Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

L'obiettivo generale di questa procedura è creare microarray di membrane biologiche utilizzando un metodo di preparazione semplice. Questo viene ottenuto innanzitutto rivestendo delle perle di silice con membrane a doppio strato lipidico. Il secondo passaggio della procedura consiste nel depositare le perle rivestite di lipidi sul substrato di micropozzetti in silicone.

Il terzo passaggio consiste nel rimuovere le perline non presenti nei micropozzetti, utilizzando una spatola in polimetilsubossido. L'ultimo passaggio è acquisire immagini degli array di perline rivestite di lipidi mediante microscopia a fluorescenza. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per determinare le costanti di legame delle interazioni tra tossine e lipidi mediante un approccio di imaging degli array.

Questo metodo può essere utilizzato per creare array di bicapidi lipidici sferici supportati e di particelle di membrane naturali derivate da cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che, a parte la fabbricazione delle micropozzette, la tecnica non richiede alcuna modifica chimica né del substrato né delle membrane lipidiche per creare array di membrane biologiche spazialmente definiti. Le applicazioni di questa tecnica possono essere estese al rilevamento senza marcatura delle interazioni tra lipidi e proteine mediante risonanza plasmonica superficiale basata su array nanostrutturati di fori metallici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra lipidi e proteine, può essere applicato anche ad altri sistemi, come gli studi sull'adesione focale cellulare. Le preparazioni di matrici a pozzetti microscopici e di dispositivi a raschia sono descritte dettagliatamente nel protocollo testuale. Questo video inizia con la preparazione delle vescicole. Per prima cosa, in un piccolo vial di vetro, mescolare i lipidi componenti delle vescicole.

In totale, mezzo milligrammo di lipidi è presente in questa soluzione; sottoporre la miscela a essiccazione sotto vuoto per sei ore. Successivamente, preparare una soluzione 0,1 molare di cloruro di sodio e aggiungere mezzo millilitro ai lipidi essiccati. Lasciare incubare la miscela tutta la notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, vortexare la miscela per sospendere le vescicole. Successivamente, sottoporre la miscela a sonicazione per 20 minuti in un bagno a ultrasuoni, a temperatura ambiente. Al termine della sonicazione, passare la sospensione attraverso un filtro in membrana di policarbonato da 100 nanometri.

Filtrare la sospensione attraverso il filtro ad estrusione per un totale di 17 volte. Successivamente, conservare le vescicole estruse in un vial di vetro a quattro gradi Celsius. Utilizzando inizialmente sfere di biossido di silicio con diametro di 700 nanometri.

Preparare una sospensione di 15 miliardi di microsfere in cloruro di sodio 0,1 molare. Agitare la sospensione con un vortex e quindi centrifugarla a 1700 G per 20 minuti, scartando il soprannatante. Ripetere il lavaggio risospendendo le microsfere in un altro millilitro di soluzione salina e centrifugandole nuovamente per altri 20 minuti.

Quindi ripetere il processo una terza volta per formare i bilayer lipidici sferici supportati o SSB. Mescolare 25 microlitri della sospensione di perline di biossido di silicio con 200 microlitri della sospensione di vescicole della sezione precedente. Vortexare la miscela e lasciarla incubare a temperatura ambiente per un'ora; successivamente, centrifugare la miscela a 1700 G per 20 minuti.

Eliminare il soprannatante. Il pellet è di colore rosa a causa delle vescicole rotte con DPPE disposto in fila sulle perle. Sospendere nuovamente in 225 microlitri di PBS a pH 7,4.

Ripetere due volte le fasi di centrifugazione e risospensione per rimuovere le vescicole non rotte e completare la formazione dei SSB. Dividere le wafer degli array di micropozzetti in pezzi rettangolari contenenti da quattro a sei array ciascuno. Successivamente, vortexare la sospensione di SSLB della sezione precedente e trasferire 10 microlitri in ciascun array di micropozzetti.

Attendere un'ora affinché gli SSB si depositino successivamente. Lavare delicatamente le chip dell'array con PBS ed immergere l'array in PBS utilizzando la spatola di gomma, passandola sulla superficie delle chip immerse cinque volte. Questo passaggio rimuove gli SLP che non si trovano all'interno dei micropozzi.

Successivamente, afferrare ogni chip dell'array con pinzette e scuotere delicatamente per rimuovere il PBS. Trasferirlo quindi in un nuovo bagno di PBS. Le superfici superiori dei chip devono rimanere umide.

Rimuovere un chip dal bagno e asciugare. Eliminare la maggior parte del PBS con un panno da laboratorio. Lasciare una quantità sufficiente di PBS per mantenere l'array idratato.

Ora aggiungere 200 microlitri di soluzione di BSA all'array per bloccare il legame non specifico. Lasciare incubare l'array per un'ora. In una scatola umidificata, rimuovere successivamente la BSA con una micropipetta e aggiungere 200 microlitri di soluzione di tossina colerica.

Quindi reinserire l'array nella camera umidificata. Attendere un'ulteriore ora, quindi lavare l'array con PBS ed asciugare l'eccesso di PBS utilizzando un panno assorbente. Successivamente, posizionare il chip dell'array su un vetrino da microscopia standard e applicare un coprioggetto quadrato di 24 per 40 millimetri sull'array, quindi procedere con l'acquisizione delle immagini.

L'analisi delle immagini può essere eseguita con le funzioni di analisi automatica delle particelle di ImageJ. Successivamente, per ogni array, riassumere le intensità medie dei singoli SSB come istogrammi. Dopo aver utilizzato i metodi descritti, un'area quadrata di 100 micron su un array mostra 936 SSB.

Mentre i dati di occupazione sono stati calcolati e un istogramma delle intensità fluorescenti di SSLB è stato generato dopo una settimana di conservazione, lo stesso array è stato riesaminato nello stesso modo, senza alcun cambiamento nelle intensità fluorescenti o nell'occupazione dell'array. La deposizione sequenziale di diversi SSB con marcatori identificativi differenti è stata inoltre possibile mediante i metodi descritti.

I secondi SSB sono stati depositati a un decimo della concentrazione dei primi SSB depositati. È mostrata una sovrapposizione di entrambi i marcatori per un esperimento.

Gli array sono stati realizzati con SSB contenenti varie concentrazioni di GM uno ed esposti a una concentrazione fissa di tossina colerica. È stata inoltre effettuata l'operazione inversa per determinare la costante di dissociazione all'equilibrio per GM uno.

Le matrici di legame della tossina colerica possono essere realizzate anche a partire da membrane biologiche naturali, come questa matrice composta da particelle di mielina. È marcata con il fluorocromo lipofilico FM 1-43. I raft lipidici sono arricchiti in colesterolo e gangliosidi come il GM1.

Pertanto, la tossina colerica coniugata con Alexa 488 si lega fortemente agli array di microdomini lipidici, mentre l'adenovirus marcato con fluorocromo non si lega a questi array. Un array è stato realizzato consegnando mielina e microdomini lipidici ai micropozzetti tramite un chip microfluidico con canali da 250 micron. L'array è stato marcato con IgM anti-oligodendrocita e il gruppo S-solfuro presente nella mielina è stato etichettato, mentre i microdomini lipidici non lo sono stati.

Non appena i microsfera rivestiti di lipidi sono stati preparati. Questa tecnica può essere utilizzata per preparare schiere in un'ora se eseguita correttamente, dopo la creazione di schiere di particelle di membrana naturale. Altri metodi come la superficie nano-forata a risonanza plasmonica possono essere utilizzati per il rilevamento senza marcatura delle interazioni biomolecolari.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare array di membrane biologiche utilizzando microsfere rivestite con uno strato lipidico bilaminare e particelle di membrane naturali.