Un Materiali guidata approccio di screening per lo sviluppo di sol-gel quantitative derivate microarray di proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi materiali a base di gel per l'anima per la fabbricazione di microarray e utilizzarli per saggi enzimatici di volume nanometrico. Ciò si ottiene identificando prima i materiali che hanno tempi di azione sufficientemente lunghi da evitare la gelificazione nel pin di stampa del microarray durante il processo di stampa. Il secondo passo consiste nel valutare i materiali con lunghi tempi di azione per la loro capacità di stampare come microarray, riproducibilità, resistenza alla fessurazione, qualità dell'adesione, separazione di fase indesiderata e, in ultima analisi, elevata attività per gli enzimi intrappolati.

Successivamente, l'enzima di interesse viene stampato come microarray utilizzando i materiali ottimali e viene testata la sua capacità di sovraindividuare la soluzione del saggio e generare una risposta enzimatica misurabile. La fase finale consiste nel valutare la capacità dei materiali di fornire saggi altamente riproducibili utilizzando l'enzima di interesse e generare dati quantitativi. Viene quindi scelto il materiale finale per la fabbricazione dell'array.

In definitiva, i microarray proteici derivati dal gel dell'anima vengono utilizzati per identificare piccole molecole che riducono l'attività enzimatica. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come lo screening su piastra, è che è possibile vagliare un gran numero di materiali in modo sistematico molto rapidamente utilizzando bassi volumi di reagenti. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché è possibile avere materiali gel all'interno dei perni di stampa.

Se questi vengono poi puliti correttamente, si tradurranno in punti mancanti che possono essere interpretati come materiali non stampabili. Per iniziare, preparare le numerose soluzioni additive come descritto nel protocollo di testo allegato. Molte delle soluzioni possono essere preconfezionate e conservate fino a un mese o più nelle condizioni corrette, ma alcune devono essere preparate il giorno dell'esperimento.

Mescolare le seghe a base di silicato di sodio immediatamente prima dell'uso e assicurarsi di tenerle sul ghiaccio. L'SOS deve essere utilizzato entro un'ora dall'aggiunta dell'acqua, poiché periodi di attesa più lunghi comportano tempi di dazione ridotti e incoerenti. Successivamente, preparare varie combinazioni di tamponi, polimeri di salan e corsie degli organi come indicato nel protocollo di testo allegato al fine di identificare quali combinazioni possono essere utilizzate come materiale stampabile con tempi di dilatazione superiori a 2,5 ore.

Una volta identificate diverse combinazioni, impostare l'umidità all'interno della camera di stampa su un valore compreso tra l'80 e il 90%, un'umidità inferiore all'80% può causare l'evaporazione del campione e incongruenze nella stampa a causa dei piccoli volumi di deposizione con la stampante. Ora pronto, predisporre i modelli di array da stampare utilizzando il programma Chip Writer Pro. Impostare la corsa in direzione XY su 10 millimetri al secondo e la velocità di avvicinamento del campione in direzione Z a due millimetri al secondo con il tempo di caricamento del campione di 2,5 secondi utilizzando le combinazioni di gel per sega identificate in precedenza.

Preparare 25 microlitri di materiali di base combinando i polimeri corrispondenti, le corsie organiche e gli additivi a piccole molecole identificati attraverso il processo di prescreening. Utilizzando cumuli da 50 millimolari con un pH di 8,0 in pozzetti individuali di una piastra per microtitolazione da 384 pozzetti. Quindi sonicare fino a quattro pin di guaina scanalati di 100 micron di diametro in doppia acqua distillata.

Dopo 15 minuti, provali sotto un getto di azoto. Quindi, utilizzare uno scovolino per rimuovere l'umidità residua dall'interno del supporto del perno e posizionare con cura il perno nella testina di stampa del robot di stampa del perno di contatto. La mancata rimozione dell'umidità residua può impedire al perno di muoversi liberamente con il supporto, con conseguente perdita di punti.

Quindi aggiungere 25 microlitri del rispettivo SA al pozzetto appena prima della stampa. Miscelare la soluzione con un movimento di pipettaggio su e giù Ripetuto 50 volte durante la miscelazione con la pipetta. Ridurre al minimo la quantità di aria incorporata nella soluzione.

Le bolle d'aria impediscono il caricamento completo del campione all'interno del perno. Quindi, caricare il perno abbassandolo nel campione. Una volta caricati i perni, iniziare il processo di stampa e stampare il campione su una superficie del vetrino.

Mettere in pausa il processo di stampa prima di aggiungere sale alla successiva lastra di partenza. Bene, con il processo in pausa, rimuovi il perno di stampa usando un magnete e posiziona uno scovolino nella testina di stampa per evitare l'accumulo di umidità nella testina di stampa. Quindi sciacquare il perno di stampa con acqua distillata doppia e sonicarlo in acqua distillata doppia pulita per 30 secondi.

Quindi, asciugare lo spillo di stampa sotto un getto di azoto e quindi riposizionare lo spillo nella testina di stampa. Continuare a mescolare, stampare e pulire tutti i campioni rimasti all'interno della lastra di origine fino a 12.000 punti, 100 micron di diametro possono essere depositati su un singolo vetrino. Una volta terminata la stampa, invecchiare l'array per un minimo di 30 minuti e fino a 24 ore all'interno della camera di stampa all'80-90% di umidità.

Preparare 50 microlitri di controllo positivo appena prima dell'uso combinando 25 microlitri di un millimolare, ioduro di acetilcolina e 0,14 microlitri di cinque millimolari di bodi pi greco, cisteina FIL e tris 25 millimolari a pH 7,0 con il 4% di glicerolo nel pozzetto di una piastra per microtitolazione da 384 pozzetti, pipettare la soluzione su e giù lentamente per mescolare senza creare bolle. Successivamente, preparare i controlli negativi appena prima dell'uso combinando 0,14 microlitri di cisteina PI FIL da cinque millimolari a 49,86 microlitri di triss da 25 millimolari a pH 7,0 con il 4% di glicerolo in un altro pozzetto di una piastra di microtitter da 384 pozzetti e mescolarli delicatamente sopra i controlli sui microarray invecchiati utilizzando gli stessi processi descritti nella sezione precedente. Tuttavia, invece dei perni di 100 micron di diametro, hai scanalato i perni principali con un diametro di 235 micron.

Ciò garantisce che le soluzioni coprano completamente i punti precedentemente depositati. Gli spot invecchiano gli array con un'umidità compresa tra l'80 e il 90% per un'ora a temperatura ambiente a causa dell'autoidrolisi dell'acetilcolina. Tempi di incubazione più lunghi possono causare falsi positivi a causa dell'aumento dell'attività enzimatica.

Assicurarsi che l'imager alpha innotech novo array sia acceso e dotato di un filtro di emissione a 478 più o meno 17 nanometri e 538 più o meno 21 nanometri per la misurazione dei microarray di acetilcolina esterasi. Quindi posizionare il vetrino nel supporto del carrello con i punti rivolti verso l'alto. Impostare il numero di sezioni di anteprima in modo che almeno una su entrambi i lati del vetrino del microscopio venga visualizzata in anteprima con una risoluzione minima di quattro micrometri utilizzando l'esposizione automatica.

Una volta che i parametri sono ritenuti accettabili, acquisire un'immagine della diapositiva e salvarla come file TIFF. Quindi, aprire l'immagine della diapositiva acquisita nell'immagine J 64. Fai clic sullo strumento Selezione ovale e seleziona ciascun punto.

Selezionare una regione leggermente più grande del punto osservato e assicurarsi di utilizzare una dimensione coerente tra i punti per ridurre la soggettività dell'immagine J.Quindi misurare l'intensità del segnale di ciascun punto utilizzando l'opzione di misurazione. Nella scheda Analizza. Fare la media dell'intensità di 25 punti di controllo positivi simili e dividere per l'intensità media di 25 punti di controllo negativi simili per ottenere rapporti di controllo positivo/controllo negativo per le singole composizioni di materiali.

Di seguito è mostrato un esempio della gamma dinamica dei microarray risultanti preparati utilizzando questi metodi. I controlli alti hanno portato a regioni di colore verde brillante, mentre i controlli bassi hanno portato a punti molto più scuri. L'intensità misurata dall'immagine J 64 mostra che i controlli alti hanno una media di circa 22.000 unità fluorescenti relative, e i controlli bassi sono stati in media vicini a 8.000.

Le linee tratteggiate rappresentano tre deviazioni standard dalla media. Ecco alcuni esempi di microarray per uno screening con array d'onore di analoghi sintetici di alcaloidi di sier amerali identificati come composto uno e composto due. Entrambi gli assi rappresentano la percentuale di enzima determinata dal segnale fluorescente.

In duplicato, la vicinanza dei punti alla diagonale rappresenta un'elevata riproducibilità del saggio. I grafici IC 50 di due diversi potenziali inibitori sono mostrati qui. Il composto uno ha portato a un livello di IC 50 di 16 micromolari, mentre l'IC 50 del composto due era di 21 micromolari Macchie rappresentative sono mostrate sopra per illustrare le differenze nel segnale proporzionale alle concentrazioni dell'inibitore.

L'array mostrato qui è stato stampato con quattro diverse chinasi, P 38 map chinasi, EGFR e GSK, ed è stato sovrastampato con tampone contenente solo tampone contenente A TP e tampone contenente A TP e sporina starro un inibitore dell'attività enzimatica. I risultati mostrano un effetto significativo dell'inibitore della chinasi starro sporina in base alle intensità di fluorescenza risultanti, come descritto qui. La differenza maggiore osservata alla concentrazione di sporina di stor utilizzata qui è stata rispetto alle macchie P 38.

Qui, sono mostrati spot rappresentativi di un microarray BP P 30 8:00 AM, che sono stati sovramacchiati con concentrazioni variabili di sporina stor. Come indicato, l'IC 50 di questa molecola è stato determinato essere un micromolare ed è mostrato nel grafico a destra Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come i saggi immunologici o i saggi di interazione proteica, possono essere eseguiti anche per rispondere a ulteriori domande relative alla diagnostica o alla scoperta di piccole molecole.