Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all'interno di una piattaforma di array Microwell

L'obiettivo generale di questo metodo è l'analisi parallela ad alto rendimento di comunità microbiche multi-membro in ambienti confinati utilizzando array di micro pozzetti in silicio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente uno screening altamente parallelo ad alta produttività di interazioni microbiche finemente localizzate che sono significative per l'industria, la medicina e l'ambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia biomedica e microbica, come ad esempio in che modo i vincoli spaziali inerenti alle scale fini guidano i parametri deterministici e stocastici dello sviluppo della comunità e quali sono gli effetti chiave sull'abbondanza e l'organizzazione dei membri microbici?

Iniziare con la preparazione degli array di micro pozzetti. Innanzitutto, tagliare i singoli chip di micro well array da wafer di silicio stampati con più array utilizzando uno scriba a diamante. Ogni singolo chip contiene sottoarray di pozzetti con diametri che vanno da cinque a 100 micron a tre diverse densità di spaziatura.

Su ogni chip, il motivo completo dei pozzetti viene ripetuto quattro volte. Quindi, crea una camera umidificata usando una scatola di puntali per pipette e una salvietta imbevuta di PBS. Quindi applicare una goccia da 150 microlitri di soluzione BSA su ciascun chip e incubare i chip nella scatola per un'ora a temperatura ambiente.

Nel frattempo preparate i batteri. Centrifugare una coltura e risospenderla in 500 microlitri di terreno R2A fresco con il due percento di glicerolo. Quindi misurare la densità di coltura a 600 nanometri e regolare la concentrazione su una densità ottica di 0,02.

Dopo l'incubazione del chip, rimuovere la soluzione BSA e sciacquare i chip tre volte con PBS. Dopo i risciacqui, asciugare i trucioli con azoto gassoso e rimetterli nella camera umidificata. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di sospensione di coltura a ciascun chip secco e incubare i chip per un'ora a quattro gradi Celsius in modo che i batteri abbiano il tempo di aderire ai pozzetti, ma la divisione cellulare di qualsiasi possibile contaminazione è lenta.

Per preparare un chip per l'imaging, prima crea un vetrino coprioggetti rivestito di agarosio per ogni chip. Liquefare un piccolo volume di agarosio, circa cinque millilitri sono necessari per ogni vetrino coprioggetto. Quindi, lavare un lato di un vetrino coprioggetti con etanolo e centrarlo su un vetrino con il lato lavato rivolto verso l'alto.

Quindi posizionare due distanziatori PDMS spessi un millimetro lungo i bordi lunghi del vetrino coprioggetto e spostare il vetrino coprioggetto in modo che un millimetro penda dal vetrino. A questo punto, versare una quantità sufficiente di agarosio sul vetrino coprioggetto per coprirlo completamente. Quindi utilizzare un secondo vetrino per appiattire l'agarosio in uno spessore uniforme.

Preparare diversi gruppi di guide di questo tipo in parallelo. Quando l'agarosio inizia a solidificarsi, trasferire gli assemblaggi a quattro gradi Celsius. Dopo 15 minuti di raffreddamento, tagliare l'agarosio in eccesso attorno ai vetrini.

Quindi, mettere i gruppi in piastre di Petri e conservarli a quattro gradi Celsius. Dopo che le patatine sono state incubate con i batteri, immergerle in acqua ultra pura una alla volta per 10 secondi ciascuna. Quindi posiziona le patatine bagnate sui bordi su un fazzoletto fino a quando la maggior parte del liquido non è defluita.

Ora, rimuovi i batteri che non si sono depositati nei pozzetti. Taglia un pezzo di nastro adesivo della lunghezza del chip di silicio e incollalo al rivestimento di parylene sul silicone. Quindi staccare il nastro per rimuovere lo strato di parylene e prepararsi immediatamente a capovolgere il chip.

Ora, posiziona il chip su un gruppo scorrevole in modo che i micro pozzetti siano a contatto con l'agarosio. Fare molta attenzione a non spostare o spostare il truciolo una volta a contatto con l'agarosio. A questo punto, è possibile trasferire l'intero gruppo nel supporto per vetrini di una camera di controllo ambientale da palco e acquisire immagini time-lapse nelle successive 24 ore all'intervallo desiderato e con un ingrandimento inferiore a 10x.

Elabora le pile di immagini utilizzando un software convenzionale disponibile gratuitamente. Innanzitutto, importa la sequenza di immagini. Per la media, caricare la correzione o le immagini in campo scuro.

Quindi eseguire una sottrazione dello sfondo. Specificare un valore di raggio, ad esempio 135 pixel, e selezionare il paraboloide scorrevole. Quindi, rimuovere l'immagine media del campo scuro dall'immagine media del campo di illuminazione selezionando le due immagini e utilizzando l'operazione di sottrazione.

Ora, applica una correzione dell'illuminazione come segue. Impostare l'operazione su dividere, impostare i1 sull'immagine del pozzetto, impostare i2 sull'immagine di correzione, impostare k1 sulla media dell'immagine di correzione e impostare k2 su zero. Quindi fare clic su Crea nuova finestra.

Per quantificare la crescita batterica nei micro pozzetti, selezionare prima le regioni di interesse con il micro array plug-in. Nel menu della mappa, fare clic su Ripristina griglia e specificare le righe, le colonne e i diametri dei pozzetti. Quindi, dal menu della forma ROI, seleziona cerchio.

Per regolare l'array ROI sull'immagine, l'array ROI può essere spostato premendo il tasto ALT o ALT+SHIFT e selezionando la ROI in alto a sinistra con il mouse. Per ridimensionare le ROI, premere il tasto Maiusc mentre si seleziona la parte inferiore destra dell'array ROI. Per regolare la spaziatura tra le ROI, premere il tasto Maiusc mentre si trascina il lato superiore o inferiore dell'array.

Una volta che l'array ROI si adatta ai pozzetti dell'immagine, fai clic su Misura RT. Quindi verrà emessa una tabella con tutte le misurazioni per ogni immagine o punto temporale che potrà essere copiata in un foglio di calcolo per l'analisi. È stata confrontata la crescita di due ceppi di Pseudomonas aeruginosa. Un ceppo esprime costitutivamente proteine effettrici tossiche associate alle secrezioni di tipo sei.

L'altro è suscettibile alla patogenesi di tipo sei a causa della perdita di funzionalità. Entrambi esprimono una diversa proteina fluorescente. Le co-colture sono state studiate longitudinalmente e in pozzetti di diverse dimensioni.

I batteri sono stati coltivati individualmente e come co-coltura. Sono state visualizzate 20 ore di crescita a intervalli di 30 minuti. Dopo che le correzioni del software sono state eseguite sui dati di imaging, sono state tracciate le traiettorie di crescita quantitative.

Nella co-cultura, i dati non suggeriscono un cambiamento eccessivo nella crescita. Per far avanzare l'analisi, ogni traiettoria è stata adattata a una funzione logistica modificata con tre parametri, segnale massimo, velocità massima e tempo di ritardo. Questa analisi suggerisce che la co-coltura di queste specie ha avuto un effetto trascurabile sulla loro crescita complessiva e la loro variabilità osservata nelle curve di crescita è molto probabilmente dovuta a fattori ambientali.

Una volta padroneggiato, il set up può essere eseguito in poche ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante disporre di celle in crescita robusta per regolare correttamente i valori finali di OD della cella per avere strati uniformi della coclea nei gruppi di chip e prestare attenzione durante la fase di distacco del parilene. Seguendo questa procedura, domande come il modo in cui l'espressione genica all'interno di ciascuna comunità cambia in funzione della composizione e dell'organizzazione della comunità, possono essere affrontate mediante l'analisi del materiale genetico.

Non dimenticare che lavorare con Pseudomonas aeruginosa può essere potenzialmente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre utilizzate precauzioni come guanti, giacca, occhiali e tecniche asettiche adeguate.