Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare microarray di biomembrane utilizzando un semplice metodo di preparazione. Ciò si ottiene rivestendo prima le perle di silice con membrane a doppio strato lipidico. Il secondo passo della procedura consiste nel depositare le perle rivestite di lipidi sul substrato del micropozzetto in silicone.

Il terzo passo consiste nel rimuovere le perle non nei micro pozzetti, utilizzando una spatola in polimetilsuboxano. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare gli array di microsfere rivestite di lipidi con la microscopia a fluorescenza. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per determinare le costanti di legame per le interazioni lipidiche delle tossine utilizzando un approccio di imaging array.

Questo metodo può essere utilizzato per creare matrici di doppi strati lipidici sferici supportati e particelle di membrana naturali derivate dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che, a parte la fabbricazione dei micropozzetti, la tecnica non richiede alcuna modifica chimica né del substrato né delle membrane lipidiche per creare array di biomembrane spazialmente definiti. Le applicazioni di questa tecnica possono essere estese alla rilevazione senza marcatura delle interazioni tra proteine lipidiche utilizzando plasma superficiale e risonanza basata su array di lacune metalliche nanometriche.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra le proteine lipidiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come gli studi sull'adesione focale cellulare, gli array di micro pozzetti e le preparazioni di tergivetri sono dettagliati nel protocollo di testo. Questo video inizia con la preparazione delle vescicole. Prima in una piccola miscela di fiale di vetro, i lipidi componenti per le vescicole.

Un totale di mezzo milligrammo di lipidi è in questa soluzione sotto vuoto essiccare la miscela per sei ore. Quindi, prepara una soluzione di cloruro di sodio 0,1 molare e aggiungi mezzo millilitro ai lipidi essiccati. Lasciare incubare la miscela per una notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, agitare la miscela per sospendere le vescicole. Quindi sonicare la miscela per 20 minuti in un bagno, sonicare a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, estrudere la sospensione attraverso un filtro a membrana in policarbonato da 100 nanometri.

Far passare la sospensione attraverso il filtro di estrusione per un totale di 17 volte. Quindi conservare le vescicole estruse in una fiala di vetro a quattro gradi Celsius. Per prima cosa utilizzando perle di biossido di silicio di 700 nanometri di diametro.

Realizzare una sospensione di 15 miliardi di perline in cloruro di sodio 0,1 molare. Agitare la sospensione e poi centrifugarla a 1700 Gs per 20 minuti e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio a risu, sospendendo le perle in un altro millilitro di soluzione salina e facendole girare per altri 20 minuti.

Quindi ripetere il processo una terza volta per formare i doppi strati lipidici sferici supportati o SSB. Mescolare 25 microlitri della sospensione di perle di biossido di silicio con 200 microlitri della sospensione vescicola della sezione precedente. Agitare la miscela e accenderla, incubare a temperatura ambiente per un'ora dopo, centrifugare la miscela a 1700 Gs per 20 minuti.

Scartare il surnatante. Il pellet è rosa alle vescicole rotte con DPPE di fila sulle perline. Risospenderlo in 225 microlitri di PBS a PH 7,4.

Ripetere due volte i passaggi di sospensione di spin e Resus per rimuovere le vescicole non rotte e completare la creazione degli SSB. Dividi i wafer di array di micro pozzetti in pezzi rettangolari con quattro o sei array ciascuno. Successivamente, vortice, la sospensione SSLB della sezione precedente e trasferisci 10 microlitri a ciascun array di micro pozzetti.

Attendi un'ora che gli SSB si stabilizzino più tardi. Lavare delicatamente i chip dell'array con PBS e immergere l'array nel PBS utilizzando la spatola che scivola sulla superficie dei chip sommersi cinque volte. Questo rimuove gli SLP non all'interno dei micro pozzetti.

Quindi, afferra ciascun chip dell'array con una pinzetta e scuoti delicatamente il PBS. Quindi trasferiscilo in un bagno PBS fresco. Le superfici superiori dei trucioli devono rimanere bagnate.

Togliete un chip dalla vasca e allontanatelo. La maggior parte dei PBS con una salvietta da laboratorio. Lascia abbastanza PBS per mantenere idratato l'array.

Ora aggiungi 200 microlitri di soluzione BSA all'array per bloccare il legame non specifico. Lasciare incubare l'array per un'ora. In una scatola umidificata in seguito, rimuovere il BSA con una micropipetta e aggiungere 200 microlitri di soluzione di tossina del colera.

Quindi rimettere l'array nella camera umidificata. Attendi un'altra ora, quindi lava l'array con PBS e rimuovi il PBS in eccesso con una salvietta per le gambe. Quindi posizionare il chip dell'array su un vetrino per microscopia standard e collegare un vetrino coprioggetto quadrato di 24 x 40 millimetri all'array e procedere con l'imaging.

L'analisi delle immagini può essere eseguita con le funzioni di analisi automatizzata delle particelle J.Image. Quindi, per ogni array, riassumi le intensità medie dei singoli SSB come istogrammi. Dopo aver utilizzato i metodi descritti, un'area quadrata di 100 micron su un array mostra 936 SSB.

Mentre i dati sull'occupazione sono stati calcolati e un istogramma delle intensità fluorescenti SSLB è stato generato dopo una settimana di stoccaggio. Lo stesso array è stato rianalizzato nello stesso modo e non vi è stato alcun cambiamento nell'intensità della fluorescenza o nell'occupazione dell'array. Con i metodi descritti è stata possibile anche la deposizione sequenziale di diversi SSB con diversi marcatori identificativi.

I secondi SSB sono stati depositati a un decimo. La concentrazione dei primi SSB depositati. Per un esperimento viene mostrata una sovrapposizione di entrambi i marcatori.

Gli array sono stati realizzati con SSB con varie concentrazioni di GM one ed esposti a una concentrazione fissa di tossina del colera. L'inversa è stata eseguita anche per determinare la costante di dissociazione di equilibrio. Per GM uno.

Gli array leganti la tossina del colera possono anche essere realizzati con biomembrane naturali, come questo array costituito da particelle di mielina. È etichettato con fluoro lipofilo quattro FM 1 43. I raft lipidici sono arricchiti di colesterolo e gangliosidi come quello GM.

Così Alexa 4 88 tossina di colera coniugata si lega fortemente ai microarray di zattere lipidiche per contrasto, Aden spogliato marcato in fluorescenza non si lega a questi array. È stato realizzato un array erogando zattere di mielina e lipidi ai micro pozzetti tramite un chip microfluidico con canali da 250 micron. Era marcato con IgM anti oligodendrociti e il solfuro S trovato nella mielina era marcato, ma i lipidi non lo erano.

Non una volta preparate le perle rivestite di bator lipidico. Questa tecnica può essere utilizzata per preparare array in un'ora se eseguita correttamente, dopo la creazione di array di particelle di membrana naturale. Altri metodi, come il plasma superficiale a nano fori e la risonanza, possono essere utilizzati per il rilevamento senza marcatura delle interazioni biomolecolari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare matrici di biomembrane utilizzando perle rivestite di strato biliare lipidico e particelle di membrana naturali.