Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente complessi proteici da cellule di mammifero. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule con un costrutto di fusione di tag halo per esprimere la proteina di interesse. Il secondo passo consiste nel tagliare le cellule e catturare in modo covalente i complessi proteici sulla resina tramite halo tag.

Successivamente, i complessi proteici sulla resina vengono lavati delicatamente per rimuovere eventuali interazioni non specifiche. Il passaggio finale consiste nell'eluire i complessi proteici dalla resina. In definitiva, i pull down dell'halo tag vengono utilizzati per isolare e scoprire nuove interazioni proteiche dai sistemi dei mammiferi.

I metodi che vi mostreremo qui oggi possono consentire scoperte chiave nell'area della proteomica funzionale, tra cui l'identificazione di nuove interazioni proteiche e la determinazione della localizzazione proteica all'interno delle cellule. A eseguire queste procedure oggi sono due dei nostri scienziati senior, Jackie Mendez e Alen Beek. Per prima cosa, per ogni fusione o controllo, preparare un piatto da 15 centimetri con 30 millilitri di cellule a tre o quattro volte da 10 a 5 cellule per millilitro, o da una a 1,2 volte 10 per il totale di sette cellule per costrutto.

Incubare le cellule per 18-24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, trasfettare il costrutto con il reagente di trasfezione desiderato. Dopo 24-48 ore, dopo la trasfezione, rimuovere il terreno e lavare delicatamente lo strato cellulare con 20-25 millilitri di PBS ghiacciato, rimuovere il lavaggio PBS e aggiungere 25-30 millilitri di PBS freddo a quattro gradi Celsius.

Successivamente, raschiare delicatamente le cellule dal piatto con un raschietto per cellule. Una volta che le cellule sono state raccolte in provette coniche, centrifugare i campioni per 5-10 minuti a 2000 volte G e quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, posizionare i pellet cellulari a meno 80 gradi Celsius per un minimo di 30 minuti o un massimo di sei mesi.

Per ogni campione di fusione o di controllo, preparare 18 millilitri di tampone di lavaggio per l'equilibratura della resina. Mescolare delicatamente la resina capovolgendo la fiala per ottenere una sospensione uniforme. Per ogni esperimento di pull down, erogare 200 microlitri di resina in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare il campione per un minuto a 800 volte G.Dopo la centrifugazione. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare la resina sul fondo del tubo. Una volta scartato il surnatante, aggiungere 800 microlitri di tampone di lavaggio per l'equilibratura della resina al campione e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta più volte. Dopo.

Centrifugare il campione per due minuti a 800 volte. G.Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante. Ripetere i passaggi precedenti altre due volte per un totale di tre lavaggi.

Dopo aver scongelato i pellet cellulari, sospenderli in 300 microlitri di lisi di mammifero precedentemente preparata. Tamponare pipettando su e giù. Quindi trasferire in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere sei microlitri di cocktail di 50 inibitori della proteasi.

Successivamente, aggiungere tre microlitri di DNA RQ one e capovolgere il campione per 10 minuti. A temperatura ambiente posare le cellule facendo passare il campione da cinque a 10 volte attraverso un ago siringa da 25 o 27 gauge. Una volta che il campione è stato centrifugato a 14.000 volte, G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il lisato chiaro in una nuova provetta e metterlo sul ghiaccio.

Successivamente, aggiungere altri 700 microlitri di un tampone XTBS precedentemente preparato al lisato limpido e mescolare bene pipettando su e giù. Rimuovere i lavaggi finali dai tubi di resina bilanciata precedentemente preparati senza disturbare la resina sul fondo di ciascun tubo. Quindi aggiungere un millilitro di lisato diluito a ciascuna provetta.

Incubare i campioni con miscelazione su un rotatore di provette per 15 minuti a 22 gradi Celsius. Dopo questa centrifuga, le provette di resina per due minuti a 800 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio per l'equilibrio della resina e mescolare accuratamente capovolgendo ciascuna provetta di resina a mano più volte dopo la centrifugazione delle provette di resina per due minuti a 800 volte. G.Eliminare i lavaggi una volta precedenti e le fasi di lavaggio sono state ripetute tre volte.

Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio per l'equilibratura della resina alle provette dopo aver incubato i campioni a 22 gradi Celsius per cinque minuti con rotazione costante, centrifugare le provette di resina per due minuti a 800 volte G ed eliminare i lavaggi. A questo punto, sospendere la resina da ogni campione in 50 microlitri di tampone di eluizione SDS. Agitare le provette a temperatura ambiente con un agitatore automatico per provette da microcentrifuga per 30 minuti.

Dopo la centrifugazione per due minuti a 800 volte G.Trasferire gli EIT in provette fresche per l'analisi Per il western blot o il gel colorante d'argento, caricare da cinque a 10 microlitri di campioni su un gel denaturante SDS per la spettrometria di massa. Conservare 40 microlitri di ciascun campione a meno 20 gradi Celsius per analisi future. In un vetro di copertura a otto pozzetti per ogni proteina di fusione o piastra di controllo, 400 microlitri di cellule HELOC nei loro terreni appropriati in ciascun pozzetto a una densità di una o due volte 10 per la quinta cellula per millilitro.

Dopo aver incubato le cellule per 18-24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, trasfettarle con il reagente di trasfezione desiderato dopo 18-24 ore, diluire il ligando TMR da uno a 200 post-trasfezione nel mezzo cellulare appropriato. Quindi aggiungere 100 microlitri di questa soluzione a ciascun pozzetto e mescolare delicatamente. Successivamente, incubare le cellule trasfettate contenenti il ligando per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Al termine, aspirare il terreno contenente il ligando e sostituirlo con 500 microlitri del terreno appropriato privo di legante per la fusione delle proteine, che è stato preavvertito a 37 gradi Celsius. Una volta ripetuto il passaggio precedente due volte per un totale di tre lavaggi. Rimettere le cellule nell'incubatore per 30 minuti.

Dopo 30 minuti di incubazione, aspirare il terreno e sostituirlo con 500 microlitri di terreno appropriato, che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius. Seguendo questa immagine, si osservano le cellule su un microscopio utilizzando i parametri di acquisizione appropriati utilizzando l'espressione del protocollo halo, BRD four e halo tag control. L'espressione della proteina di fusione può essere rilevata anche utilizzando Western blot con anticorpi anti halo tag o anticorpi contro la proteina esca.

I gel di colorazione d'argento delle repliche biologiche di Halo BRD four e i pulldown di controllo dimostrano un'elevata riproducibilità e mostrano proteine che interagiscono con la proteina BRD four. L'elevata abbondanza di componenti del PTF B, CDK nine e della ciclina T, nonché della proteina BRD nine, conferma la cattura specifica dei complessi BRD four. I gel hanno mostrato altre proteine identificate come potenziali interattori della BRD quattro.

Come ulteriore esempio, sono stati eseguiti isolamenti complessi con la proteina Halo HD one. In questo caso, la proteasi TEV è stata utilizzata per scindere una regione linker tra il tag Halo e l'H DAC uno, rilasciando quantità significative della proteina esca HD one. Come osservato.

I campioni di pulldown di HD 1 hanno mostrato alti livelli di attività di HD 1, che è stata inibita dall'inibitore dell'HDA saha. Per dimostrare ulteriormente la specificità, non è stata osservata alcuna inibizione dell'HDA con l'inibitore della famiglia delle sirtuine EX 5 27 e non è stato rilevato alcun segnale utilizzando il solo tampone. Le cellule He A trasfettate con Halo BRD quattro e Halo HDAC una sono state marcate in fluorescenza con TMR.

L'imaging del ligando ha dimostrato che entrambi sono localizzati nel nucleo e dimostrano che il tag non altera la localizzazione cellulare fisiologica dei suoi partner di fusione. Quindi, seguendo questa procedura, le proteine isolate e i loro partner interagenti possono essere identificati e ulteriormente analizzati utilizzando una varietà di metodi analitici come la spettrometria di massa e il western blotting.