Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente complessi proteici da cellule di mammifero. Questo viene ottenuto innanzitutto trasfettando le cellule con un costrutto di fusione contenente un'etichetta halo per esprimere la proteina di interesse. Il secondo passaggio consiste nel trattare le cellule e catturare covalentemente i complessi proteici su una resina tramite l'etichetta halo.

Successivamente, i complessi proteici sulla resina vengono lavati delicatamente per rimuovere eventuali interazioni non specifiche. L'ultimo passaggio consiste nell'eluire i complessi proteici dalla resina. In definitiva, i saggi di pull-down con il marcatore halo vengono utilizzati per isolare e scoprire nuove interazioni proteiche nei sistemi mammiferi.

I metodi che vi mostreremo oggi possono consentire scoperte fondamentali nel campo della proteomica funzionale, inclusa l'identificazione di nuove interazioni proteiche e la determinazione della localizzazione delle proteine all'interno delle cellule. A eseguire queste procedure oggi sono due dei nostri scienziati senior, Jackie Mendez e Alen Beek. Per prima cosa, preparare per ogni fusione o controllo una piastra da 15 centimetri con 30 millilitri di cellule a una concentrazione di tre-quattro volte 10 alla quinta cellule per millilitro, ovvero da uno a 1,2 volte 10 alla settima cellule totali per costrutto.

Incubare le cellule da 18 a 24 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Al termine dell'incubazione, trasfettare il costrutto con il reagente di trasfezione desiderato. Dopo 24-48 ore dalla trasfezione, rimuovere il mezzo e lavare delicatamente lo strato cellulare con 20-25 millilitri di PBS freddo di ghiaccio, rimuovere il lavaggio con PBS e aggiungere 25-30 millilitri di PBS raffreddato a quattro gradi Celsius.

Successivamente, raschiare delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un raschietto per cellule. Una volta raccolte le cellule in provette coniche, centrifugare i campioni da cinque a dieci minuti a 2000 ×g e a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato il soprannatante, conservare i pellet cellulari a ottanta gradi sotto zero per un minimo di 30 minuti o un massimo di sei mesi.

Per ogni campione di fusione o controllo, preparare 18 millilitri di tampone di equilibrazione della resina. Mescolare delicatamente la resina capovolgendo la provetta per ottenere una sospensione uniforme. Per ogni esperimento di pull-down, distribuire 200 microlitri di resina in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro.

Centrifugare il campione per un minuto a 800 volte G. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare la resina sul fondo del tubo. Una volta scartato il soprannatante, aggiungere 800 microlitri di tampone di equilibrazione della resina al campione e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo diverse volte. Dopo.

Centrifugare il campione per due minuti a 800 volte. G. Rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante. Ripetere i passaggi precedenti altre due volte per un totale di tre lavaggi.

Dopo aver scongelato i pellet cellulari, sospendeteli in 300 microlitri di buffer di lisi per mammiferi precedentemente preparato, aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Trasferire quindi in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere sei microlitri di cocktail inibitore delle proteasi 50 x.

In seguito, aggiungere tre microlitri di RQ1 DNase e capovolgere il campione per 10 minuti. Lisare le cellule a temperatura ambiente passando il campione da cinque a 10 volte attraverso un ago da siringa di 25 o 27 gauge. Dopo aver centrifugato il campione a 14.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il lisato limpido in un nuovo tubo e porlo sul ghiaccio.

Successivamente, aggiungere ulteriori 700 microlitri del buffer 1X TBS precedentemente preparato al lisato chiarificato e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con una pipetta. Rimuovere gli ultimi lavaggi dai tubi contenenti la resina equilibrata precedentemente preparata, senza disturbare la resina sul fondo di ciascun tubo. Quindi aggiungere un millilitro del lisato diluito a ciascun tubo.

Incubare i campioni con agitazione su un rotatore per provette per 15 minuti a 22 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare le provette con resina per due minuti a 800 × g. Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere un millilitro di tampone di equilibrazione della resina e mescolare accuratamente capovolgendo manualmente ogni provetta con resina diverse volte, seguito da una centrifugazione delle provette con resina per due minuti a 800 × g. Eliminare i lavaggi una volta che i passaggi precedenti e di lavaggio siano stati ripetuti tre volte.

Aggiungere un millilitro di tampone di equilibrazione della resina ai tubi dopo aver incubato i campioni a 22 gradi Celsius per cinque minuti con rotazione costante, centrifugare i tubi della resina per due minuti a 800 ×g e scartare i lavaggi. A questo punto, risospendere la resina di ciascun campione in 50 microlitri di tampone di eluizione SDS. Agitare i tubi a temperatura ambiente con un agitatore automatico per microcentrifuga per 30 minuti.

Dopo la centrifugazione per due minuti a 800 volte G, trasferire gli EIT in nuovi tubi per l'analisi. Per la western blot o la colorazione argentica, caricare da cinque a 10 microlitri dei campioni su un gel denaturante SDS per spettrometria di massa. Conservare 40 microlitri di ciascun campione a meno 20 gradi Celsius per analisi future. In una piastra con otto camere di vetro coprioggetti per ogni proteina di fusione o piastra controllo, aggiungere 400 microlitri di cellule HELOC nel relativo mezzo in ciascun pozzetto a una densità da uno a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro.

Dopo aver incubato le cellule per 18-24 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2, trasfettarle con il reagente di trasfezione desiderato; dopo 18-24 ore dalla trasfezione, diluire il ligando TMR di uno a 200 nel mezzo cellulare appropriato. Quindi aggiungere 100 microlitri di questa soluzione in ogni pozzetto e mescolare delicatamente. Successivamente, incubare le cellule trasfettate contenenti il ligando per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2.

Al termine, aspirare il mezzo contenente il ligando e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo appropriato privo del ligando del tag di fusione proteica, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo aver ripetuto il passaggio precedente due volte, per un totale di tre lavaggi, reinserire le cellule nell'incubatore per 30 minuti.

Dopo l'incubazione di 30 minuti, aspirare il mezzo e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo appropriato, precedentemente riscaldato a 37 gradi Celsius. Successivamente, osservare le cellule al microscopio utilizzando i parametri di acquisizione appropriati secondo il protocollo halo, BRD quattro e controllo dell'espressione del tag halo. L'espressione della proteina di fusione può inoltre essere rilevata mediante immunoblotting con anticorpi anti-tag halo o con anticorpi specifici per la proteina esca.

Le gel di colorazione argentica di repliche biologiche dei saggi di pull-down di Halo BRD4 e dei controlli dimostrano un'elevata riproducibilità e mostrano le proteine che interagiscono con la proteina BRD4. L'alta abbondanza di componenti del complesso P-TEFb CDK9 e ciclina T, nonché della proteina BRD9, conferma l'isolamento specifico dei complessi di BRD4. Le gel hanno rivelato altre proteine identificate come possibili interattori di BRD4.

Come ulteriore esempio, sono state eseguite isolamenti complessi con la proteina Halo HD one. In questo caso, la proteasi TEV è stata utilizzata per scindere una regione di collegamento tra il marcatore Halo e H DAC one, liberando notevoli quantità della proteina bersaglio HD one. Come osservato.

I campioni di pulldown di HD uno hanno mostrato livelli elevati di attività di HD uno, che è stata inibita dall'inibitore HDA saha. Per dimostrare ulteriormente la specificità, non è stato osservato alcun inibizione HDA con l'inibitore della famiglia delle sirtuine EX 5 27 e nessun segnale è stato rilevato utilizzando solo il buffer. Le cellule He A trasfettate con Halo BRD quattro e Halo HDAC uno sono state marcate fluorescentemente con TMR.

L'immagine del ligando ha mostrato che entrambi sono localizzati nel nucleo e dimostra che il marcatore non ha alterato la localizzazione cellulare fisiologica dei suoi partner di fusione. Pertanto, seguendo questa procedura, le proteine isolate e i loro partner interagenti possono essere identificati e ulteriormente analizzati mediante una varietà di metodi analitici come la spettrometria di massa e il western blotting.