestare attenzione per evitare la formazione di bolle se compaiono le bolle, continuare a perfondere per un tempo leggermente più lungo fino a quando le bolle non entrano nel canale di uscita.

Quindi pipettare un volume uguale di circa 80 microlitri di terreno VE sia all'ingresso che all'uscita del micro vetrino. Ciò impedisce il flusso di celle in entrambe le direzioni. Coprire il vetrino e tenerlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 1,5 ore.

Per iniziare l'assemblaggio della camera di flusso, posizionare una siringa sterile da 20 millilitri, i connettori per esche femmina e maschio, una pompa a siringa e un tubo nell'incubatore per 15 minuti per un volume morto minimo. Tubi usati con un diametro interno di 0,04 pollici. Il diametro del tubo più piccolo impedisce la formazione di bolle.

Quindi, riempire la siringa da 20 millilitri con 12 millilitri di terreno VE caldo. Rimuovere completamente la bolla dalla siringa. Riempire l'ingresso del micro vetrino con VE medium.

Collegare questo gruppo alla micro slitta. Fissare delicatamente il connettore di uscita alla micro slitta. Portare la configurazione nell'incubatore e collegarla alla pompa a siringa.

Quindi impostare la pompa a una velocità di taglio di 10 microlitri al minuto prima di lasciare le cellule durante la notte nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo smontare l'impianto rimuovendo il connettore collegato all'ingresso della micro slitta. Quindi rimuovere il connettore di uscita due per sovraregolare l'espressione della selectina sulle cellule endoteliali.

Preparare un terreno di coltura fresco contenente interleuchina uno beta. Aspirare il terreno in una siringa da 10 millilitri. Rimuovere il terreno rimanente dall'ingresso del vetrino, quindi aggiungere il terreno fresco riempiendo completamente l'ingresso.

Collegare la siringa al vetrino. Impostare la pompa a siringa a una velocità di taglio di 10 microlitri al minuto per quattro ore nell'incubatrice durante l'incubazione dell'interleuchina una beta di vex, preparare cellule tumorali della prostata marcate con anticorpi anti PSMA Alexa 4 88. Innanzitutto, aggiungi lo 0,05% di tripsina EDTA alle cellule tumorali della prostata MDA per un minuto.

Non esporre le cellule alla tripsina per tempi più lunghi in quanto può influenzare i glicopeptidi presenti sulla superficie cellulare. Centrifugare le celle a 200 volte G per cinque minuti. Successivamente, risospendere il palato cellulare MDA in un millilitro di Hank's Buffer e aggiungere l'incubazione dell'anticorpo anti PSMA per 30 minuti a temperatura ambiente in un luogo buio, sospendendo nuovamente le cellule durante l'incubazione.

Dopo 30 minuti, centrifugare la soluzione cellulare a 800 volte G per cinque minuti. Aspirare e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di Hank. Conta le cellule MDA marcate e porta la concentrazione finale a 1 milione di cellule per millilitro.

Riempi una siringa da cinque millilitri con le cellule MDA etichettate e rimuovi le bolle. Accendere il microscopio invertito e impostare l'illuminazione del bigodino su 10 x obiettivo. Portare la pompa a siringa allo stesso livello del tavolino del campione del microscopio e impostarla a una centesima per centimetro quadrato di sforzo di taglio.

Quindi, apri il software di visione Zeiss Axio. Seleziona l'obiettivo sullo schermo del computer. Crea una nuova cartella sotto l'opzione strumenti nel software.

Apri l'opzione esperimenti intelligenti in Axio vision e regola le impostazioni per registrare brevi video del 32° per 30 minuti Per i video fluorescenti dal vivo, imposta le opzioni dell'immagine. Questi parametri aiutano a ottenere video vicini alla frequenza dei fotogrammi video con la telecamera Zeiss MRM per visualizzare l'intera larghezza del canale di flusso a 10 x obiettivo sullo schermo del computer, utilizzare un interruttore adattatore per montaggio CM sulla lampada al mercurio prima di posizionare la siringa e il connettore contenente le cellule sulla pompa a siringa. Quindi, collegare il connettore al canale di ingresso riempito del micro vetrino contenente interleuchina un'ascia beta stimolata.

Collegare il canale di uscita con il connettore collegato al tubo. Metti il tubo in un piatto o in un tubo conico da 15 millilitri per raccogliere il flusso. Iniziare l'infusione attraverso il micro vetrino a 10 microlitri al minuto.

Osservare le interazioni tra le cellule endoteliali e le cellule MDA marcate o CTC marcate derivate da pazienti di età inferiore a 488 nanometri. Filtrare sul microscopio a epifluorescenza. Inizia a registrare l'esperimento come 32° breve video.

Durante l'analisi della riproduzione, misurare la velocità di rotolamento. La velocità di rotolamento viene misurata dividendo la distanza percorsa dalle celle nel tempo. Qui è mostrata una coltura notturna di un monostrato di cellule endoteliali.

Sulla micro diapositiva. Le scale mostrano che il 100% del micro vetrino è visibile utilizzando un obiettivo cinque x mentre il 70% è visibile utilizzando un obiettivo 10 x per interazioni mediate selezionate, le cellule che rotolano ai bordi non sono considerate, il che rende disponibile oltre il 70% del micro vetrino per la registrazione video e l'analisi della riproduzione. Il box plot mostra la distribuzione delle velocità di rotolamento delle cellule MDA marcate sia non marcate che anti PSMA su cellule endoteliali stimolate con interleuchina e beta a diverse condizioni di stress di taglio.

Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle velocità di rotolamento a un centimetro quadrato e cinque dines con uno stress puro più elevato di 10 centesimi per centimetro quadrato. È stata osservata una differenza statisticamente significativa tra le velocità di rotolamento delle cellule MDA non marcate e anti PSMA, marcate, Un video ricucito a tempo ripreso utilizzando il sangue di un paziente con cancro alla prostata mostra tre tipi di interazioni tra le CTC prostatiche marcate e le cellule endoteliali che esprimono lectina in cui le CTC si attaccano e si riattaccano, un'adesione stabile in cui le CTC non si staccano nemmeno dopo 30 secondi e nessuna interazione quando le CTC non interagenti entrano nel campo visivo. I micro vetrini possono essere facilmente colorati in modo immuno e riprodotti in modo fluorescente per l'adesione salda delle cellule MDA anti PSMA, marcate.

Dopo la profusione sull'interleuchina, qui si possono vedere una cellula endoteliale beta stimolata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare le interazioni tra cellule rare come le cellule tumorali della prostata circolanti e le cellule endoteliali che esprimono la selectina S seguendo questa procedura. Altri metodi come l'immunofluorescenza possono essere eseguiti anche per rispondere a ulteriori domande come la presenza di s selectina. Ligandi.

Tecniche come queste possono aiutare i ricercatori a comprendere i diversi passaggi coinvolti nelle metastasi.