Un Materiali guidata approccio di screening per lo sviluppo di sol-gel quantitative derivate microarray di proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi materiali a base di gel soul per la fabbricazione di microarray e utilizzarli per saggi enzimatici a volume nanometrico. Ciò viene realizzato innanzitutto identificando materiali che presentino tempi di ation sufficientemente lunghi da evitare la formazione del gel all'interno del pin di stampa del microarray durante il processo di stampa. Il secondo passaggio consiste nel valutare i materiali con tempi di ation lunghi per la loro capacità di essere stampati come microarray con riproducibilità, resistenza alla formazione di crepe, qualità dell'adesione, assenza di separazione di fase indesiderata e, in definitiva, elevata attività per gli enzimi intrappolati.

Successivamente, l'enzima di interesse viene stampato come microarray utilizzando i materiali ottimali e ne viene testata la capacità di sovrapporre la soluzione del saggio e generare una risposta enzimatica misurabile. L'ultimo passaggio consiste nel valutare i materiali per la loro capacità di fornire saggi altamente riproducibili utilizzando l'enzima di interesse e generare dati quantitativi. Il materiale finale per la fabbricazione dell'array viene quindi scelto.

In definitiva, le microarray di proteine derivate da gel soul vengono utilizzate per identificare piccole molecole che riducono l'attività enzimatica. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come lo screening basato su piastre, è che consente di analizzare un elevato numero di materiali in modo sistematico e molto rapido, utilizzando volumi ridotti di reagenti. Generalmente, le persone nuove rispetto a questa tecnica incontrano difficoltà perché è possibile che i materiali formino un gel all'interno dei pin di stampa.

Se questi non vengono puliti correttamente, si rischiano aree mancanti che possono essere interpretate come materiali non stampabili. Per iniziare, preparare le diverse soluzioni additive come descritto nel protocollo testuale allegato. Molte delle soluzioni possono essere preparate in anticipo e conservate per un mese o più, nelle condizioni corrette, ma alcune devono essere preparate il giorno stesso dell'esperimento.

Mescolare immediatamente prima dell'uso le seghe a base di silicato di sodio e assicurarsi di mantenerle sul ghiaccio. Il SOS deve essere utilizzato entro un'ora dall'aggiunta dell'acqua, poiché periodi di attesa più lunghi provocano tempi di DATION ridotti e non costanti. Successivamente, preparare diverse combinazioni di tamponi, polimeri salans e lane organiche come indicato nel protocollo testuale allegato, al fine di identificare quali combinazioni possono essere utilizzate come materiale stampabile con tempi di dilatazione superiori a 2,5 ore.

Dopo aver identificato diverse combinazioni, impostare l'umidità all'interno della camera di stampa tra l'80 e il 90%. Un'umidità inferiore all'80% potrebbe causare l'evaporazione del campione e incongruenze nella stampa a causa dei piccoli volumi depositati con la stampante. Ora che tutto è pronto, organizzare i modelli di matrice da stampare utilizzando il programma Chip Writer Pro. Impostare la velocità di spostamento nelle direzioni XY a 10 millimetri al secondo e la velocità di avvicinamento del campione nella direzione Z a due millimetri al secondo, con un tempo di caricamento del campione di 2,5 secondi, utilizzando le combinazioni di gel ottenute in precedenza.

Preparare 25 microlitri di materiali di base combinando i polimeri corrispondenti, gli organo lanes e gli additivi a molecola piccola identificati attraverso il processo di prescreening. Utilizzare mucchi da 50 millimolari con un pH di 8,0 in pozzetti separati di una piastra microtitolatrice da 384 pozzetti. Successivamente, sottoporre a sonica fino a quattro perni a guaina scanalati di diametro 100 micron in acqua bidistillata.

Dopo 15 minuti, provateli sotto un flusso di azoto. Successivamente, utilizzate un pulisciconnettori per rimuovere l'umidità residua all'interno del supporto del perno ed inserite con attenzione il perno nella testina di stampa del robot per la stampa con perni a contatto. La mancata rimozione dell'umidità residua potrebbe impedire al perno di muoversi liberamente all'interno del supporto, causando punti mancanti.

Quindi aggiungere 25 microlitri del rispettivo SA nel pozzetto immediatamente prima della stampa. Mescolare la soluzione eseguendo un movimento su e giù con la pipetta, ripetuto 50 volte durante il mescolamento con la pipetta. Minimizzare la quantità di aria incorporata nella soluzione.

Le bolle d'aria impediscono il caricamento completo del campione all'interno del pin. Successivamente, caricare il pin abbassandolo nel campione. Una volta caricati i pin, iniziare il processo di stampa e stampare il campione su una superficie del vetrino.

Interrompere il processo di stampa prima di aggiungere il sale alla successiva piastra sorgente. Con il processo in pausa, rimuovere il perno di stampa utilizzando un magnete e inserire un bastoncino pulitore nella testina di stampa per prevenire l'accumulo di umidità. Quindi risciacquare il perno di stampa con acqua bidistillata e sottoporlo a sonificazione in acqua bidistillata pulita per 30 secondi.

Successivamente, asciugare il pin di stampa sotto un flusso di azoto e quindi reinserire il pin nella testina di stampa. Continuare a mescolare, stampare e pulire per tutti i campioni rimanenti nella piastra di origine; fino a 12.000 spot, di diametro di 100 micron, possono essere depositati su un singolo vetrino. Al termine della stampa, lasciare invecchiare l'array per un minimo di 30 minuti e fino a 24 ore all'interno della camera di stampa, a un'umidità del 80-90%.

Preparare 50 microlitri del controllo positivo appena prima dell'uso, combinando 25 microlitri di ioduro di acetilcolina uno millimolare, 0,14 microlitri di bodi pi, FIL cisteina cinque millimolare e tris 25 millimolare a pH 7,0 con il 4% di glicerolo in una pozzetta di una piastra microtitolatrice da 384 pozzetti; pipettare lentamente la soluzione su e giù per mescolare senza creare bolle. Successivamente, preparare i controlli negativi appena prima dell'uso, aggiungendo 0,14 microlitri di boai PI FIL cisteina cinque millimolare a 49,86 microlitri di tris 25 millimolare a pH 7,0 con il 4% di glicerolo in un'altra pozzetta di una piastra microtitolatrice da 384 pozzetti e mescolare delicatamente. Stampare i controlli sui microarray invecchiati utilizzando gli stessi procedimenti descritti nella sezione precedente. Tuttavia, invece di utilizzare puntine con diametro di 100 micron, usare puntine scanalate con diametro di 235 micron.

Questo garantisce che le soluzioni ricoprano completamente le gocce precedentemente depositate. Le gocce invecchiano gli array in un'umidità del 80-90% per un'ora a temperatura ambiente a causa dell'idrolisi autonoma dell'acetilcolina. Tempi di incubazione più lunghi possono provocare falsi positivi a causa dell'aumentata attività enzimatica.

Assicurarsi che l'imager alpha innotech novo array sia acceso e dotato di un filtro di eccitazione a 478 più o meno 17 nanometri e di un filtro di emissione a 538 più o meno 21 nanometri per la misurazione dei microarray di acetilcolinesterasi. Successivamente, inserire il vetrino nel portavetrino con le macchie rivolte verso l'alto. Impostare il numero di sezioni di anteprima in modo che almeno una su ciascun lato del vetrino del microscopio venga visualizzata con una risoluzione minima di quattro micrometri utilizzando l'esposizione automatica.

Dopo aver verificato che i parametri siano accettabili, acquisire un'immagine del vetrino e salvarla come file TIFF. Successivamente, aprire l'immagine del vetrino acquisita in ImageJ 64. Fare clic sullo strumento di selezione ellittica e selezionare ciascun spot.

Selezionare una regione leggermente più grande del punto osservato e assicurarsi di utilizzare una dimensione costante tra i punti per ridurre la soggettività di ImageJ. Quindi misurare l'intensità del segnale di ciascun punto utilizzando l'opzione di misura sotto la scheda Analyze. Calcolare la media dell'intensità di 25 punti di controllo positivo simili e dividere tale valore per la media dell'intensità di 25 punti di controllo negativo simili, ottenendo così i rapporti tra controllo positivo e controllo negativo per le singole composizioni del materiale.

Qui viene mostrato un esempio della dinamica di risposta dei microarray ottenuti utilizzando questi metodi. I controlli ad alta concentrazione hanno prodotto aree di colore verde brillante, mentre i controlli a bassa concentrazione hanno generato segnali molto più deboli. L'intensità misurata mediante Image J 64 mostra che i controlli ad alta concentrazione presentano una media di circa 22.000 unità fluorescenti relative, mentre i controlli a bassa concentrazione si attestano intorno a 8.000.

Le linee tratteggiate rappresentano tre deviazioni standard dalla media. Di seguito sono mostrati esempi di microarray per un'analisi in array di screening di analoghi sintetici degli alcaloidi ameral sier identificati come composto uno e composto due. Entrambi gli assi rappresentano la percentuale di enzima determinata tramite il segnale fluorescente.

In duplicato, la vicinanza dei punti alla diagonale rappresenta un'elevata riproducibilità del saggio. Qui vengono mostrati i grafici di IC50 di due diversi inibitori potenziali. Il composto uno ha prodotto un valore di IC50 di 16 micromolare, mentre l'IC50 del composto due era di 21 micromolare. Sopra sono mostrati punti rappresentativi per illustrare le differenze nel segnale proporzionali alle concentrazioni degli inibitori.

L'array mostrato qui è stato stampato con quattro chinasi diverse: chinasi p38 MAP, EGFR e GSK, ed è stato sovra stampato con tampone senza aggiunte, tampone contenente ATP e tampone contenente ATP e staurosporina, un inibitore dell'attività enzimatica. I risultati mostrano un effetto significativo dell'inibitore della chinasi staurosporina, basato sulle intensità di fluorescenza risultanti, come descritto qui. La differenza maggiore osservata alla concentrazione di staurosporina utilizzata in questo caso è stata nei punti relativi alla p38.

Qui sono mostrati punti rappresentativi di un microarray BP P 30 alle 8:00, sovraspotati con concentrazioni variabili di stor sporin. Come indicato, la IC 50 di questa molecola è stata determinata essere di un micromolare ed è mostrata nel grafico a destra Una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in poche ore se viene effettuata correttamente Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come saggi immunologici o saggi di interazione proteica, possono essere eseguiti anche per rispondere a domande aggiuntive relative alla diagnostica o alla scoperta di piccole molecole.