Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all'interno di una piattaforma di array Microwell
6 giugno 2017
Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori, tra cui l'architettura ambientale, l'abbondanza dei membri, i tratti e le interazioni. Questo protocollo descrive un ambiente sintetico e microfabbricato per il monitoraggio simultaneo di migliaia di comunità contenute nei pozzetti di femtoliter, in cui si possono approssimare fattori chiave come la dimensione e il confinamento di nicchia.
L'obiettivo generale di questo metodo è l'analisi in parallelo ad alto rendimento di comunità microbiche composte da più membri in ambienti confinati, utilizzando matrici di micropozzetti in silicio. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente uno screening altamente parallelo e ad alto rendimento di interazioni microbiche finemente localizzate, rilevanti per l'industria, la medicina e l'ambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'ecologia microbica e delle scienze biomediche, come ad esempio in che modo i vincoli spaziali intrinseci a scale ridotte influenzano i parametri deterministici e stocastici dello sviluppo delle comunità e quali sono gli effetti chiave sull'abbondanza e sull'organizzazione dei membri microbici?
Iniziare preparando le matrici di micropozzetti. Per prima cosa, tagliare singole schede di matrice di micropozzetti da wafer di silicio stampati con più matrici utilizzando una riga di diamante. Ogni chip singolo contiene sottomatrici di pozzi con diametri compresi tra cinque e 100 micron a tre diverse densità di spaziatura.
Su ogni chip, il motivo completo di pozzetti è ripetuto anche quattro volte. Successivamente, preparare una camera umidificata utilizzando una scatola per punte di pipetta e un panno inumidito con PBS. Quindi applicare una goccia di 150 microlitri di soluzione di BSA su ogni chip e incubare i chip nella scatola per un'ora a temperatura ambiente.
Nel frattempo, preparare i batteri. Centrifugare una coltura e risospendere il pellet in 500 microlitri di mezzo R2A fresco contenente il due percento di glicerolo. Quindi misurare la densità della coltura a 600 nanometri e aggiustare la concentrazione a una densità ottica di 0,02.
Dopo l'incubazione del chip, rimuovere la soluzione di BSA e lavare i chip tre volte con PBS. Dopo i lavaggi, asciugare i chip con gas azoto e riposizionarli nella camera umidificata. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di sospensione culturale su ciascun chip asciutto e incubare i chip per un'ora a quattro gradi Celsius, in modo che i batteri abbiano il tempo di aderire ai pozzetti, ma la divisione cellulare di eventuali contaminanti sia lenta.
Per preparare un chip per l'analisi mediante imaging, preparare innanzitutto una lamellina ricoperta di agarosio per ogni chip. Liquefare un piccolo volume di agarosio, circa cinque millilitri sono necessari per ogni lamellina. Successivamente, lavare un lato di una lamellina con etanolo e posizionarla al centro di un vetrino con il lato lavato rivolto verso l'alto.
Quindi posizionare due distanziali in PDMS dello spessore di un millimetro lungo i bordi lunghi del vetrino e spostare il vetrino in modo che un millimetro sporga dallo slide. Ora, versare abbastanza agarosio sul vetrino da coprirlo completamente. Successivamente, utilizzare un secondo vetrino di vetro per appiattire l'agarosio fino a ottenere uno spessore uniforme.
Preparare diverse di queste preparazioni per vetrino in parallelo. Quando l'agarosio inizia a solidificare, trasferire le preparazioni a quattro gradi Celsius. Dopo 15 minuti di raffreddamento, rimuovere l'agarosio in eccesso attorno ai vetrini.
Successivamente, posizionare gli assemblaggi in piastre di Petri e conservarli a quattro gradi Celsius. Dopo che i chip sono stati incubati con i batteri, immergere i chip singolarmente in acqua ultrapura per 10 secondi ciascuno. Quindi disporre i chip bagnati verticalmente su un fazzoletto di carta fino a quando la maggior parte del liquido non si sarà drenata.
Ora, rimuovere i batteri che non si sono depositati nei pozzetti. Tagliare un pezzo di nastro della lunghezza della chip in silicio e applicarlo sul rivestimento in parilene presente sulla superficie in silicio. Successivamente, staccare il nastro per rimuovere il rivestimento in parilene e prepararsi immediatamente a capovolgere la chip.
Ora, posizionare il chip su un'unità di vetrino in modo che le micropozzette siano a contatto con l'agarosio. Fare molta attenzione a non muovere o spostare il chip una volta che è a contatto con l'agarosio. Trasferire quindi l'intero allestimento nel supporto del vetrino all'interno di una camera di controllo ambientale da tavolo e acquisire immagini in time-lapse nelle successive 24 ore all'intervallo desiderato e con un ingrandimento di 10x.
Elaborare le serie di immagini utilizzando software convenzionali e disponibili gratuitamente. Innanzitutto, importare la sequenza di immagini. Per la media, caricare le immagini di correzione o del campo scuro.
Quindi eseguire una sottrazione del fondo. Fornire un valore di raggio pari a 135 pixel e selezionare il paraboloide scorrevole. Successivamente, rimuovere l'immagine media del campo scuro dall'immagine media del campo di illuminazione selezionando le due immagini e utilizzando l'operazione di sottrazione.
Ora, applicare una correzione dell'illuminazione come segue. Impostare l'operazione su divisione, impostare i1 sull'immagine del pozzetto, impostare i2 sull'immagine di correzione, impostare k1 sulla media dell'immagine di correzione e impostare k2 a zero. Quindi fare clic su Crea nuova finestra.
Per quantificare la crescita batterica nei micropozzetti, selezionare innanzitutto le regioni di interesse utilizzando il plug-in per microarray. Nel menu della mappa, fare clic su "Reimposta griglia" e specificare righe, colonne e diametri dei pozzetti. Quindi, dal menu della forma delle ROI, selezionare cerchio.
Per adattare l'array di ROI all'immagine, è possibile spostare l'array di ROI premendo il tasto ALT o ALT+MAIUSC e selezionando con il mouse la ROI in alto a sinistra. Per ridimensionare le ROI, premere il tasto MAIUSC mentre si seleziona l'angolo in basso a destra dell'array di ROI. Per regolare la distanza tra le ROI, premere il tasto MAIUSC mentre si trascina il lato superiore o inferiore dell'array.
Una volta che l'array di ROI si adatta alle pozzette dell'immagine, fare clic su Misura RT. Verrà generata una tabella con tutte le misurazioni per ciascuna immagine o punto temporale, che potrà essere copiata in un foglio di calcolo per l'analisi. È stato confrontato l'accrescimento di due ceppi di Pseudomonas aeruginosa. Un ceppo esprime costitutivamente proteine effettrici tossiche associate alle secrezioni di tipo sei.
L'altro è suscettibile alla patogenesi di tipo sei a causa della perdita di funzione. Entrambi esprimono una proteina fluorescente diversa. Le colture miste sono state studiate longitudinalmente e in pozzetti di diverse dimensioni.
I batteri sono stati coltivati singolarmente e in co-coltura. La crescita è stata monitorata per 20 ore con intervalli di 30 minuti. Dopo aver effettuato le correzioni software sui dati di imaging, sono state tracciate traiettorie quantitative della crescita.
Nella coltura mista, i dati non indicano un cambiamento eccessivo nella crescita. Per approfondire l'analisi, ogni traiettoria è stata adattata a una funzione logistica modificata con tre parametri: segnale massimo, velocità massima e tempo di latenza. Questa analisi suggerisce che la coltura mista di queste specie ha avuto un effetto trascurabile sulla loro crescita complessiva e che la variabilità osservata nelle curve di crescita è probabilmente dovuta a fattori ambientali.
Una volta acquisita padronanza, il montaggio può essere eseguito in sole poche ore se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale disporre di cellule in crescita robusta per regolare adeguatamente i valori finali di densità ottica (OD) delle cellule, al fine di ottenere strati di auger uniformi nei dispositivi assemblati, ed è importante prestare attenzione durante il distacco del parilene. Seguendo questa procedura, domande come come varia l'espressione genica all'interno di ciascuna comunità in funzione della composizione e dell'organizzazione della comunità stessa possono essere affrontate mediante l'analisi del materiale genetico.
Non dimenticare che lavorare con Pseudomonas aeruginosa può essere potenzialmente pericoloso, e precauzioni come guanti, camice, occhiali protettivi e adeguate tecniche asettiche devono essere sempre utilizzate durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi ad alto rendimento di comunità microbiche in ambienti confinati, mediante l'uso di matrici di micropozzetti in silicio. Consente il monitoraggio di interazioni microbiche rilevanti per diversi settori, tra cui l'industria e la medicina.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ecologia Microbica
- Ricerca Biomedica
- Scienze Ambientali
Sfondo
- Le comunità microbiche sono influenzate dall'architettura ambientale e dalle interazioni tra i membri.
- Comprendere queste comunità può fornire spunti utili per questioni ecologiche e biomediche.
- I metodi ad alto rendimento sono essenziali per analizzare le interazioni complesse.
- Questo studio utilizza ambienti microfabbricati per un monitoraggio preciso.
Scopo dello studio
- Analizzare comunità microbiche composte da più membri in spazi confinati.
- Indagare come i vincoli spaziali influenzino lo sviluppo della comunità.
- Esplorare gli effetti sull'abbondanza e sull'organizzazione dei membri microbici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di matrici di micropozzetti da wafer di silicio.
- Utilizzo di matrici con pozzetti compresi tra cinque e 100 micron.
- Screening delle interazioni microbiche in modo ad alto rendimento.
- Analisi parallela della dinamica delle comunità in ambienti confinati.
Risultati principali
- Ha dimostrato la capacità di tracciare simultaneamente migliaia di comunità microbiche.
- Ha identificato le interazioni chiave influenzate dalla dimensione della nicchia e dal confinamento.
- Ha fornito informazioni sui parametri deterministici e stocastici dello sviluppo della comunità.
- Ha evidenziato l'importanza di questo metodo per applicazioni industriali e ambientali.
Conclusioni
- Questo metodo offre un approccio innovativo allo studio delle interazioni microbiche.
- Migliora la comprensione della dinamica delle comunità in ambienti confinati.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per affrontare sfide ecologiche e biomediche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Questa piattaforma a matrice di micropozzetti consente l'analisi parallela ad alto rendimento dello sviluppo di comunità microbiche in ambienti confinati, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale di scoperta mediante la quantificazione degli effetti spaziali e delle interazioni sulla crescita microbica. Il metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, rivelando come i vincoli spaziali su scala fine influenzino i parametri deterministici e stocastici della dinamica delle comunità, fornendo informazioni dirette sulla rilevanza dei biomarcatori traslazionali e dei modelli preclinici. La sua scalabilità e riproducibilità supportano i flussi di lavoro aziendali di ricerca e sviluppo nelle applicazioni di screening di bersagli antimicrobici e screening fenotipico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando come il confinamento spaziale alteri l'abbondanza e l'organizzazione dei membri microbici in sistemi di co-coltura.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli mediante il monitoraggio longitudinale di ceppi marcati con fluorescenza in ambienti micropozzetti definiti.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli misurando le traiettorie di crescita e gli effetti delle interazioni in nicchie di dimensioni controllate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive standardizzando l'inoculo microbico in matrici con diametri di pozzetti compresi tra 5 e 100 micron.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio mediante passivazione con BSA, incubazione controllata e substrati per imaging rivestiti con agarosio che riducono al minimo evaporazione e spostamenti.
- Valore di scalabilità: Consente l'analisi parallela di migliaia di comunità, favorendo il riutilizzo della piattaforma in studi su attività antimicrobica e patogenicità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega i dati sulle interazioni nella fase di scoperta alla continuità preclinica modellando come i vincoli spaziali influenzino gli esiti patogeni in colture co-abitanti di Pseudomonas aeruginosa.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Quantifica effetti trascurabili sulla crescita nella coltura mista, contribuendo a ridurre il rischio di falsi positivi nei test di validazione del bersaglio.
- Conferma predittiva: Utilizza un adattamento logistico delle curve di crescita per estrarre il segnale massimo, la velocità e il tempo di latenza nell'analisi comparativa tra ceppi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione di un composto promettente, fornendo dati quantitativi sulle interazioni che guidano le decisioni di prosecuzione o interruzione nei programmi mirati a bersagli antimicrobici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando come i vincoli spaziali influenzino i parametri di sviluppo della comunità in sistemi con più membri.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante la preparazione standardizzata di chip, l'adesione batterica a 4°C e l'acquisizione di immagini a fluorescenza in time-lapse a intervalli di 30 minuti per 20 ore.
- Analisi: Genera traiettorie quantitative di crescita attraverso la sottrazione del fondo, la correzione dell'illuminazione e la misurazione della fluorescenza basata su aree di interesse (ROI), consentendo il confronto statistico tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un collegamento con la rilevanza preclinica modellando interazioni dipendenti dal sistema di secrezione di tipo VI in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno di significativa importanza biomedica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per lo screening delle interazioni microbiche in ambiti industriali, medici e ambientali grazie alla sua elevata capacità parallela e alla precisione nell'ambiente confinato.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la quantificazione degli effetti delle interazioni microbiche in ambienti con vincoli spaziali.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante preparazione controllata del chip, marcatura fluorescente e flussi di lavoro di analisi automatica delle immagini.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'identificazione precoce dei bersagli antimicrobici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio basata su dati quantitativi di interazione ottenuti da matrici comunitarie ad alta capacità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microbiologia, microscopia a fluorescenza e software di analisi delle immagini per l'impostazione delle regioni di interesse (ROI) e le misurazioni quantitative.
- È vincolato all'infrastruttura di microfabbricazione al silicio, agli allestimenti di vetrini rivestiti con agarosio e alle camere di controllo ambientale necessarie per un'acquisizione stabile delle immagini per 24 ore.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la preparazione dei batteri, la regolazione dell'OD e le procedure di rimozione del parilene, al fine di garantire l'adesione specifica per pozzetto.
- Richiede valutazioni di adattamento qualora si voglia estendere il metodo ad altri modelli microbici oltre Pseudomonas aeruginosa, a causa delle differenze nella chimica superficiale e nella variabilità della crescita.
- I limiti pratici includono la necessità di utilizzare tecniche asettiche nella manipolazione di Pseudomonas aeruginosa e la possibile variabilità tra pozzetti nelle caratteristiche di dimensioni inferiori ai 10 micron.
